Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

उच्च थ्रूपुट/उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए अनुकूलित इंट्रासेलुलर माइकोबैक्टीरिया के क्वांटिफिकेशन के लिए एक सूक्ष्म फेनोटाइपिक परख

Published: January 17, 2014 doi: 10.3791/51114
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Inserm U1019 - CNRS UMR 8024, Institut Pasteur de Lille, Université de Lille
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम छोटे हस्तक्षेप सिंथेटिक आरएनए (सिरना), रासायनिक यौगिक, और Mycobacterium तपेदिक उत्परिवर्ती पुस्तकालयों के उच्च थ्रूपुट/उच्च सामग्री स्क्रीन के लिए लागू एक फेनोटाइपिक परख का वर्णन करते हैं । यह विधि फ्लोरोसेंटली लेबल वाले माइकोबैक्टीरियम तपेदिक का पता लगाने पर निर्भर करती है, जो स्वचालित कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके फ्लोरोसेंटली लेबल वाली मेजबान सेल है।

Abstract

चिकित्सा और वैक्सीन की उपलब्धता के बावजूद, तपेदिक (टीबी) दुनिया में सबसे घातक और व्यापक जीवाणु संक्रमण में से एक बना हुआ है । कई दशकों के बाद से, बहु और बड़े पैमाने पर दवा प्रतिरोधी उपभेदों के अचानक फट तपेदिक के नियंत्रण के लिए एक गंभीर खतरा है । इसलिए, तपेदिक के कारक एजेंट, माइकोबैक्टीरियम तपेदिक (एमटीबी)के लिए महत्वपूर्ण नए लक्ष्यों और रास्तों की पहचान करना और टीबी की दवाओं बनने वाले उपन्यास रसायनों की खोज करना आवश्यक है। एक दृष्टिकोण के लिए बड़े पैमाने पर पुस्तकालयों के आनुवंशिक और रासायनिक स्क्रीन के लिए उपयुक्त तरीकों की स्थापना के लिए एक घास का ढेर में एक सुई की खोज को सक्षम करने के लिए है । इस उद्देश्य के लिए, हमने स्वचालित कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके फ्लोरोसेंटली लेबल वाली मेजबान कोशिकाओं के भीतर फ्लोरोसेंटली लेबल एमटीबी का पता लगाने पर निर्भर एक फेनोटाइपिक परख विकसित की। यह इन विट्रो परख मेजबान में एमटीबी की उपनिवेशीकरण प्रक्रिया की एक छवि आधारित मात्राकरण की अनुमति देता है और 384-वेल माइक्रोप्लेट प्रारूप के लिए अनुकूलित किया गया था, जो सिरना-, रासायनिक यौगिक या एमटीबी उत्परिवर्ती-पुस्तकालयों की स्क्रीन के लिए उचित है। छवियों को तब मल्टीपैरामेट्रिक विश्लेषण के लिए संसाधित किया जाता है, जो मेजबान कोशिकाओं के भीतर एमटीबी के रोगजनन पर अनुमानित रूप से पढ़कर प्रदान करता है।

Introduction

पिछले वर्षों के दौरान रिपोर्ट किए गए उभरते और पुनः उभरते संक्रामक रोगजनकों में, माइकोबैक्टीरियम तपेदिक (एमटीबी)2011 (ग्लोबल तपेदिक रिपोर्ट 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/) में 1.4 मिलियन मौतों और 8.7 मिलियन नए संक्रमणों के लिए जिम्मेदार होने के लिए एक प्रमुख स्थान रखता है। मल्टीड्रग उपचारों की उपलब्धता के बावजूद, संक्रमित लोगों की संख्या अभी भी बढ़ रही है और मल्टीड्रग प्रतिरोधी (एमडीआर) के साथ-साथ बड़े पैमाने पर दवा प्रतिरोधी (एक्सडीआर) एमटीबी जल्दी से दुनिया भर में फैल रहे हैं1। इसके अलावा, जब एमटीबी एंटीजन की उपस्थिति को ध्यान में रखते हुए, यह स्पष्ट है कि वैश्विक आबादी का एक तिहाई एमटीबी द्वारा गुप्त रूप से संक्रमित माना जाता है। सांख्यिकीय रूप से, दस में से एक मामले में, बाद के नैदानिक लक्षणों के साथ रोग के सक्रिय रूप की दिशा में विकास होता है2। इसलिए एमटीबी से लड़ने के लिए नए साधनों की तत्काल जरूरत है । इस संदर्भ में, हमने स्वचालित कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी3द्वारा एमटीबी आक्रमण और मेजबान कोशिकाओं में गुणा की निगरानी पर निर्भर एक इन विट्रो विजुअल फेनोटाइपिक परख विकसित की। स्वचालित छवि अधिग्रहण और विश्लेषण के संयोजन में ३८४-अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेटों में परख के अनुकूलन, यौगिकों, siRNAs और जीवाणु म्यूटेंट के मध्यम पैमाने के पुस्तकालयों की उच्च सामग्री/उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग (HC/HTS) की अनुमति दी । इस फेनोटाइपिक परख पर जीनोम वाइड आरएनएआई पुस्तकालय की स्क्रीनिंग ने इस प्रकार एमटीबी तस्करी और इंट्रासेलुलर प्रतिकृति में शामिल प्रमुख मेजबान कारकों की पहचान को सक्षम किया, लेकिन कंद-कंद बेसिलस द्वारा शोषित मेजबान-रास्तों की स्पष्टता भी। इस विशेष फेनोटाइपिक परख का एक और अनुकूलन एमटीबी इंट्रा-फगोसोमल हठ के लिए आवश्यक जीवाणु कारकों की पहचान के लिए था। उदाहरण के लिए, फागोसोम परिपक्वता की गिरफ्तारी को प्रमुख तंत्रों में से एक माना जाता है जो मैक्रोफेज में एमटीबी के अस्तित्व और प्रतिकृति की सुविधा प्रदान करता है। फ्लोरोसेंटली लेबल-अम्लीय डिब्बों में एमटीबी नॉक आउट म्यूटेंट के उपकोशिक स्थानीयकरण की निगरानी जीवित रहने की प्रक्रिया में शामिल जीवाणु जीन की पहचान के लिए अनुमति दी4। अंत में, एमटीबी की उच्च सामग्री इमेजिंग भी इंट्रासेलुलर बैक्टीरियल ग्रोथ3जैसी विभिन्न घटनाओं को बाधित करने के लिए दवा दक्षता की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक उत्कृष्ट विधि प्रदान करती है। कुल मिलाकर, इस प्रकार की उच्च थ्रूपुट फेनोटाइपिक परख टीबी के खिलाफ दवा की खोज को तेज करने की अनुमति देती है और इन विभिन्न दृष्टिकोणों द्वारा एकत्र किए गए डेटा एमटीबीद्वारा लगाए गए मेजबान हेरफेर की बेहतर समझ में योगदान देते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. हाई-थ्रूपुट जीनोम-वाइड सिरना स्क्रीनिंग

स्क्रीनिंग एक मानव प्रकार-II न्यूमोसाइट्स मॉडल A549 सेल लाइन में एमटीबी H37Rv के साथ संक्रमण पर ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त करने में प्रदर्शन किया । इस प्रक्रिया को चित्र 1एमें रेखांकित किया गया है ।

  1. 4 माइक्रोन की एकाग्रता तक पहुंचने के लिए 1x सिरएनए बफर के साथ मां प्लेटों (96-अच्छी प्लेटों) में संग्रहीत सूखे सिरना पुस्तकालय को फिर से खर्च करें, फिर मिश्रण के 10 माइक्रोन को 384-अच्छी बेटी प्लेट (बेटी प्लेट 1) में स्थानांतरित करें।
  2. 2 गुना द्वारा सिरना को पतला करने के लिए बेटी प्लेट 1 में 1x सिराना बफर के 10 माइक्रोन जोड़ें। सिरना पुनर्पिति होने के बाद, प्लेटों को छीलने योग्य एल्यूमीनियम सील के साथ सील किया जाता है और कम से कम 6 महीने और 2-3 साल तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, लेकिन भंडारण समय सिरना पुस्तकालय निर्माता की सिफारिशों के आधार पर भिन्न हो सकता है।
  3. बेटी प्लेट 1 में तनु siRNAs बेटी की थाली 2 में ५०० एनएम की एकाग्रता तक पहुंचने के लिए । सिरना पुनर्पिति होने के बाद, प्लेटों को छीलने योग्य एल्यूमीनियम सील के साथ सील किया जाता है और कम से कम 6 महीने और 2-3 साल तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, लेकिन भंडारण समय सिरना पुस्तकालय निर्माता की सिफारिशों के आधार पर भिन्न हो सकता है।
  4. उपयोग से पहले, कमरे के तापमान पर गल बेटी प्लेट 2।
  5. बेटी की थाली 2 से सिरना के २.५ माइक्रोन ले लो और एक ३८४-अच्छी तरह से परख थाली में जगह है ।
  6. एक ही ३८४-अच्छी तरह से परख प्लेट में कदम १.५ में, अपने संबंधित कुओं के लिए २.५ माइक्रोन नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण सिरना जोड़ें ।
  7. 1x डी-पीबीएस में ट्रांसफैक्शन रीएजेंट को पतला करें ताकि प्रत्येक कुएं में 0.1 माइक्रोन ट्रांसफैक्शन रीएजेंट प्रदान करने के लिए पर्याप्त समाधान निकाला जा सके और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पतला ट्रांसफेक्शन समाधान को पूर्वघोटित किया जा सके।
  8. परख प्लेट में प्रत्येक अच्छी तरह से ट्रांसफैक्शन रिएजेंट/पीबीएस समाधान मिश्रण का 7.5 माइक्रोन जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  9. A549 कोशिकाओं के 40 माइक्रोन जोड़ें (1,500 कोशिकाओं/ 5% सीओ2वाले वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिन-इनक्यूबेशन अवधि के लिए कोशिकाओं को बनाए रखें। ये कोशिकाएं हर 24 घंटे में विभाजित होती हैं, इस प्रकार लगभग १२,००० कोशिकाएं ट्रांसफैक्शन के तीन दिन बाद कुओं में होती हैं ।
  10. दो सप्ताह पुराने GFP-व्यक्त Mtb H37Rv संस्कृति डी-पीबीएस के साथ बाहर धो (MgCl2 और CaCl2से मुक्त) 5 मिनट के लिए ४,००० एक्स जी पर अपकेंद्रित्र द्वारा और वॉश त्यागें । इस चरण को 3x दोहराएं। (GFP केलिए-एमटीबी H37Rv संस्कृति की स्थिति प्रोटोकॉल 3 देखें)।
  11. 10 मिलीलीटर आरपीएमआई 1640 माध्यम में बैक्टीरियल गोली को निलंबित करें, जिसमें 10% एफबीएस और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए डिकेंट के साथ पूरक किया जाता है ताकि बैक्टीरियल समुच्चय को तलछट की अनुमति दी जा सके।
  12. बैक्टीरियल सुपरनेट और उपाय OD600 (OD600 0.6-0.8 के बीच होना चाहिए) और GFP-फ्लोरेसेंस (RFU मूल्य) एक माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करने के लिए जीवाणु एकाग्रता निर्धारित करते हैं। एक ही परिस्थितियों में तैयार की गई एक और संस्कृति पर प्रयोग से पहले उत्पन्न किया गया था कि RFU मूल्य = एफ (CFU मूल्य) प्रदर्शित एक संदर्भ प्रतिगमन लाइन का उपयोग कर निलंबन के टिटर की गणना करें। 2.4 x 106 बैक्टीरिया/मिलीलीटर युक्त बैक्टीरियल सस्पेंशन तैयार करें, जो 5 की संक्रमण (एमओआई) की बहुलता से मेल खाता है।
  13. 384-अच्छी तरह से परख प्लेट में माध्यम निकालें और हौसले से तैयार बैक्टीरियल निलंबन के 25 माइक्रोन जोड़ें।
  14. 5% सीओ2वाले वातावरण में 5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 384-अच्छी परख प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  15. माध्यम निकालें और धीरे से 10% FBS 3x के साथ पूरक RPMI माध्यम के साथ कोशिकाओं को धो ।
  16. शेष बाह्य बैक्टीरिया को मारने के लिए, 5% सीओ2वाले वातावरण में 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 50 माइक्रोन/मिलीलीटर अमिकासिन युक्त ताजा आरपीएमआई-एफबीएस माध्यम के 50 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं का इलाज करें।
  17. मध्यम युक्त अमीकासिन को हटा दें और 10% एफबीएस के साथ ताजा आरपीएमआई माध्यम पूरक के 50 माइक्रोन जोड़ें। 5% सीओ2वाले वातावरण में 5 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 384-अच्छी परख प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  18. छवि अधिग्रहण से पहले, पीबीएस (अंतिम एकाग्रता 5 μg/ml) में DAPI के हौसले से तैयार 30 μg/मिलीलीटर के 10 माइक्रोन जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
  19. प्लेट को स्वचालित कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में लोड करें।

    बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
  20. एक्सपोजर पैरामीटर सेट करें। उत्सर्जन फिल्टर 450 एनएम और जीएफपी फ्लोरेसेंस के साथ एक्सटिटेशन लेजर 488 एनएम उत्सर्जन फिल्टर 520 एनएम के साथ एक्सट्रूइटेशन लेजर 405 एनएम का उपयोग करके रिकॉर्ड DAPI फ्लोरेसेंस।

    बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

    बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
  21. अधिग्रहीत किए जाने वाले प्रत्येक कुएं में कुओं और खेतों का चयन करें, जिसे तब लेआउट और सबलेआउट पैरामीटर के रूप में संदर्भित किया जाता है।

    बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

    बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
  22. चरण 1.20 और 1.21 से मापदंडों का उपयोग करके प्रयोग फ़ाइल उत्पन्न करें, और स्वचालित अधिग्रहण चलाएं।

    बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

    बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
  23. छवियों को रिमोट सर्वर पर स्थानांतरित करें।

    बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
  24. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवियों का मूल्यांकन करें। नाभिक का पता लगाने एल्गोरिथ्म और जीएफपी चैनल से बैक्टीरियल क्षेत्र का उपयोग करके डम्पी चैनल से सेल नाभिक का पता लगाएं पिक्सेल तीव्रता गुण एल्गोरिदम(चित्रा 4A)का उपयोग करके।

नोट: यह प्रोटोकॉल इंट्रासेलर एमटीबी वृद्धि पर जीन सिलने के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित है। एमटीबी एक धीमी गति से विकास वाला जीवाणु है जो इष्टतम परिस्थितियों में हर 20 घंटे को विभाजित करता है। संक्रमण के बाद 5 दिनों के बाद सेल लाइसिस के अभाव में एक्सट्रासेलुलर एमटीबी की मात्रा अभी भी कम है और विश्लेषण की गुणवत्ता को प्रभावित नहीं किया। इस प्रोटोकॉल को एंटीबायोटिक उपचार की लंबाई के संदर्भ में अनुकूलित किया जाना चाहिए और माइकोबैक्टीरिया स्मेग्मेटिस और एस्चेरिचिया कोलाई जैसे तेजी से विकास वाले बैक्टीरिया का उपयोग करके सिरर्ना स्क्रीन के लिए अनुकूलित होने के लिए समय इनक्यूबेशन किया जाना चाहिए जो बड़े पैमाने पर जारी किए जाते हैं और नई कोशिकाओं को संक्रमित कर सकते हैं।

2. हाई-थ्रूपुट कंपाउंड स्क्रीनिंग

स्क्रीनिंग एमटीबी H37Rv संक्रमित मेजबान कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया । इस प्रक्रिया को चित्र 1बीमें रेखांकित किया गया है ।

  1. गल 384-अच्छी तरह से मां प्लेटें यौगिक पुस्तकालय युक्त DMSO 100% में घुलनशील. 384-अच्छी बेटी प्लेटों में यौगिकों के 0.5 माइक्रोन को स्थानांतरित करें जिसमें 10% एफबीएस के साथ 1640 मध्यम पूरक आरपीएमआई के 10 माइक्रोन हैं।
  2. दो सप्ताह पुराने GFP-व्यक्त Mtb H37Rv संस्कृति डी-पीबीएस के साथ बाहर धो (MgCl2 और CaCl2से मुक्त) 5 मिनट के लिए ४,००० एक्स जी पर अपकेंद्रित्र द्वारा और वॉश त्यागें । इस चरण को 3x दोहराएं (जीएफपी के लिए-एमटीबी एच 37आरवी संस्कृति की स्थिति प्रोटोकॉल 3 देखें)।
  3. 10 मिलीलीटर आरपीएमआई 1640 माध्यम में बैक्टीरियल गोली को निलंबित करें, जिसमें 10% एफबीएस और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए डिकेंट के साथ पूरक किया जाता है ताकि बैक्टीरियल समुच्चय को तलछट की अनुमति दी जा सके।
  4. बैक्टीरियल सुपरनेट और उपाय OD600 (OD600 0.6-0.8 के बीच होना चाहिए) और GFP-फ्लोरेसेंस (RFU मूल्य) एक माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग कर लीजिए। प्रयोग से पहले उत्पन्न किए गए आरएफयू मूल्य = एफ (सीआईयू मूल्य) को प्रदर्शित करने वाली संदर्भ प्रतिगमन लाइन का उपयोग करके निलंबन के टिटर की गणना करें। विशिष्ट एकाग्रता 1 x 108 बैक्टीरिया/मिलीलीटर है।
  5. फसल 6 दिन पुराने प्राथमिक मानव मैक्रोफेज 4 x 10में 5 कोशिकाओं/मिलीलीटर RPMI १६४० मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और ५० एनजी/ml recombinant मानव एम-CSF के साथ पूरक (मानव परिधीय रक्त मोनोसाइट कोशिकाओं शुद्धि और मैक्रोफेज भेदभाव के लिए प्रोटोकॉल 4 देखें) ।
  6. विभिन्न एमओआई में बेसिली के साथ पतला प्राथमिक कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, 1-5 से लेकर, निलंबन में 90 आरपीएम पर हल्के झटकों के साथ 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर।
  7. एक्सट्रासेलुलर बैक्टीरिया को हटाने के लिए 350 x g पर अपकेंद्रित्र द्वारा संक्रमित कोशिकाओं को धोएं। प्रत्येक अपकेंद्रित्र कदम के बाद, आरपीएमआई 1640 मध्यम में गोली को 10% एफबीएस के साथ पुन: खर्च करें। इस चरण को 2x दोहराएं।
  8. आरपीएमआई 1640 मीडियम में संक्रमित कोशिकाओं को 10% एफबीएस और अमीकासिन के साथ 50 माइक्रोग्राम/एमएल पर सस्पेंड करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटा के लिए हल्के झटकों के साथ सस्पेंशन को इनक्यूबेट करें।
  9. 350 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा अमीकासिन युक्त कोशिका-संस्कृति माध्यम को हटाएं और संक्रमित कोशिकाओं को पूर्ण आरपीएमआई 1640 माध्यम के साथ धोएं जो 10% एफबीएस और 50 एनजी/एमएल रिकॉम्बिनेंट मानव एम-सीएसएफ के साथ पूरक हैं। एक बार दोहराएं।
  10. स्टेप 2.1 में एक ही परख प्लेट में संक्रमित मैक्रोफेज सस्पेंशन का 40 माइक्रोन जोड़ें, जिसमें पहले से ही यौगिक कमजोर पड़ने के 10 माइक्रोन होते हैं। प्रत्येक कुएं में डीएमएसओ की अंतिम एकाग्रता अब 1% तक पहुंच गई है।
  11. 5% सीओ2वाले वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों के लिए परख प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
  12. कोशिका-पारमींत दूर लाल फ्लोरोसेंट डाई के साथ जीवित कोशिकाओं को दाग।
  13. प्लेट को स्वचालित कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में लोड करें।

    बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
  14. एक्सपोजर पैरामीटर सेट करें। उत्सर्जन फिल्टर 520 एनएम के साथ एक्सिटेशन लेजर 488 एनएम का उपयोग करके उत्सर्जन फिल्टर 690 एनएम और जीएफपी फ्लोरेसेंस के साथ एक्सट्रक्टेशन लेजर 640 एनएम का उपयोग करके सुदूर-लाल फ्लोरेसेंस रिकॉर्ड करें।

    बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

    बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
  15. अधिग्रहीत किए जाने वाले प्रत्येक कुएं में कुओं और खेतों का चयन करें, जिसे तब लेआउट और सबलेआउट पैरामीटर के रूप में संदर्भित किया जाता है।

    बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

    बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
  16. चरण 2.14 और 2.15 से मापदंडों का उपयोग करके प्रयोग फ़ाइल उत्पन्न करें और स्वचालित अधिग्रहण चलाएं।

    बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

    बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
  17. छवियों को रिमोट सर्वर पर स्थानांतरित करें।

    बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
  18. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवियों का मूल्यांकन करें। पिक्सेल तीव्रता गुण एल्गोरिदम(चित्रा 4B)का उपयोग करके जीएफपी चैनल से पिक्सेल तीव्रता गुण एल्गोरिदम और बैक्टीरियल क्षेत्र का उपयोग करके दूर-लाल चैनल से सेल क्षेत्र का पता लगाएं।

नोट: इस प्रोटोकॉल को फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एक अच्छी तरह से/ 4)फ्लोरोसेंट म्यूटेंट को पहले कुओं में वरीयता प्राप्त किया जाता है (प्रति अच्छी तरह बैक्टीरियल निलंबन का 20 माइक्रोन)। बैक्टीरिया तो सेल निलंबन के 30 माइक्रोन द्वारा बरामद कर रहे हैं । 1 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र के बाद, प्लेट को 5% सीओ2वाले वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड किया जाता है। इनक्यूबेशन समय और एमओआई परख पर निर्भर करता है। एक उदाहरण के रूप में, फगोसोम एसिडिफिकेशन जैसी शुरुआती सेलुलर घटनाओं के दृश्य के लिए, कोशिकाओं को 1-20 से लेकर एमओआई के साथ 2 घंटे के लिए संक्रमित किया जा सकता है। लाइसोसोम्स को 5% सीओ 2 वाले वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 घंटे के लिए 2 माइक्रोन पर लाइसोट्रैकर डाई का उपयोग करके दाग दिया जाता है और फिर 10% फॉर्मेलिन या 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ तय कियाजाता है। कॉन्फोकल छवियों का अधिग्रहण किया जाता है और अंत में लाइसोसोम्स डिटेक्शन और उपकोशिकीय स्थानीयकरण 4 के लिए उपयुक्त एल्गोरिदम की विशेषता वाली छवि विश्लेषण लिपियों का उपयोग करके विश्लेषण कियाजाताहै।

3. ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक्सप्रेसिंग माइकोबैक्टीरियम तपेदिक H37Rv (GFP-H37Rv) संस्कृति की स्थिति

लंबी अवधि के भंडारण के लिए, जीएफपी-एच37आरवी डी-पीबीएस (लगभग 1 x 10 8 माइकोबैक्टीरिया प्रति शीशी) में जमेहुए थे।

  1. एक Erlenmeyer फ्लास्क में GFP-H37Rv के एक जमे हुए शेयर शीशी Resuspend मिडलब्रुक OADC संवर्धन 10%, ग्लाइसरोल 0.5%, ट्वीन-80 0.05%, और हाइग्रोमाइसिन बी (50 μg/ml) के साथ पूरक 7H9 शोरबा मध्यम के 50 मिलीलीटर युक्त।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 8 दिन इनक्यूबेट करें।
  3. GFP-H37Rv संस्कृति के ओडी600 उपाय।
  4. GFP-H37Rv संस्कृति को पतला करने के लिए ताजा 7H9 शोरबा मध्यम मिडलब्रुक OADC संवर्धन 10%, ग्लिसरोल ०.५%, ट्वीन-८० ०.०५% और Hygromycin B (५० g/ml) के साथ पूरक में OD600 = 0.1 प्राप्त करने के लिए ।
  5. परख के लिए उपयोग करने से पहले 8 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर GFP-H37Rv को इनक्यूबेट करें।

4. मानव परिधीय रक्त मोनोसाइट कोशिकाओं पूरे रक्त या बफी-कोट तैयारी से शुद्धि

  1. 1x डी-पीबीएस (एमजीसीएल 2 और सीएसीएल2 से मुक्त) में रक्त पाउच2xको पतला करें जिसमें 1% एफबीएस होता है।
  2. 20 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर फिकोल घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र अपकेंद्रित्र द्वारा मोनोसाइट्स को अलग करें।
  3. इक्का-दुक्का मोनोसाइट्स ले लीजिए।
  4. मोनोसाइट्स 3x को 1x डी-पीबीएस (एमजीसीएल2 और सीएसीएल2से मुक्त) के साथ धोएं जिसमें 1% एफबीएस 100 एक्स ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए होता है।
  5. कोशिकाओं को 1 x 107 सेल/एमएल तक केंद्रित करें।
  6. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार सीडी 14-चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके मोनोसाइट्स को शुद्ध करें (सामग्री देखें)।
  7. CD14-मोनोसाइट्स शुद्धिकरण के बाद, आरपीएमआई 1640 में 1.5 x10 6 सेल/एमएल पर कोशिकाओं को बीज 10% एफबीएस और 40 एनजी/एमएल मानव मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक फैक्टर (एचएम-सीएसएफ) के साथ पूरित किया गया और 5% CO2वाले वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 दिनों के लिए इनक्यूबेटेड किया गया।
  8. 4 दिनों के बाद नए आरपीएमआई 1640 के साथ माध्यम की जगह 10% एफबीएस और 40 एनजी/मिलीलीटर एलएम-सीएसएफ के साथ पूरित और 5% सीओ 2 वाले वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर2दिनों के लिए इनक्यूबेटेड।
  9. 6 दिनों के बाद, कोशिकाओं को परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

उच्च थ्रूपुट जीनोम-वाइड सिरना स्क्रीनिंग

एमटीबी विट्रो में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ-साथ कई अन्य फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं को उपनिवेश बनाने में सक्षम है। उदाहरण के लिए, एमटीबीA549 एपिथेलियल कोशिकाओं को संक्रमित और नुकसान पहुंचाने में सक्षम है जो आमतौर पर मानव प्रकार II न्यूमोसाइट्स5-7के लिए एक मॉडल के रूप में उपयोग किए जाते हैं। डेप्टिन-1 को एमटीबी तेज में शामिल एक मेजबान सेल रिसेप्टर के रूप में सूचित किया गया था, जो A549 कोशिकाओं8में इंट्रासेलुलर माइकोबैक्टीरियल वृद्धि पर प्रोइनफ्लेमेटरी प्रतिक्रिया और जीवाणुरोधी प्रभाव था। प्रोटोकॉल 1 में वर्णित सिरर्ना स्थिति ने 85% चुप्पी दक्षता (डेटा नहीं दिखाया गया) का नेतृत्व किया। सिरना के साथ डेकिन-1 अभिव्यक्ति को सील करने से A549 कोशिकाओं में इंट्रासेलर माइकोबैक्टीरिया राशि की कमी हुई। दरअसल, मुंह बंद करने के 3 दिनों और संक्रमण के 5 दिनों के बाद, संक्रमित कोशिकाओं का प्रतिशत दो बार डेटिन-1 खामोश A549 कोशिकाओं में कम हो जाता है, जो गैर-लक्षित हाथापाई सिरना(आंकड़े 2A और 2B)से संक्रमित कोशिकाओं की तुलना में है । हमने जेड-स्कोर को परिभाषित करने के लिए हाथापाई की तुलना में सिरना लक्षित डेटिन-1 का नमूना-आधारित सामान्यीकरण लागू किया। जैसा कि चित्रा 2Cमें दिखाया गया है, हमने सिर्ना लक्षित डेटिन-1 के लिए लगभग -15 जेड-स्कोर औसत प्राप्त किया। डेप्टिन-1 का उपयोग सिरर्ना स्क्रीन के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जा सकता है ताकि न्यूमोसाइट्स में एमटीबी उपनिवेशीकरण में शामिल अन्य उपन्यास मेजबान कारक की खोज की जा सके जिसमें डेप्टिन सिरना के साथ एक ही फेनोटाइप हो सकता है। स्क्रीन के दौरान प्रत्येक माइक्रोप्लेट पर नियंत्रण के रूप में फेनोटाइप पर प्रभाव ी सिर्ना का उपयोग प्रत्येक प्लेट को सामान्य बनाने की अनुमति देता है, जो तब उपयोगी होता है जब कोई पूरे जीनोम स्क्रीन विश्लेषण करना चाहता है। सांख्यिकीय पैरामीटर जेड ' हाथापाई और सिरना लक्षित Dectin1 पर नियंत्रण आधारित सामान्यीकरण का उपयोग कर 0.1 था, जो सिरना स्क्रीनिंग डेटा के सत्यापन के लिए एक स्वीकार्य मूल्य है।

उच्च सामग्री यौगिक स्क्रीनिंग

इंट्रासेलुलर बैक्टीरियल विकास पर यौगिक दक्षता का मूल्यांकन एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र (डीआरसी) स्थापित करके किया जाता है और संदर्भ सकारात्मक यौगिक और नकारात्मक यौगिक विलायक नियंत्रणों को सामान्य बनाया जाता है। एमटीबी विकास के खिलाफ सक्रिय दो संदर्भ यौगिकों, आइसोनियाजिड (आईएनएएच) और रिफाम्पिकिन (आरआईएफ) के प्रतिनिधि डीआरसी को चित्र 3में दिखाया गया है। ये घटता मानव प्राथमिक मैक्रोफेज में प्राप्त होते हैं जो जीएफपी-एक्सप्रेसिंग एमटीबी एच 37आरवी स्ट्रेन से संक्रमित होते हैं, जिसमें संक्रमण के बाद 5 दिनों के बाद रीडआउट होता है। क्रमशः 1% और 0.1 μg/ml की अंतिम एकाग्रता पर DMSO और INH आमतौर पर नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है, दक्षता के बेसल स्तर प्रदान (0 और 100%) (चित्रा 3A)। चित्र 4बीमें विस्तृत छवि विश्लेषण प्रक्रिया के बाद, मल्टीपैरामेट्रिक डेटा स्वचालित कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा लिए गए संक्रमित-मानव मैक्रोफेज की कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस छवियों से निकाले जाते हैं। मेजबान कोशिकाओं में एमटीबी की इंट्रासेलुलर प्रतिकृति पर प्रभाव तेहुए सक्रिय यौगिकों के कारण माइकोबैक्टीरियल लोड की कमी हुई, जो चित्रों(चित्र 3बी)पर कोशिकाओं में जीएफपी सिग्नल के क्षेत्र से मेल खाती है। इमेज-आधारित विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके गणना किए गए इंट्रासेलुलर बैक्टीरियल क्षेत्र और कुल सेल क्षेत्र के बीच अनुपात को यौगिक एकाग्रता के कार्य में प्लॉट किया जाता है, जो डीआरसी(चित्रा 3 बी)उत्पन्न करता है। ये घटता बैक्टीरियल लोड को 50%(आईसी50) तक कम करने के लिए आवश्यक एकाग्रता दोनों के निर्धारण की अनुमति देते हैं और बैक्टीरियल प्रतिकृति (एमआईसी 99)(चित्र 3 सी)के99%को बाधित करने के लिए आवश्यक न्यूनतम एकाग्रता। नियंत्रण डीएमएसओ 1% और नियंत्रण 0.1 माइक्रोन/एमएल पर आधारित जेड 0.49 था। यह जेड', वास्तव में 0.5 के करीब, इस परख को मान्य करने के लिए स्वीकार्य है।

Figure 1
चित्रा 1. दृश्य उच्च सामग्री स्क्रीनिंग दृष्टिकोण। एमटीबी संक्रमण मॉडल प्रणाली का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व जो सिरना(ए),रासायनिक यौगिकों(बी)और एमटीबी म्यूटेंट(सी)स्क्रीन के लिए उपयोग किया जाता है। (A)सिरना लाइब्रेरी स्क्रीन: रिवर्स ट्रांसफैक्शन विधि का उपयोग करके कोशिकाओं को 384-अच्छी प्लेटों में 3 दिनों के लिए सिरना से संक्रमित किया गया था। सिरना संक्रमित कोशिकाओंGFP-एमटीबी से संक्रमित थे और 5% सीओ 2 वाले वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर5दिनों के लिए इनक्यूबेटेड थे। कोशिकाओं को तब दाग दिया गया था और छवियों को एक स्वचालित कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एकत्र किया गया था। (ख)यौगिक पुस्तकालय स्क्रीन: यौगिकों को ३८४-अच्छी प्लेटों में वितरित किया गया था । सेल सस्पेंशन और जीएफपीएमटीबी को 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए एक साथ इनक्यूबेटेड किया गया था। संक्रमित कोशिकाओं को प्लेटों में वरीयता दी जाती थी और 5% सीओ 2 वाले वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों के लिए इनक्यूबेटेड कियाजाताथा। कोशिकाओं को तब दाग दिया गया था और छवियों को एक स्वचालित कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एकत्र किया गया था। (ग)फ्लोरोसेंट-एमटीबी उत्परिवर्ती पुस्तकालय: फ्लोरोसेंट एमटीबी म्यूटेंट को 384-वेल प्लेटों में वरीयता दी गई थी और मेजबान सेल निलंबन वितरित किया गया था। इनक्यूबेशन समय परख के आधार पर विविध। स्वचालित छवि अधिग्रहण से पहले कोशिकाओं या सेलुलर वेसिकल्स को दाग दिया गया था। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2। ए549 कोशिकाओं में एमटीबी उपनिवेशीकरण पर डेटिन-1 चुप्पी प्रभाव। (A)A549 कोशिकाओं के प्रतिनिधि कॉन्फोकल इमेज (10X एयर लेंस) गैर-लक्षित सिरना (हाथापाई) से संक्रमित या डेटिन-1 के लिए विशिष्ट सिरना के साथ और 5 दिनों के लिए जीएफपी-एमटीबी एच37आरवी (एमओआई5) से संक्रमित। स्केल बार 200 माइक्रोन (ए)जीएफपी-एमटीबी एच37आरवी का प्रतिनिधित्व करता है, हरे रंग में कल्पना की गई थी और लाल रंग में कोशिकाओं को। कोशिकाओं की संख्या(ए सेल डिटेक्शन) और इंट्रासेल्युलर जीएफपी-एमटीबी एच37आरवी लोड(ए बैक्टीरियल एरिया) का निर्धारण इमेज बेस्ड एनालिसिस सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल करके किया गया । (ख)हाथापाई सिरना (ब्लू सर्कल) और डेटिन-1 सिरना (लाल हलकों) के 5 प्रतिकृति (w1 से w5) में संक्रमित A549 कोशिकाओं के प्रतिशत का ग्राफिक प्रतिनिधित्व । (C)हाथापाई सिरना और डेटिन-1 सिरना के जेड-स्कोर औसत का ग्राफिक प्रतिनिधित्व । (*** पी-वैल्यू 0.0001 <) । बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3। मानव मैक्रोफेज में एमटीबी के खिलाफ सक्रिय संदर्भ यौगिकों की खुराक प्रतिक्रिया वक्र। (ए और बी)मानव मैक्रोफेज (लाल फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल की लाल, सेल) की प्रतिनिधि कॉन्फोकल इमेज (20X वॉटर लेंस) 5 दिनों के लिए MOI1 के साथ GFP-एमटीबी एच37आरवी (ग्रीन) से संक्रमित । स्केल बार 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। (A)में सेकस में नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किए जाने वाले डीएमएसओ 1% के साथ संक्रमित कोशिकाओं की छवियां। (ख)संक्रमित कोशिकाओं की छवियां दो संदर्भ यौगिकों आइसोनजिड (आईएनएएच) और रिफम्पिकिन (आरआईएफ) की बढ़ती एकाग्रता के साथ इनक्यूबेटेड होती हैं । (C)आईएनएएच और आरआईएफ के डोज-रिस्पांस वक्र्स (डीआरसी) । छवि आधारित विश्लेषण प्रत्येक यौगिक परीक्षण के लिए डीआरसी के निर्धारण की अनुमति दी । डीआरसी यौगिक एकाग्रता (लॉग स्केल, एक्स-एक्सिस) के कार्य में इंट्रासेलुलर जीएफपी-बैक्टीरियल क्षेत्र और कुल सेल क्षेत्र (वाई एक्सिस) के बीच अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है। प्रत्येक ग्राफ में, यौगिक के डीआरसी को नकारात्मक नियंत्रण डीएमएसओ 1% (0% अवरोध) और सकारात्मक नियंत्रण आईएमएच को 0.1 माइक्रोन/एमएल (100% अवरोध) की एकाग्रता पर सामान्यीकृत किया गया था। प्रत्येक यौगिक के लिए, बैक्टीरियल उपनिवेशीकरण (आईसी 50) और न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी99)के50%को बाधित करने के लिए आवश्यक एकाग्रता की गणना डीआरसी से की गई थी। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4. फ्लोरोसेंट इंट्रासेलुलर माइकोबैक्टीरिया निर्धारित करने के लिए मानक छवि-आधारित विश्लेषण। 384-अच्छी प्लेटों से छवियां एक स्वचालित कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त की गई थीं। इस मामले में, एक ही कुएं (फ़ील्ड) की 4 अलग-अलग छवियां दर्ज की गई थीं। प्रत्येक क्षेत्र का विश्लेषण छवि आधारित विश्लेषण सॉफ्टवेयर अकैपेला 2.6 (पर्किन एल्मर) का उपयोग करके किया गया था। (क)प्रत्येक क्षेत्र में दो चैनल (दो रंग), बैक्टीरिया (हरे) के लिए एक और कोशिका नाभिक (ब्लू चैनल) के लिए एक, जो निम्नलिखित एल्गोरिदम का उपयोग करके खंडित किए गए थे: i)न्यूक्लियी डिटेक्शन एक अंतर्निहित अकापेला प्रक्रिया का उपयोग करके, ii)साइटोप्लाज्म डिटेक्शन, नाभिक आबादी के आधार पर, एक अंतर्निहित अकापेला प्रक्रिया का उपयोग करके, iii)बैक्टीरिया का पता लगाना केवल पिक्सेल रखने से जो तीव्रता मैन्युअल रूप से परिभाषित सीमा से अधिक होती है, चतुर्थ)संक्रमित कोशिकाओं की पहचान करने के लिए बैक्टीरिया की स्थिति के साथ कोशिकाओं की स्थिति को मिलाकर। अंतिम परिणाम, चार क्षेत्रों के औसत के रूप में व्यक्त, कुल जीवाणु क्षेत्र, कोशिका की कुल संख्या, संक्रमित कोशिकाओं का प्रतिशत और प्रति कोशिका जीवाणु क्षेत्र (सभी संक्रमित कोशिकाओं का औसत) हैं । (ख)प्रत्येक क्षेत्र में दो चैनल होते थे, एक बैक्टीरिया (ग्रीन चैनल) के लिए और एक सेल नाभिक और साइटोप्लाज्म (सुदूर-लाल चैनल) के लिए, जिन्हें निम्नलिखित एल्गोरिदम का उपयोग करके खंडित किया गया था: i)एक एंटी-मीडियन फिल्टर का उपयोग करके मूल चैनल को फ़िल्टर करना, ii)केवल पिक्सेल को ध्यान में रखते हुए जो तीव्रता मैन्युअल रूप से परिभाषित सीमा से अधिक होती है (प्रत्येक चैनल की अपनी सीमा होती है), iii)प्रत्येक चैनल के लिए पिक्सेल की शेष संख्या की गिनती, iv)चैनलों को विलय करना और इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया को निर्धारित करने के लिए बैक्टीरिया और नाभिक दोनों द्वारा साझा पिक्सेल की संख्या की गणना करना। अंतिम परिणाम, चार क्षेत्रों के औसत के रूप में व्यक्त, कुल जीवाणु क्षेत्र, कुल सेलुलर क्षेत्र, इंट्रासेलर बैक्टीरिया का कुल क्षेत्रफल और इंट्रासेलुलर बैक्टीरियल क्षेत्र और कोशिकाओं के कुल क्षेत्र के बीच अनुपात हैं । बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

हम यहां एक phenotypic परख के लिए आवश्यक तरीकों का वर्णन एक GFP-व्यक्त Mtb H37Rv तनाव का उपयोग करने के लिए फ्लोरोसेंटी लेबल मेजबान कोशिकाओं को संक्रमित है, जो यह उच्च सामग्री के लिए उपयुक्त बनाता है/ इस प्रोटोकॉल को यौगिकों, फ्लोरोसेंट जांच और एमटीबी म्यूटेंट की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू किया जा सकता है। ऊपर वर्णित प्रत्येक प्रोटोकॉल के लिए, छवि अधिग्रहण से पहले निर्धारण और इम्यूनोबेलिंग कदम किए जा सकते हैं। हम छवियों को प्राप्त करने के लिए 20X (एनए 0.70) या 60X (एनए 1.2) वॉटर लेंस से लैस एक स्वचालित फ्लोरोसेंट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हैं। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप 405, 488, 561 और 640 एनएम एक्सटिटेशन लेजर से लैस है। उत्सर्जित फ्लोरेसेंस को 450-690 एनएम से लेकर डिटेक्शन तरंगदैर्ध्य को कवर करने वाले फिल्टर के एक सेट से जुड़े 3 कैमरों का उपयोग करके कैप्चर किया जाता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि माइक्रोस्कोप उत्तेजन और उत्सर्जन सेटिंग्स का समायोजन प्रत्येक प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले रंगों या फ्लोरोक्रोम के प्रकार पर निर्भर करता है। फेनोटाइपिक परख के लिए, DAPI या Hoechst आमतौर पर 10 मिनट के लिए 5 μg/ml पर प्रयोग किया जाता है नाभिक दाग । हालांकि, कोशिकाओं को साइटोप्लाज्म, झिल्ली या साइटोस्केलेटन का पता लगाने के लिए विशिष्ट विभिन्न फ्लोरोसेंट रंगों के साथ भी दाग दिया जा सकता है। छवि अधिग्रहण के बाद, चित्रों का विश्लेषण छवि-आधारित विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया जाना चाहिए। प्रत्येक पिक्सेल की तीव्रता के आधार पर कोशिकाओं के विभाजन एल्गोरिदम का उपयोग क्रमशः कोशिकाओं की संख्या या इंट्रासेलुलर बैक्टीरियल क्षेत्र (चित्र 4देखें) का पता लगाने के लिए किया जाना चाहिए। उत्पन्न डेटा को सांख्यिकीय आधारित स्वीकृति मानदंडों के खिलाफ तौला जाना चाहिए ताकि परख की मजबूती और सटीकता को मान्य किया जा सके।

बड़े पैमाने पर उच्च थ्रूपुट स्क्रीन समय और संसाधन लेने वाले प्रयोग हैं। इसलिए, परख की उपयुक्तता का पहले से आकलन करना प्रमुख महत्व का है। फेनोटाइपिक स्क्रीन से एकत्र किए गए डेटा को एक्सेल जैसे स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर का उपयोग करके कल्पना की गई थी और आम तौर पर प्रति प्लेट सामान्यीकृत किया जाता था। सिरना और छोटे अणुओं की स्क्रीन दोनों के लिए उपयोग की जाने वाली सबसे आम गुणवत्ता वाले मैट्रिक्स जेड है। जेड को सकारात्मक और नकारात्मक दोनों नियंत्रणों के मतलब और मानक विचलन के साथ परिभाषित किया गया है9. जेड मात्रा क्या परख प्रतिक्रिया नमूनों की एक पूर्ण पैमाने पर स्क्रीन के लिए अपने आवेदन को मान्य करने के लिए काफी बड़ा है । जेड की सीमा 1 के लिए नकारात्मक अनंत है, एक बहुत अच्छा परख के रूप में >०.५ के साथ, >० एक स्वीकार्य परख और <० एक अस्वीकार्य परख । छोटे-अणु स्क्रीन की तुलना में जिसके लिए नियंत्रण की ताकत जेड > 0.5 के साथ परख के सत्यापन की अनुमति देती है, सिरना स्क्रीन की परिवर्तनशीलता जेड को प्रभावित करती है जो कम होती है (अक्सर 0.0-0.5 के बीच)10। दरअसल, सिरना स्क्रीन की सफलता कोशिकाओं में सिरना डिलीवरी की दक्षता के अनुकूलन पर निर्भर करती है, ii) ट्रांसफैक्शन द्वारा प्रेरित साइटोटॉक्सिकिटी और iii)जीन साइलेंसिंग की दक्षता के लिए परख की स्थिति। सिरना को निर्माता के ट्रांसफेक्शन प्रोटोकॉल के बाद हेला जैसी विभिन्न सेल लाइनों में आसानी से संक्रमित किया जा सकता है, लेकिन मैक्रोफेज सहित कुछ सेल लाइनों में कुशल सिराना ट्रांसफैक्शन अभी भी एक चुनौती बनी हुई है। फिर भी, वायरल वेक्टर-शॉर्ट हेयरपिन RNAs (shRNA) की मध्यस्थता अभिव्यक्ति एक अच्छा विकल्प11का प्रतिनिधित्व कर सकता है । व्याख्या की कठिनाई से बचने के लिए, सिरना स्क्रीन से एकत्र किए गए डेटा को प्रत्येक बिंदु10,12के लिए जेड-स्कोर (जिसे जेड-वैल्यू भी कहा जाता है) को परिभाषित करने के लिए सामान्य मानक वितरण के सापेक्ष अक्सर सामान्य रूप से सामान्य किया जाता है। फिर, हिट-नमूनों को जेड-स्कोर के अनुसार स्थान दिया गया था जो आमतौर पर -2 से कम या + 2 से अधिक के अंतर्गत आता है। अंत में, प्राथमिक स्क्रीन में चयनित हिट को प्राथमिक स्क्रीन में मनाए गए फेनोटाइप की पुष्टि करने के लिए अधिक प्रतिकृति सहित माध्यमिक स्क्रीन में पुन: परीक्षण किया गया था।

हमारे प्रोटोकॉल आसानी से उपकरणों के साथ छोटे पैमाने पर स्क्रीन के लिए लागू किया जा सकता है । इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, सूक्ष्म-टाइटर प्लेटों में परख लघुकरण और अणुओं के पुस्तकालय में हेरफेर संरक्षण, वितरण और मिश्रण की प्रक्रिया को अनुकूलित करने के लिए आवश्यक हैं13। इसके अलावा, माइक्रो-टाइटर प्लेटों में परख की स्थिति को सही और पुन: नियंत्रित करने के लिए डिस्पेंसर सहित एक स्वचालित रोबोटिक प्लेटफॉर्म का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग (एचटीएस) द्वारा उत्पादित डेटा की भारी मात्रा को डेटाबेस द्वारा भी प्रबंधित किया जाना चाहिए और कॉन्फोकल पिक्चर, डेटा स्टोरेज और ट्रांसफर के छवि विश्लेषण के लिए एक अनुकूलित पाइपलाइन । इस रिपोर्ट में प्रस्तुत परख बायोसेफ्टी लेवल 3 सुविधा (बीएसएल 3) में किया गया था। बीएसएल3 में सुरक्षा का कड़ाई से पालन करने से स्क्रीन की दिक्कत बढ़ जाती है। दरअसल, स्क्रीन के लिए आवश्यक कई उपकरण BSL3 में उपलब्ध होना चाहिए और कार्यकर्ता और पर्यावरण को संदूषण से बचाने के लिए अलग-थलग पड़ जाते हैं । इसलिए बीएसएल 3 में अनुकूलित पाइपलाइन की स्थापना के लिए काफी जगह की जरूरत थी। इस कारण से, हमारे प्रोटोकॉल को बीसीएल 3 जैसे सिरर्ना ट्रांसफैक्शन और प्लेटों में यौगिक हस्तांतरण के लिए अधिकतम कदम उठाने के लिए विकसित किया गया था। छवि अधिग्रहण चरणों के माध्यम से सेल संक्रमण BSL3 स्थितियों में किया गया। छवियों को तब एक समर्पित सर्वर में स्थानांतरित कर दिया गया था और बीएसएल 3 से विश्लेषण किया गया था।

यहां वर्णित फेनोटाइपिक परख छवि विश्लेषण के दो तरीकों(चित्र 4)पर आधारित थी। पहली विधि, सिरना स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया, संक्रमित कोशिकाओं की संख्या देने के लिए डिजाइन किया गया था । यह पैरामीटर एमटीबी इंट्रासेलर प्रतिकृति पर जीन सिलने के प्रभाव की कुशलतापूर्वक तुलना करने के लिए पाया गया था। हालांकि, स्क्रीनिंग यौगिकों, कोशिकाओं के कुल क्षेत्र के आधार पर एक और अधिक बुनियादी पढ़ने के बाहर स्पष्ट रूप से सक्रिय यौगिकों की पहचान करने के लिए पर्याप्त था । चूंकि यह दूसरी विधि तेजी से और लागू करने में आसान है, इसलिए इसे यौगिकों की स्क्रीनिंग से उत्पन्न छवियों के विश्लेषण के लिए पसंद किया गया था। आगे जाने के लिए, अधिक फ्लोरोसेंट रंगों और/या लेबलिंग जांच को जोड़ा जा सकता है और इमेज एनालिसिस लिपियों को कोलोकैलाइजेशन, न्यूक्लियी और सेल मॉर्फोलॉजी, सेल डेथ, बैक्टीरिया एकत्रीकरण, साथ ही बैक्टीरिया के इंट्रासेलुलर ट्रैफिकिंग जैसे मल्टीपैरामेट्रिक डेटा जेनरेट करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इंट्रासेलुलर ट्रैफिकिंग या कोलोकैलाइजेशन परख के लिए, संचयी मूल्यांकन लागू करने के लिए जेड-स्टैक प्राप्त करना आवश्यक है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

हितों का कोई टकराव घोषित नहीं किया गया ।

Acknowledgments

इस काम के लिए वित्तीय सहायता यूरोपीय समुदाय (ईआरसी-एसटीजी इंट्रासेल्टबी ग्रांट एन ° 260901, एमएम4बीबी ग्रांट एन ° 260872), एग्नेस नेशनल डी रेचेचे, फेडरर (12001407 (डी-अल) इक्विटेक्स इमेजेक्स इमेजेक्स बायोमेड) और क्षेत्र नोर्ड पास डी कैलैस द्वारा प्रदान की गई थी। हम मंच BICeL से Gaspard Deloison, एलिजाबेथ Werkmeister, एंटोनिनो बोनियोवानी और फ्रैंक Lafont की तकनीकी सहायता को कृतज्ञता से स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µclear-plate black, 384-well Greiner Bio-One 781091 127.8/86/15 MM with Lid, TC treated
CellCarrier 384-well plate PerkinElmer 6007550 Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated
V-bottom white, 384-well plate Greiner Bio-One 781280  
sealing tape, breathable, sterile Corning 3345  
Lipofectamine RNAiMax Life Technologies 13778150 Transfection reagent
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich 34943  
RPMI 1640 + GlutaMAX-I Life Technologies 61870-010 Cell culture medium
D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2 Life Technologies 14190-094 Dulbecco's Phosphate Salin Buffer
D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2 Life Technologies 14190-091 Dulbecco's Phosphate Salin Buffer
Fetal bovine serum Life Technologies 2610040-79  
Ficoll Paque PLUS Dutscher 17-1440-03 Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification
CD14 MicroBeads, human Miltenyi 130-050-201 Purification of CD14+ Monocytes
Human M-CSF, premium gr. (1000 μg) Miltenyi 130-096-493 Macrophage Colony Stimulating Factor
LS Columns Miltenyi 130-042-401 Columns for CD14+ Monocytes isolation
Tween 80 Euromedex 2002-A Mycobacteria culture
Glycerol high purity  Euromedex 50405-EX Mycobacteria culture
 Middlebrook OADC enrichment Becton-Dickinson 211886 Mycobacteria culture
7H9 Becton-Dickinson W1701P Mycobacteria culture
Versene 1x Life Technologies 15040033 Nonenzymatic cell dissociation solution
DAPI Life Technologies D1306 Nuclei dye
Hoechst 33342 Life Technologies H3570 Nuclei dye
Syto60 Life Technologies S11342 Nuclei/cytoplasm dye
Formalin Sigma-Aldrich HT5014 Cell fixation solution
siRNA targeting Dectin-1 Santa-Cruz sc-63276  
*siGenome* Nontargeted siRNA pool  Dharmacon D-001206-14  
Rifampicin Sigma-Aldrich R3501 antibiotic
Isoniazid (INH) Sigma-Aldrich I3377-50G antibiotic
Hygromycin B Life Technologies 10687-010 antibiotic
Amikacin Sigma-Aldrich A1774 antibiotic
Automated Confocal Microscope OPERA PerkinElmer Image acquisition
Columbus 2.3.1 Server Database PerkinElmer Data transfer, storage, and analysis
Acapella 2.6 software PerkinElmer Image-based analysis
GraphPad Prism5 software GraphPad Statistical analysis
Excel 2010 Microsoft Statistical analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
  2. Barry, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).
  3. Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery. Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).
  4. Brodin, P., et al. High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling. PLoS Pathog. 6, (2010).
  5. Bermudez, L. E., Goodman, J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).
  6. Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation. Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).
  7. McDonough, K. A., Kress, Y. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).
  8. Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells. J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).
  9. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
  10. Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).
  11. Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).
  12. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).
  13. Song, O. R., et al. Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening. J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक ८३ माइकोबैक्टीरियम तपेदिक,उच्च सामग्री/उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग केमोजेनोमिक्स ड्रग डिस्कवरी सिरना लाइब्रेरी स्वचालित कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवि आधारित विश्लेषण
उच्च थ्रूपुट/उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए अनुकूलित इंट्रासेलुलर माइकोबैक्टीरिया के क्वांटिफिकेशन के लिए एक सूक्ष्म फेनोटाइपिक परख
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Queval, C. J., Song, O. R., Delorme, … More

Queval, C. J., Song, O. R., Delorme, V., Iantomasi, R., Veyron-Churlet, R., Deboosère, N., Landry, V., Baulard, A., Brodin, P. A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening. J. Vis. Exp. (83), e51114, doi:10.3791/51114 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter