Sensing of Barrier vevsdesintegrasjon med en organisk Elektrokjemisk Transistor

Summary

The Organic Electrochemical Transistor er integrert med levende celler, og brukes til å overvåke ion fluks på tvers av gastrointestinal epitelial barriere. I denne studien ble en økning i ion fluks, relatert til forstyrrelse av tett veikryss, indusert ved nærværet av kalsium chelator EGTA (etylenglykol-bis (beta-aminoetyl-eter)-N, N, N ', N'-tetra eddiksyre syre), blir målt.

Abstract

Mage-tarm-kanalen er et eksempel på barriere vev som gir en fysisk barriere mot inntrengning av patogener og giftstoffer, samtidig som den tillater passering av nødvendige ioner og molekyler. Et brudd i denne barrieren kan være forårsaket av en reduksjon i det ekstracellulære kalsiumkonsentrasjon. Denne reduksjon i kalsium-konsentrasjon fører til en konformasjonsendring i proteiner som er involvert i den forsegling av barrieren, som fører til en økning av paracellular flux. For å etterligne denne virkning på kalsium-chelaterende etylenglykol-bis (beta-aminoetyl-eter)-N, N, N ', ble N'-tetraeddiksyre (EGTA) brukt på et monolag av celler som er kjent for å være representative for mage-tarmkanalen. Forskjellige fremgangsmåter for å påvise avbrudd av barrieren vev allerede eksisterer, slik som immunfluorescens og permeabilitets-analyser. Men disse metodene er tidkrevende og kostbart, og ikke egnet til dynamiske eller high-throughput målinger. Elektroniske metoder for måling av barriere vevintegritet også finnes for måling av transepithelial motstand (TER), men disse er ofte kostbart og komplisert. Utvikling av raske, billige, og sensitive metoder er stort behov som integriteten av barriere vev er en viktig parameter i medisiner og patogen / gift diagnostikk. Den organiske elektro transistor (OECT) integrert med barriere vev dannende celler har vist seg som en ny enhet i stand til dynamisk å overvåke barriere vev integritet. Enheten er i stand til å måle små variasjoner i ionisk flux med enestående tidsmessig oppløsning og følsomhet, i sanntid, som en indikator på barriere vev integritet. Denne nye fremgangsmåten er basert på en enkelt enhet som kan være forenlig med høy gjennomstrømning screeningsanvendelser og fremstille til lav pris.

Introduction

Den gastrointestinale epitel er et eksempel på barriere vev, som styrer passasjen av molekyler mellom forskjellige avdelinger av kroppen. Den epitel består av langstrakte søyleceller bundet sammen av komplekser av proteiner som gir en fysisk barriere ^en mot patogener og giftstoffer, samtidig som den tillater passering av vann og næringsstoffer som kreves for å opprettholde legemet. Denne selektivitet er på grunn av polarisering av de epiteliale celler, noe som skaper to forskjellige membrandomener: den apikale side av cellene eksponert for lumen, og den basale side av cellene som var festet til de underliggende vevene ^2,3. Trange veikryss (TJ) er komplekser av proteiner til stede på den apikale delen av epitelceller og er en del av et større kompleks som kalles den apikale veikryss ^4. Ion strømning tvers over barrieren vev kan enten gå via den transcellular (gjennom cellen) eller via en paracellular (mellom to tilstøtende celler) pathway. Summen avtransporten gjennom begge banene er kjent som transepithelial motstand. Den apikale veikryss er ansvarlig for regulering av ioner og molekyler passerer over barrieren ^5,6 via en bestemt åpning og lukkefunksjon. En dysfunksjon eller forstyrrelse av disse proteinkomplekser er ofte relatert til sykdom ^7-11. I tillegg er mange enteriske patogener / giftstoffer er kjent for å spesifikt målrette dette komplekset, og derved kommer inn i kroppen, og som fører til diaré, sannsynligvis som en konsekvens av massive feilregulering av ion / vannstrømmen på tvers av barrieren ^{12 til 14.} Barriere vev kan også modifiseres ved å endre det ekstracellulære mikromiljøet. Cadherin er en kritisk protein for celle-celle-adhesjon, og er involvert i dannelsen av den apikale krysset. Kalsium er nødvendig for riktig strukturell konformasjon av Cadherin, og en reduksjon i ekstracellulært kalsium har vist seg å resultere i ødeleggelse av celle-celle kryss og en etterfølgende åpning avparacellular svei mellom cellene ^15. I denne studien, EGTA (etylenglykol-bis (beta-aminoetyl-eter)-N, N, N ', N'-tetraeddiksyre), en spesifikk kalsium chelator, ble brukt til å fremkalle brudd i barriere vev, som det har vist seg å ha en hurtig og drastisk effekt på paracellular ion strømme ^16,17. Dette kalsium chelator ble brukt på en konfluent monolag og differensiert av Caco-2-cellelinjen. Dyrket i cellekultur inserts, er denne cellelinje kjent for å utvikle egenskapene til mage-tarmkanalen og er mye brukt av legemiddelindustrien for å teste opptaket av legemidler ^18,19.

Metoder for å overvåke barriere vev integritet er rikelig. Disse metodene er ofte optisk, avhengig av immunfluorescens farging av spesielle proteiner er kjent for å være på den apikale knutepunkt ^20, eller avhengig av kvantifisering med en fluoriserende sporstoff-molekylet som normalt er ugjennomtrengelig for barriere vev21,22. Imidlertid har markør-fri metoder (dvs. uten en fluorofor / kromofor) er å foretrekke som bruken av en merkelapp kan medføre gjenstander, og ofte øker kostnadene og assay tid. Elektrisk, etikett-fri overvåking av barriere vev har nylig dukket opp som en dynamisk overvåking metode ^23. For eksempel nye teknologiske fremskritt i elektrisk impedans-spektroskopi har tillatt utviklingen av en kommersielt tilgjengelig sveipean-ordningen ^24,25 som kan måle transepithelial motstand (TER), en måling av ione-ledningsevne tvers over cellelaget.

Organic elektronikk har skapt en unik mulighet til grensesnittet verden av elektronikk og biologi ^{26,27 28,29} ved using gjennomføre polymerer som kan lede både elektroniske og ioniske bærere. En ny teknikk for å oppdage brudd i barriere vev ved hjelp av OECT ^30-32 ble nylig introdusert. Denne enheten ble validert mot eksisterende teknikker ossed å vurdere barriere vev integritet, herunder immunfluorescens, permeabilitet analyser ved hjelp Lucifer gul, og impedansspektroskopi bruker Cellzscope. I tilfelle av alle giftige forbindelser som ble testet, ble OECT funnet å operere med lik eller bedre følsomhet, og med økt tidsmessig oppløsning, sammenliknet med de ovennevnte teknikker. Ved denne anordning, PEDOT: PSS, en ledende polymer som har vist seg å være stabil og biokompatible ^33,34, anvendes som det aktive materiale i transistoren kanalen. Den OECT består av avløps-og kildeelektrodene på hver side av en ledende polymer-kanal. Dette blir deretter plassert i kontakt med en elektrolytt, som danner en integrert del av anordningen. En port-elektroden er neddykket i elektrolytten (fig. 1), og når en positiv portspenning påføres ved porten, er kationer fra elektrolytten tvinges inn i kanalen, og dermed dedoping den ledende polymer, og som resulterer i en endring i kilde drain gjeldende. Den device er således meget følsom overfor forandringer i liten ionisk fluks på grunn av amplifikasjon av transistor. En cellelaget dyrket på et cellekulturinnsats ble plassert mellom portelektroden, og det ledende polymer-kanalen. Tilstedeværelsen av en intakt cellelaget virker som barriere for kationene inngåelse av ledende polymer, og derfor, i nærvær av en intakt monolaget, dreneringsomløps avtar (figur 2: overgang fra et område til b). I nærvær av en toksisk forbindelse, vil barrieren vev progressivt mister sin integritet, slik at kationene inn i polymerfilmen og øke avløpsstrøm (figur 2: region c). Med denne teknikken blir bruddet i barrieren vev sett av moduleringen av avløpsstrøm, svarende til moduleringen av fluksen over monolaget. Denne enheten er i stand til å måle små variasjoner i ionisk flux med enestående tidsmessig oppløsning og følsomhet i sanntid. Denne teknologien will være av interesse i domenet av toksikologi for narkotika testing, sykdom diagnostikk eller grunnforskning som barrieremodellen kan enkelt tilpasses. Denne metode vil også bidra til å redusere dyreforsøk, da det gjør det mulig for validering av in vitro-modeller for å erstatte in vivo testing.

Protocol

En. PEDOT: PSS Solution Forberedelse Til 50 ml av PEDOT: PSS, tilsett etylenglykol (øker ledningsevnen) i et volumforhold på 01:04 (etylenglykol til PEDOT: PSS), 0,5 ul / ml Dodecylbenzenesulfonic acid (dbsa) som et overflateaktivt middel, og 10 mg / ml 3-glycidoksypropyltrimetoksysilan (GOPs) som et tverrbindingsmiddel for å fremme adhesjon av den ledende polymer til en glass-slide. 2. OECT Fabrikasjon (figur 3) Definer termisk fordampet gull source og drain k…

Representative Results

Under det første trinn av målingen, kan avløpsstrøm varierer noe, men i de fleste tilfeller bør det være stabil (figur 2, avsnitt a). Hvis signalet ikke er stabil, bør transistoren kasseres og erstattes. Denne stabiliteten sjekk sikrer også at noen innledende tap i ledningsevnen av innretningen ikke påvirker den etterfølgende måling. Etter flere minutter av målingen, er innsatsen med celler som danner barriere vev plasseres på toppen av kanalen. Avløps nåværende bør umiddelbart redusere…

Discussion

Denne teknikken tilveiebringer en ny fremgangsmåte for å integrere et organisk elektrokjemisk transistor med levende celler for å måle barriere vev integritet. De viktigste fordelene med denne teknikken er den hurtighet og følsomhet, men også den lave kostnaden av anordningen for dynamisk overvåking av barriere vev.

Ettersom denne metoden bruker levende celler, er et kritisk punkt for å være sikker på å bruke en monolayer, som representerer en intakt barriere lag. Parametrene av b…

Materials

CLEVIOS PH 1000	HERAUS CLEVIOS
AZ9260 resin	CIPEC SPECIALITIES
Dodecylbenzenesulfonic acid (DBSA)	Acros Organic
3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS)	Sigma Aldrich
24-well Suspended cell Culture insert Millicell  PET 0.4 μm Millipore	Dominique dutscher	51705
24-well cell culture plate BD Falcon	Dominique dutscher	51705
STERICUP-GP PES 0.22 μM	Dominique dutscher	51246
ADVANCED DMEM Marque GIBCO	Fisher scientific	E3434T
FBS HEAT INACT. S.AMERICAN	Fisher scientific	E3387M
PENICILLIN STREPTOMYCIN	Fisher scientific	E3470C
GLUTAMAX	Fisher scientific	E3524T
TRYPSIN 0.05% EDTA	Fisher scientific	E3513N
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)	Sigma Aldrich	E4378
ETHYLENE GLYCOL, ANHYDROUS, 99.8%,	Sigma aldrich
Caco-2 cells	ATCC
PDMS	Dow corning	SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER
Au (99.99%)	NEYCO	AU3X6
Chromium (99.95%)	NEYCO
Parylene C	Specialty Coating Systems
Ag/AgCl wire	HARVARD APPARATUS
Photoresist	CIPEC SPECIALITIES	Résine AZ9260