Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Çift Renkli Zaman-kapılı Uyarılmış Emisyon tükenmesi (STED) Nanoscopy tarafından İmmünoloji Synapse görselleştirme

Published: March 24, 2014 doi: 10.3791/51100
Automatic Translation
1, 1
1Center for Human Immunobiology, Texas Children's Hospital and Baylor College of Medicine

Abstract

Doğal katil hücreler veya viral yönden enfekte tümörijenik hücrelerin lize etmek için sıkı bir şekilde düzenlenmiştir, ince ayarlı bir immünolojik sinaps (IS) oluşturur. Dinamik aktin tadilatı NK hücrelerin fonksiyonu ve IS oluşumu için çok önemlidir. Sinaps F-aktin Görüntüleme geleneksel ancak ışık kırılma sınır yaklaşık 200 nm, konfokal de dahil olmak üzere, flüoresan mikroskopi çözünürlüğünü sınırlandırır, konfokal mikroskopi kullanmıştır. Görüntüleme teknolojisindeki son gelişmeler subdiffraction sınırlı süper çözünürlük görüntüleme gelişmesini sağlamıştır. IS F-aktin mimarisi görselleştirmek için cam üzerinde reseptörü aktive NK hücreleri kalarak NK hücre sitotoksik sinaps özetlemek. Biz daha sonra iki-renkli uyarılmış emisyon tükenmesi mikroskobu (STED'in) kullanarak ilgi görüntü proteinleri. Bu, sinaps <80 nm çözünürlükte sonuçlanır. Bu yazıda numune hazırlama ve çift col kullanarak görüntüleri edinimi adımları açıklarveya NK F-aktin görselleştirmek STED'in nanoscopy IS. Biz de Leica SP8 yazılım ve zaman-kapılı STED'in kullanarak örnek edinme optimizasyonu göstermektedir. Son olarak, görüntülerin post-processing deconvolution için Huygens yazılımı kullanmak.

Introduction

Immünolojik sinaps proteinleri ve hücre iskeleti elemanları sinyalizasyon karmaşık bir ortam olduğunu. Sitolitik sinaps aslında merkezi bir salgı etki 1-4 çevreleyen aktin ve yapışma moleküllerinin bir halka ile yapı gibi bir "boğa gözü" sahip olarak nitelendirildi. Ancak, şimdi bu fonksiyonu 5-11 sürekli dinamik sitoskeletal örgütlenmesini gerektirir aktif sinyalizasyon mikroskobik etki oluştuğunu biliyoruz. Sinaps hakkında şu anda sahip bilgilerin çoğu mikroskop elde edilmiştir, ve immunolojistlerden üstün görüntüleme teknolojisi erken benimseyenler olmuştur.

Böyle bir yeni teknoloji süper-çözünürlük mikroskopisidir. Geleneksel uzamsal ışık mikroskobu, yaklaşık 200 nm 'de dahil olmak üzere tüm konfokal floresan mikroskobu için çözünürlük alt sınırı, setleri ışık kırılma bariyer ile sınırlıdır. Son yıllarda, çeşitli teknikler geliştirmek olmuşturçözünürlüğü kırınım bariyerin altında izin d. Bu uyarım emisyon tükenmesi mikroskobu (STED'in), yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM), davranışsal çözüldü mikroskobu (FIRTINA) ve fotoaktıfleştırılebılır ışık mikroskobu (PALM) içerir. Bu teknikler yerlerinde detaylı olarak 12-15 gözden geçirilmiş, ancak aşağıda özetlenmiştir. Subdiffraction sınırlı çözünürlük her sistemde benzersiz şekilde oluşturulur. Süper çözünürlük tekniğinin seçimi, bu nedenle, ilgi konusu deney ve deneysel sistem tarafından dikte edilmelidir.

STED süper çözünürlük subdiffraction sınırlı floresan mikroskobu 16-18 sonuçlanan uyarma sonrasında her bir ilgi florofor çevresinde seçici "sessizliği" floresan yüksek yoğunluklu torroidal tükenmesi ışını kullanılarak elde edilir. STED'in bir avantajı görüntü elde etme, hızlı ve nispeten küçük bir post-processing gerektirir. Boya seçimi spec tarafından belirlenir daTicari olarak temin edilebilen sistemde 592 nm 'de yer almaktadır tükenmesi huzmesinin tral konumu, bir çok piyasada mevcut boyalar, iki florofor kombinasyonlar mümkün kılan mevcuttur. Buna ek olarak, GFP gibi yaygın olarak kullanılan floresan haberci 19,20 canlı hücre deneyleri mümkün hale görüntülenebilir.

Daha önce degranülasyon 21,22 için NK hücreleri tarafından kullanılmaktadır F-aktin hipodansitedir bölgelerini belirlemek ve ölçmek için STED'i kullandık. Biz STED'in nedeniyle floroforlar ve xy ekseninde çözünürlükte üstün iyileşme nispeten esnek durumuna bağışıklık sinaps görüntüleme için iyi bir seçim olduğunu düşünmekteyiz. Buna ek olarak, bu deney için kullanılan, ticari olarak temin STED'in sisteminde, yüksek hızlı (12,000 Hz) rezonans tarayıcının kullanılması örnekler en az hasar ile, görüntülerin elde edilmesi için hızlı sağlar. Boya seçimi sınırlı esneklik, STED'in 12 bir dezavantaj olarak kabul edilirAncak çift renkli STED'in piyasada bulunan çeşitli floroforlar nispeten basittir. STED iki kanal ile sınırlı iken, ek yapılar, yaklaşık 200 nm (E. Mace, yayınlanmamış gözlemler çözünürlükte konfokal görüntülü böylece bir lazer konfokal tarama mikroskobu ile STED'in entegrasyonu da STED'in ile kombinasyon halinde ilave confocal görüntüleme sağlar: .) Biz bağışıklık hücrelerini görüntülenmesi için STED'in kullanımını tarif ederken, bu teknoloji, sinir hücreleri dahil olmak üzere hücre tipleri, çeşitli hücre ve yapıların çeşitli 23-26 görselleştirme için uygulanır.

SIM subdiffraction sınırlı görüntüler oluşturmak için farklı bir yaklaşım kullanır. Bilinen periyodik uyarım desen ile görselleştirme, bilgi daha sonra, aşağıdaki matematiksel dönüşüm 27 çalışılmaktadır bilinmeyen yapısı elde edilebilir. Bu ~ 100 nm yanal 28,29 çözünürlüğe bir artış verir. SIM avantajı, bu is tüm standart konfokal boyalar ve probları ile uyumlu, ancak dezavantajı görüntüleri elde etmek için çok daha yavaş olduğunu ve bu uzun post-processing 12 ihtiyaç olmasıdır. Bu, aynı zamanda canlı hücre görüntüleme için kullanılmasını sınırlamaktadır.

Son olarak, süper çözünürlüklü görüntüler Flüoroforlann stokastik foto-anahtarlama tarafından oluşturulmuş olabilir. Bu yaklaşım, fotoğraf aktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) ve stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (FIRTINA) istismar edilmektedir. Birden fazla kamera kare tarama ve zamanla ve "kapalı", "açık" rastgele aktif molekülleri lokalize ederek, 20-30 nm çözünürlükte görüntüler birikmiş çerçeveleri 30-32 üretilir. Bu çözünürlük için trade-off görüntüleri elde etmek için gerekli zamanı.

Burada ayrıntılı olarak göstermek, hazırlama ve STED'in çift renk örnekleri görüntüleme için protokol. Bu sistemde, atımlı bir uyarım, ayarlanabilir, beyaz ışık lazer ile. Doğası gereğidarbeli uyarma demetinin, algılama süresi yolluk mümkün kılan ve daha fazla artış çözünürlük edilir. Buna ek olarak, sistem, bu şekilde daha düşük bir lazer güç gereksinimleri için izin gadolinyum hibrid geleneksel foto-çoğaltıcı tüpler daha duyarlıdır (hyd) dedektörleri ile donatılmıştır. STED'in için tükenmesi ışın sürekli olarak tatbik edilir ve iki renk STED'in için mevcut boyaların seçimi dikte edecek 592 nm, ayarlanmıştır. Yaygın olarak kullanılan boya kombinasyonları genellikle (örneğin Alexa Fluor 488, Oregon Yeşil, yeşil DyLights veya Chromeo 488 gibi) 488 nm ile heyecanlı bir ve (örneğin Pasifik Turuncu veya Horizon V500 gibi) 458 nm ile heyecanlanan birini içerir. İki boyaların algılama benzer bir aralık içinde olacaktır (ve her ikisi de tükenme lazer tarafından erişilebilir) iken Böylece, farklı dalga boylarında uyarım ile ortaya çıkar. Bir ayarlanabilir beyaz ışık lazer ve ayarlanabilir dedektörleri ile, spektral örtüşme yok ederken sinyali maksimize oldukça kolay yapılır. Gibi, biz combinat ile iyi bir başarı olduBu tür Pacific Orange (burada kullanılan) Alexa Fluor 488 olarak ticari olarak temin edilebilen boya iyonları. Bizim protokol yönelik hazırlanmıştır ve bu bizim laboratuvar tarihsel odak temsil eder gibi insan NK hücrelerinin değerlendirilmesini açıklar. Biz düzenli olarak deneysel çalışmalar 21,33 olarak uygulamış biri olarak biz özellikle bu örnekte NK92 hücre hattını kullanıyor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#1.5 cover slips VWR 48393-172
BD Cytofix/Cytoperm BD Biosciences 554722
Bovine serum albumin Sigma A2153
Cotton tipped applicator Fisher Scientific S450941
Falcon centrifuge tubes (50 ml) VWR 352070
Fetal calf serum (FCS) (500 ml) Atlantic Biologicals S11050
Goat anti-rabbit Pacific Orange Life Technologies P31584
Laboratory tissue wipers VWR 82003-820
Nail polish VWR 100491-940
NK-92 cells ATCC CRL-2407
Phalloidin Alexa Fluor 488 Life Technologies A12379
Phosphate buffered saline Life Technologies 14190250
Prolong anti-fade reagent Life Technologies P7481
Purified anti-CD18 Biolegend 301202
Purified anti-NKp30 Biolegend 325202
Purified anti-perforin Biolegend 308102
RPMI 1640 medium (500 ml) Life Technologies 11875-093
Saponin from Quillaja bark Sigma S4521
Super PAP pen Life Technologies 008899
Triton X-100 Electron Microscopy Sciences 22142
Huygens deconvolution software SVI Contact company
Leica SP8 TCS STED microscope Leica Microsystems contact company

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stinchcombe, J. C., Bossi, G., Booth, S., Griffiths, G. M. The immunological synapse of CTL contains a secretory domain and membrane bridges. Immunity. 15 (5), 751-761 (2001).
  2. Grakoui, A., Bromley, S. K., Sumen, C., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  3. Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
  4. Orange, J. S., Harris, K. E., Andzelm, M. M., Valter, M. M., Geha, R. S., Strominger, J. L. The mature activating natural killer cell immunologic synapse is formed in distinct stages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (24), 14151-14156 (2003).
  5. Treanor, B., Lanigan, P. M., Kumar, S., et al. Microclusters of inhibitory killer immunoglobulin-like receptor signaling at natural killer cell immunological synapses. J. Cell Biol. 174 (1), 153-161 (2006).
  6. Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells. J. Cell Biol. 192 (4), 675-690 (2011).
  7. Beemiller, P., Jacobelli, J., Krummel, M. F. Integration of the movement of signaling microclusters with cellular motility in immunological synapses. Nat. Immunol. 13 (8), 787-795 (2012).
  8. Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling. J. Exp. Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).
  9. Mossman, K. D., Campi, G., Groves, J. T., Dustin, M. L. Altered TCR signaling from geometrically repatterned immunological synapses. Science. 310 (5751), 1191-1193 (2005).
  10. Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
  11. Yokosuka, T., Sakata-Sogawa, K., Kobayashi, W., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat. Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
  12. Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 285-314 (2010).
  13. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).
  14. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu. Rev. Biochem. 78, 993-1016 (2009).
  15. Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front. Immunol. 3, 421 (2012).
  16. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt. Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
  17. Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt. Lett. 24 (14), 954-956 (1999).
  18. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).
  19. Rankin, B. R., Moneron, G., Wurm, C. A., et al. Nanoscopy in a living multicellular organism expressing GFP. Biophys. J. 100 (12), 63-65 (2011).
  20. Willig, K. I., Kellner, R. R., Medda, R., Hein, B., Jakobs, S., Hell, S. W. Nanoscale resolution in GFP-based microscopy. Nat. Methods. 3 (9), 721-723 (2006).
  21. Rak, G. D., Mace, E. M., Banerjee, P. P., Svitkina, T., Orange, J. S. Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse. PLoS Biol. 9 (9), (2011).
  22. Mace, E. M., Orange, J. S. Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells. Commun. Integr. Biol. 5 (2), 184-186 (2012).
  23. Singh, H., Lu, R., Rodriguez, P. F., et al. Visualization and quantification of cardiac mitochondrial protein clusters with STED microscopy. Mitochondrion. 12 (2), 230-236 (2012).
  24. Tonnesen, J., Nagerl UV, Superresolution imaging for neuroscience. Exp. Neurol. 242, 33-40 (2013).
  25. Kempf, C., Staudt, T., Bingen, P., et al. Tissue multicolor STED nanoscopy of presynaptic proteins in the calyx of held. PLoS One. 8 (4), (2013).
  26. Jans, D. C., Wurm, C. A., Riedel, D., et al. STED super-resolution microscopy reveals an array of MINOS clusters along human mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (22), 8936-8941 (2013).
  27. Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (2), 82-87 (2000).
  28. Gustafsson, M. G., Shao, L., Carlton, P. M., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination). Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
  29. Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
  30. Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 13 (5793), 1642-1645 (2006).
  31. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  32. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  33. Cdc42-interacting protein-4 functionally links actin and microtubule networks at the cytolytic NK cell immunological. J. Exp. Med. Banerjee, P. P., Pandey, R., Zheng, R., Suhoski,, Monaco-Shawver, L., Orange, J. S. 204 (10), 2305-2320 (2007).
  34. Vicidomini, G., Moneron, G., Han, K. Y., et al. Sharper low-power STED nanoscopy by time gating. Nat. Methods. 8 (7), 571-573 (2011).
Çift Renkli Zaman-kapılı Uyarılmış Emisyon tükenmesi (STED) Nanoscopy tarafından İmmünoloji Synapse görselleştirme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mace, E. M., Orange, J. S.… More

Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy. J. Vis. Exp. (85), e51100, doi:10.3791/51100 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter