Erkundung der Barrier Gewebestörung mit einem organischen Transistor Elektro
Summary
Die Organische elektrochemischen Transistor mit lebenden Zellen integriert und zur Ionenfluss über den Magen-Darm-Epithel-Barriere zu überwachen. In dieser Studie wurde eine Erhöhung des Ionenflusses, um eine Unterbrechung der tight junctions, die durch die Anwesenheit der Calcium-Chelatbildner EGTA (Ethylenglykol-bis (beta-aminoethylether)-N, N, N ', N'-Tetra-Essigsäure induzierten verwandten Säure), wird gemessen.
Abstract
Der Gastrointestinaltrakt ist ein Beispiel eines Sperrgewebe, das eine physikalische Barriere gegen den Eintritt von Pathogenen und Toxinen liefert, während es den Durchgang von Ionen und Molekülen erforderlich. Eine Verletzung dieser Barriere kann durch eine Verringerung der extrazellulären Calcium-Konzentration verursacht werden. Diese Verringerung der Calcium-Konzentration bewirkt eine Konformationsänderung in Proteinen im Verschweißen der Sperr beteiligt, was zu einer Erhöhung der parazellulären Fluss. Um diesen Effekt zu imitieren, die Calcium-Chelatbildner Ethylenglykol-bis (beta-aminoethylether)-N, N, N ', N'-Tetra-Essigsäure (EGTA) wurde auf einer Monoschicht von Zellen bekannt, repräsentativ für den Magen-Darm-Trakt verwendet werden. Verschiedene Methoden, um die Störung der Barriere Nachweis von Gewebe vorhanden ist, wie Immunfluoreszenz-Assays und Permeabilität. Jedoch sind diese Verfahren zeitaufwendig und teuer und nicht für dynamische oder Hochdurchsatz-Messungen geeignet. Elektronische Methoden zur Messung der Gewebe-SchrankeIntegrität auch zur Messung des transepithelialen Widerstandes (TER) vorhanden sind, aber diese sind oft teuer und komplex. Die Entwicklung von schnellen, billigen und empfindliche Verfahren ist dringend erforderlich, da die Integrität der Barriere Gewebe ist ein Schlüsselparameter in der Wirkstoffforschung und Krankheitserreger / Toxin Diagnostik. Die organische elektro Transistor (OECT) mit Barriere-Gewebe bildenden Zellen integriert wurde, als ein neues Gerät in der Lage, dynamisch Überwachung Barriere Gewebeintegrität gezeigt worden. Das Gerät ist in der Lage, kleine Veränderungen in der Ionenflusses mit beispiellosen zeitlichen Auflösung und Empfindlichkeit zu messen, in Echtzeit als Indikator der Sperrgewebeintegrität. Dieses neue Verfahren basiert auf einer einfachen Vorrichtung, die mit Hochdurchsatz-Screening-Anwendungen kompatibel sind und zu niedrigen Kosten hergestellt werden kann, basiert.
Introduction
Der Magen-Darm-Epithel ist ein Beispiel für Gewebebarriere, die den Durchgang von Molekülen zwischen verschiedenen Kompartimenten des Körpers steuert. Das Epithel besteht aus länglichen säulenförmigen Zellen Komplexe von Proteinen, die eine physikalische Barriere gegen Krankheitserreger 1 und Toxinen miteinander verbunden, während die den Durchgang von Wasser und Nährstoffen erforderlich, um den Körper zu stützen. Diese Selektivität ist auf die Polarisation der Epithelzellen, die zwei verschiedene Membrandomänen erzeugt: die apikale Seite der Zellen in das Lumen und der basalen Seite der Zellen auf das darunter liegende Gewebe verankert 2,3 ausgesetzt. Tight Junctions (TJ) sind Komplexe von Proteinen an der apikalen Teil der epithelialen Zellen vorhanden und sind Teil eines größeren Komplex der apikalen Ausfahrt 4 bekannt. Ionenfluss über die Barriere Gewebe kann entweder gehen über den transzellulären (durch die Zelle) oder über einen parazellulären (zwischen zwei benachbarten Zellen)-Weg. Die Summe derder Transport durch beide Wege als transepithelialen Widerstand bekannt. Der apikale Übergang ist für die Regulierung von Ionen und Molekülen durch die Barriere hindurch 5,6 über eine bestimmte Öffnungs-und Schließfunktion verantwortlich. Eine Dysfunktion oder Störung dieser Proteinkomplexe wird oft Krankheit 7-11 stehen. Darüber hinaus sind viele enterischen Pathogenen / Toxine bekannt, speziell auf diese komplexe, wodurch der Körper und die Eingabe, die zu Durchfall, wahrscheinlich als Folge einer massiven Fehlregulation der Ion / Wasserstrom über die Barriere 12-14. Wandgewebes kann auch durch Veränderung der extrazellulären Mikroumgebung modifiziert werden. Cadherin ist ein kritischer Protein für Zell-Zell-Adhäsion und bei der Bildung des apikalen Übergang beteiligt. Calcium ist für die korrekte strukturelle Konformation Cadherin erforderlich, und eine Abnahme der extrazellulären Calcium wurde gezeigt, dass die Zerstörung der Zell-Zell-Übergang und einem anschließenden Öffnen des Ergebnissesparazellulären Weg zwischen den Zellen 15. In dieser Studie, EGTA (Ethylenglykol-bis (beta-aminoethylether)-N, N, N ', N'-Tetra Essigsäure), ein spezifischer Calcium-Chelator, wurde verwendet, um eine Verletzung der Barrieregewebe zu induzieren, wie es wurde gezeigt, dass eine schnelle und drastische Auswirkungen auf die parazellulären Ionen fließen 16,17 zu haben. Diese Calcium-Chelator auf einer konfluenten Monoschicht von differenzierten Caco-2-Zelllinie verwendet. Kultiviert in Zellkultureinsätzen, ist diese Zelllinie bekannt, die Eigenschaften des Magen-Darm-Trakt zu entwickeln und wird von der pharmazeutischen Industrie verwendet, um die Absorption von Arzneimitteln 18,19 testen.
Methoden zur Barriere Gewebeintegrität überwachen sind reichlich vorhanden. Diese Verfahren sind oft optische, sich auf Immunfluoreszenzfärbung von bestimmten Proteinen bekannt, am apikalen Übergang 20 sein oder sich auf der Quantifizierung eines fluoreszierenden Tracermoleküls, die normalerweise undurchlässig für das Sperrgewebe21,22. Allerdings sind markierungsfreien Methoden (dh ohne Fluorophor / Chromophor) vorzuziehen, da die Verwendung eines Etiketts können Artefakte entstehen, und oft erhöht die Kosten-und Testzeit. Elektrische, markierungsfreie Überwachung der Barriere Gewebe wurde vor kurzem als eine dynamische Überwachungsmethode 23 entstanden. Beispielsweise die jüngsten technologischen Fortschritte in der elektrischen Impedanz-Spektroskopie haben die Entwicklung eines kommerziell verfügbaren Scanvorrichtung, die 24,25 transepithelialen Widerstandes (TER), eine Messung der Ionenleitfähigkeit in der Zellschicht messen erlaubt.
Organische Elektronik ist eine einzigartige Gelegenheit, die Welt der Elektronik und Biologie 26,27 28,29 durch Verwendung leitfähiger Polymere, die sowohl elektronische und ionische Träger leiten kann Schnittstelle erstellt. Eine neue Technik, um Verstöße bei der Verwendung der OECT 30-32 Barriere Nachweis von Gewebe wurde erst kürzlich eingeführt. Dieses Gerät wurde gegen uns bestehenden Techniken validierted barriereGewebeIntegrität, einschließlich Immunfluoreszenz, Durchlässigkeit Tests unter Verwendung von Lucifer Gelb und Impedanzspektroskopie mit Hilfe der Cellzscope beurteilen. Im Fall aller toxischen Verbindungen getestet, die OECT wurde festgestellt, dass gleiche oder bessere Empfindlichkeit zu arbeiten, und mit erhöhter zeitlicher Auflösung, verglichen mit den oben genannten Techniken. In dieser Vorrichtung, PEDOT: PSS, ein leitendes Polymer, das gezeigt worden ist, stabil und biokompatibel 33,34 wird, wird als das aktive Material in dem Transistorkanal verwendet. Die OECT aus Drain-und Source-Elektroden auf beiden Seiten einer leitenden Polymer-Kanal besteht. Diese wird dann in Kontakt mit einem Elektrolyten, der Bestandteil der Vorrichtung bildet platziert. Eine Gate-Elektrode in den Elektrolyten (1) eingetaucht ist, und wenn eine positive Gate-Spannung an das Gate angelegt wird, werden Kationen aus dem Elektrolyten in den Kanal gedrückt wird, so Entdotieren des leitenden Polymers und was zu einer Änderung in den Source-Drain Strom. Der device ist somit extrem empfindlich auf kleinste Veränderungen in der Ionenfluss durch Verstärkung durch den Transistor. Eine Zellschicht auf einem Zellkultureinsatz gewachsen wurde zwischen der Gateelektrode und dem leitenden Polymerkanal angeordnet. Das Vorhandensein eines intakten Zellschicht als Barriere für die Kationen der Eingabe in den leitenden Polymer daher in der Gegenwart eines intakten Monoschicht wirkt der Drain-Strom abnimmt (Fig. 2: Übergang vom Bereich a bis b). In Gegenwart einer toxischen Verbindung, wird das Sperrgewebe allmählich verlieren ihre Integrität und ließ die Kationen in die Polymerfolie ein und Erhöhung des Drain-Stroms (Fig. 2: C-Region). Mit dieser Technik wird die Verletzung der Barrieregewebe durch die Modulation des Drainstroms gesehen, entsprechend der Modulation der Fluß durch die Monoschicht. Dieses Gerät ist in der Lage, kleinste Schwankungen der Ionenfluss mit bisher unerreichten Zeitauflösung und Empfindlichkeit in Echtzeit zu messen. Diese Technologie will von Interesse im Bereich der Toxikologie für Drogentests, Krankheitsdiagnose oder Grundlagenforschung als die Barriere Modell kann leicht angepasst werden kann. Dieses Verfahren wird auch helfen, Tierversuche zu verringern, da es die Validierung der in vitro-Modelle in vivo-Tests zu ersetzen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Technik stellt ein neues Verfahren, um eine organische elektrochemischen Transistor mit lebenden Zellen zu integrieren, um Sperrgewebeintegrität zu messen. Die Hauptvorteile dieses Verfahrens sind die Schnelligkeit und Empfindlichkeit, sondern auch die geringen Kosten der Vorrichtung zur dynamischen Überwachung eines Wandgewebes.
Da diese Methode lebende Zellen verwendet, ist ein kritischer Punkt, um sicher sein, eine Monoschicht, die eine intakte Barriereschicht darstellt verwenden….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren dieses Beitrags haben keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Materials
| CLEVIOS PH 1000 | HERAUS CLEVIOS | ||
| AZ9260 resin | CIPEC SPECIALITIES | ||
| Dodecylbenzenesulfonic acid (DBSA) | Acros Organic | ||
| 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS) | Sigma Aldrich | ||
| 24-well Suspended cell Culture insert Millicell PET 0.4 μm Millipore | Dominique dutscher | 51705 | |
| 24-well cell culture plate BD Falcon | Dominique dutscher | 51705 | |
| STERICUP-GP PES 0.22 μM | Dominique dutscher | 51246 | |
| ADVANCED DMEM Marque GIBCO | Fisher scientific | E3434T | |
| FBS HEAT INACT. S.AMERICAN | Fisher scientific | E3387M | |
| PENICILLIN STREPTOMYCIN | Fisher scientific | E3470C | |
| GLUTAMAX | Fisher scientific | E3524T | |
| TRYPSIN 0.05% EDTA | Fisher scientific | E3513N | |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma Aldrich | E4378 | |
| ETHYLENE GLYCOL, ANHYDROUS, 99.8%, | Sigma aldrich | ||
| Caco-2 cells | ATCC | ||
| PDMS | Dow corning | SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER | |
| Au (99.99%) | NEYCO | AU3X6 | |
| Chromium (99.95%) | NEYCO | ||
| Parylene C | Specialty Coating Systems | ||
| Ag/AgCl wire | HARVARD APPARATUS | ||
| Photoresist | CIPEC SPECIALITIES | Résine AZ9260 |
References
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