Här illustrerar vi det protokoll för avbildning med tvåfärgad Sted nanoskopi den cytotoxiska immun synapsen av NK-celler rekapituleras på glas. Med denna metod får vi sub-100 nm upplösning på synapsproteiner och cytoskelettet.
Naturliga mördarceller bildar hårt reglerade, finstämda immunologiska synapser (IS) för att lysera virusinfekterade eller tumörframkallande celler. Dynamisk aktin omorganisationen är kritisk för funktionen av NK-celler och bildandet av IS. Imaging av F-aktin i synapsen har traditionellt utnyttjat konfokalmikroskopi dock diffraktionsgränsen av ljuset begränsar upplösningen av fluorescensmikroskopi, inklusive konfokal, cirka 200 nm. Senaste framstegen inom bild teknik har möjliggjort utvecklingen av subdiffraction begränsade super upplösning avbildning. För att visualisera F-aktin arkitektur på IS rekapitulera vi NK cell cytotoxiska synapsen genom att följa NK-celler för att aktivera receptorn på glas. Vi sedan bild proteiner av intresse genom att använda två färger stimulerad utarmning utsläpp mikroskopi (Sted). Detta resulterar i <80 nm upplösning i synapsen. Häri beskriver vi de steg av provpreparering och förvärvet av bilder med hjälp av dubbla coleller STED nanoskopi att visualisera F-aktin vid NK IS. Vi belyser även optimering av prov förvärv använda Leica SP8 programvara och tids gated Sted. Slutligen använder vi Huygens mjukvara för efterbearbetning deconvolution av bilder.
Den immunologiska synaps är en komplex miljö av signalproteiner och cytoskelettala element. Den cytolytiska synaps ursprungligen beskrivs ha en "bulls-eye" liknande struktur med en ring av aktin och adhesionsmolekyler som omger en central sekretorisk domän 1-4. Men vi vet nu att det består av mikroskopiska områden av aktiv signalering som kräver kontinuerliga dynamiska cytoskelettala omorganisation för funktion 5-11. Mycket av den information som vi nu har om synapsen har hämtats från mikroskopi, och immunologer har varit tidiga användare av avancerad bildteknik.
En sådan ny teknik är super-resolution mikroskopi. Konventionell Ijusmikroskopi är spatialt begränsad av diffraktion barriären av ljus, som anger den lägre gränsen för upplösning för alla fluorescensmikroskopi, inklusive konfokala, vid ca 200 nm. Under senare år har flera tekniker varit developed som tillåter upplösning nedanför diffraktion barriären. Dessa inkluderar stimulering emissions utarmning mikroskopi (Sted), strukturerad belysning mikroskopi (SIM), stokastiskt löst mikroskopi (STORM), och fotoaktiverbart ljusmikroskop (PALM). Dessa tekniker har granskats i detalj på annan plats 12-15, men beskrivs nedan. Subdiffraction begränsad upplösning genereras på ett unikt sätt i varje system. Valet av en super-resolution teknik därför bör styras av experimentet och experimentsystem av intresse.
Sted superupplösning uppnås med hjälp av en hög intensitet toroid utarmning stråle som selektivt "tystnader" fluorescens runt varje fluoroforen av intresse efter excitation, vilket resulterar i subdiffraction begränsad fluorescensmikroskopi 16-18. En fördel med STED är att bilden förvärvet är snabb och kräver relativt lite efterbearbetning. Medan färgämne val dikteras av spectral position för uttömning stråle, som i det kommersiellt tillgängliga systemet är beläget på 592 nm, flera kommersiellt tillgängliga färgämnen är tillgängliga som gör kombinationer av två fluoroforer möjligt. Dessutom kan vanligen använda fluorescerande reportrar såsom GFP skall avbildas, vilket gör levande cellförsök möjligt 19,20.
Vi har tidigare använt Sted att identifiera och kvantifiera regioner av F-aktin hypodensity som används av NK-celler för degranulering 21,22. Vi föreslår att Sted är ett bra val för avbildning immun synapsen på grund av dess relativt flexibel tillgång på fluoroforer och överlägsen förbättring i upplösning i xy-axeln. Dessutom, på kommersiellt tillgängliga Sted-system utnyttjas för dessa experiment, användandet av en hög hastighet (12.000 Hz) resonans möjliggör snabb förvärv av bilder med minimal skada på prov. Begränsad flexibilitet i färg valet anses vara en nackdel med Sted 12,Men tvåfärgade Sted är relativt enkelt med flera kommersiellt tillgängliga fluoroforer. Integrationen av Sted med en laserskanning konfokalmikroskop möjliggör också ytterligare konfokal avbildning i kombination med Sted, så medan Sted är begränsat till två kanaler, kan ytterligare strukturer avbildas i konfokal med upplösning på ca 200 nm (E. Mace, opublicerade observationer ). Medan vi beskriver användningen av STED för avbildning av immunceller, används denna teknik tillämpas på en mängd olika celltyper, inklusive neurala celler, och för att visualisera en mängd olika cellstrukturer 23-26.
SIM använder en annan metod för att generera subdiffraction begränsade bilder. Genom att visualisera kända periodisk excitation mönster, kan informationen då erhållas om okänd struktur som studeras efter matematisk transformation 27. Detta ger en ökning av upplösningen till ~ 100 nm i sidled 28,29. Fördelen med SIM är att det jagar kompatibel med alla vanliga konfokala färgämnen och sonder, men nackdelen är att det är mycket långsammare att få bilder och dessa kräver långa efterbearbetning 12. Detta begränsar också dess användning för levande cell imaging.
Slutligen kan super-upplösning genereras genom stokastisk foto-växling av fluoroforer. Detta tillvägagångssätt utnyttjas i fotoaktiverad lokalisering mikroskopi (Palm) och stokastiska optisk rekonstruktion mikroskopi (STORM). Genom att skanna flera kameraramar och lokalisera slumpmässigt aktiverade molekyler som vänds "på" och "off" med tiden, är bilder med 20-30 nm upplösning genereras från ackumulerade ramar 30-32. Den kompromiss för denna resolution är den tid som krävs för att få bilder.
Här visar vi, i detalj, protokollet för att förbereda och avbildning dubbla färgprover i Sted. I detta system är excitering med en pulsad, avstämbara, vitt ljus laser. På grund av karaktärenav den pulsade excitationsstrålen, är tids gating för detektion möjlig och ytterligare ökningar upplösning. Dessutom är systemet utrustat med gadolinium-hybrid (HYD) detektorer, vilka är känsligare än konventionella fotomultiplikatorrör, vilket möjliggör lägre lasereffektkrav. Den utarmning beam för Sted appliceras kontinuerligt och är inställd på 592 nm, som kommer att diktera valet av färgämnen som två färger Sted. Vanligen använda färgämneskombinationer inkluderar vanligen en hetsiga med 488 nm (t.ex. Alexa Fluor 488, Oregon Green, DyLights grönt eller Chromeo 488) och en lättretad med 458 nm (t.ex. Pacific Orange eller Horizon V500). Således, medan detektering av de två färgämnena kommer att vara i ungefär samma intervall (och båda är tillgängliga med utarmningslaser), kommer excitering inträffa med olika våglängder. Med ett justerbart vitt ljus laser och avstämbara detektorer, är att maximera signal samtidigt som man eliminerar spektral överlappning görs ganska lätt. Som sådan har vi haft god framgång med combinatjoner på kommersiellt tillgängliga färgämnen, såsom Pacific Orange och Alexa Fluor 488 (används här). Vår protokoll är skräddarsytt för och beskriver utvärderingen av humana NK-celler som representerar den historiska fokus för vårt laboratorium. Vi är speciellt utnyttjar NK92 cellinjen i detta exempel eftersom det är en som vi har regelbundet tillämpas i vår experimentella arbetet 21,33.
Förbättringen i upplösning över konfokal blir något beroende av faktorer som inte kan kontrolleras. Dessa faktorer inkluderar smärre avvikelser i täckglastjocklek och inkonsekvenser i monteringsmedier. Det är viktigt att hålla temperaturen och fuktigheten i avbildningsrummet så enhetlig som möjligt och STED trålen bör uträtad ungefär var 60 min. Som nämnts i procedurer, måste användningen av Vectashield monteringsmedium undvikas, eftersom detta inte är förenligt med Sted. Förutom som man bör alltid använda # 1,5 täckglas, och om möjligt, använder de som har verifierats till en specifik tjocklek.
En modifiering av den metod som beskrivs här är att bilden ytterligare kanaler i konfokal, använda fluoroforer som släpper vid en längre våglängd än Sted balken. På detta sätt, man kan bilden upp till fyra kanaler (två i konfokal, två i Sted). Om du tar detta synsätt, men kanalerna med fluoroforer ererna sänder sin ovanför STED utarmning lasern måste avbildas först, eftersom tillämpningen av STED trålen kommer bryter fotoner i dessa kanaler. En fördel med denna teknik är att tillämpa tidsslussning, vilket också kommer att förbättra upplösningen i konfokal genom att eliminera utsläpp av fotoner med korta livstider 34. I synnerhet kommer att använda tiden slussning, tidpunkten för emissionsdetektorer för att motsvara med pulsad excitation Sted, minskar bakgrundsfluorescens från reflektion av täckglaset när avbildning nära den. Även i ett experiment som inte lämpar sig för Sted, om du använder en pulsad exciteringskälla, kan tidsgrind vara ett användbart verktyg för att förbättra upplösningen i konfokal.
Det finns olika modifieringar som kan utnyttjas för att förbättra upplösningen i Sted. Ett är att minska storleken på nålhålet från standard en Airy enhet, även om detta kommer också att minska mängden ljus som når provet. Detta kan kompenseras genom att öka laser makt eller vinning. En annan är att öka linjegenomsnitt, vilket kommer att öka den mängd information som samlats för varje foton, förbättrad upplösning. Även här kan dock detta vara på bekostnad av fotoblekning av provet, så en balans måste uppnås mellan upplösning och blekning. På samma sätt kommer användningen av fluorescerande proteiner såsom GFP kräver noggrann optimering för att undvika blekning. Detta kan åstadkommas genom minskning STED lasereffekt om nödvändigt. Längre tidpunkter kommer även att möjliggöra större foton återhämtning och minska blekning. Korrigering för fotoblekning bör redovisas vid analys av levande Sted.
Naturligtvis är avbildning i tre dimensioner i STED också möjligt, och kommer också att ge en förbättring jämfört med konventionell konfokal avbildning. Detta gäller särskilt om den görs i kombination med avfaltning, även om försiktighet bör iakttas för att korrigera för drift som sker under avbildning flera plan i z-axeln. Om du använder Huygens programvaraatt deconvolve Korrigeringen erhålls genom att använda "stabilisera bild"-funktionen. Med användning av detta tillvägagångssätt kommer upplösningen i z-axeln förbättras. Detta är en stor förbättring jämfört med konventionell konfokal avbildning, som har dålig axiell upplösning och till och med över bara sted sig själv, som också har relativt dålig z-axel-upplösning. Medan förvärva flera högar i Sted, måste man vara försiktig för att undvika blekning av provet, och vid behov kan man minska linje utjämning eller lasereffekt intensitet för att kunna göra detta. Återigen bör det noteras att om bildåtergivning andra fluoroforer som inte är lämpliga för STED, skulle tillämpningen av utarmnings strålen i den första sekventiell avsökning förhindra emission från dessa kanaler. Därför, en blandad Sted / konfokal strategi (vid användning av konfokal scanning i kanaler som släpper vid en våglängd som överstiger 592 nm) kommer tyvärr inte att vara lämplig för 3D.
För att summera, har vi valt STED som en metod på grund av dess relativa lätthet av APPskriften och förbättring i upplösning över standard konfokal avbildning. För avbildning immun synapsen, har det visat sig vara ett effektivt och värdefull teknik som tillåter oss att se detaljer i F-aktin arkitektur inte möjligt upplösning över 200 nm. Även om många av dessa uppgifter verkar subtila, de kan ha en djupgående effekt på NK cellernas funktion. Därför tillämpar vi den senaste nanoskopiska bildteknik för att hämta uppgifter som är avgörande för att upprätthålla människors hälsa.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Geoff Daniels för att få hjälp. Detta arbete har finansierats av R01 AI067946 till JSO
#1.5 cover slips | VWR | 48393-172 | |
BD Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | 554722 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
Cotton tipped applicator | Fisher Scientific | S450941 | |
Falcon centrifuge tubes (50 ml) | VWR | 352070 | |
Fetal calf serum (FCS) (500 mL) | Atlantic Biologicals | S11050 | |
Goat anti-rabbit Pacific Orange | Life Technologies | P31584 | |
Laboratory tissue wipers | VWR | 82003-820 | |
Nail polish | VWR | 100491-940 | |
NK-92 cells | ATCC | CRL-2407 | |
Phalloidin Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A12379 | |
Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14190250 | |
Prolong anti-fade reagent | Life Technologies | P7481 | |
Purified anti-CD18 | Biolegend | 301202 | |
Purified anti-NKp30 | Biolegend | 325202 | |
Purified anti-perforin | Biolegend | 308102 | |
RPMI 1640 medium (500 mL) | Life Technologies | 11875-093 | |
Saponin from Quillaja bark | Sigma | S4521 | |
Super PAP pen | Life Technologies | 008899 | |
Triton X-100 | Electron Microscopy Sciences | 22142 | |
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
Huygens deconvolution software | SVI | Contact company | |
Leica SP8 TCS STED microscope | Leica Microsystems | Contact company |