Summary
Ici, nous décrivons une analyse phénotypique applicable aux écrans à haut débit/à haute teneur de l’ARN synthétique de petit-interférent (siRNA), du composé chimique, et des bibliothèques mutantes de tuberculose de mycobactérie. Cette méthode repose sur la détection de Mycobacterium tuberculosis marqué par fluorescence dans une cellule hôte marqué par fluorescence à l’aide d’une microscopie confocale automatisée.
Abstract
Malgré la disponibilité du traitement et du vaccin, la tuberculose (TB) reste l’une des infections bactériennes les plus mortelles et les plus répandues dans le monde. Depuis plusieurs décennies, l’explosion soudaine de souches multirésistantes et largement résistantes aux médicaments constitue une menace sérieuse pour le contrôle de la tuberculose. Par conséquent, il est essentiel d’identifier de nouvelles cibles et voies critiques pour l’agent causal de la tuberculose, Mycobacterium tuberculosis (Mtb)et de rechercher de nouveaux produits chimiques qui pourraient devenir des médicaments antituberculeux. Une approche consiste à mettre en place des méthodes adaptées aux écrans génétiques et chimiques des bibliothèques à grande échelle permettant la recherche d’une aiguille dans une botte de foin. À cette fin, nous avons développé un test phénotypique en nous appuyant sur la détection de Mtb marqué par fluorescence dans les cellules hôtes marqués par fluorescence à l’aide de la microscopie confocale automatisée. Ce test in vitro permet une quantification basée sur l’image du processus de colonisation de Mtb dans l’hôte et a été optimisé pour le format de microplaque de 384 puits, qui convient aux cribles de siRNA, de composé chimique ou de Mtb mutant-bibliothèques. Les images sont ensuite traitées pour l’analyse multiparamétrique, qui fournit la lecture inférer sur la pathogénie de Mtb dans les cellules hôtes.
Introduction
Parmi les agents pathogènes infectieux émergents et réémergents signalés au cours des dernières années, Mycobacterium tuberculosis (Mtb)occupe une place de choix en étant responsable de 1,4 million de décès et de 8,7 millions de nouvelles infections en 2011 (Global tuberculosis report 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). Malgré la disponibilité de thérapies multidrogues, le nombre de personnes infectées est toujours en hausse et multirésistante (MDR) ainsi que le Mtb très résistant aux médicaments (XDR) se propagent rapidement dans le monde entier1. De plus, si l’on tient compte de la présence d’antigènes Mtb, il est évident qu’un tiers de la population mondiale est considéré comme étant infecté de manière latente par Mtb. Statistiquement, dans un cas sur dix, il y a évolution vers la forme active de la maladie avec les symptômes cliniques suivants2. Par conséquent, de nouveaux moyens de lutter contre le VTT sont nécessaires de toute urgence. Dans ce contexte, nous avons développé un test phénotypique visuel in vitro s’appuyant sur la surveillance de l’invasion et de la multiplication du Mtb dans les cellules hôtes par microscopie confocale automatisée à fluorescence3. L’adaptation du test dans des plaques de microtitration de 384 puits en combinaison avec l’acquisition et l’analyse automatisées d’images, a permis un criblage à haute teneur / haut débit (HC / HTS) de bibliothèques à moyenne échelle de composés, de siARN et de mutants bactériens. Le criblage d’une bibliothèque d’ARNi à l’échelle du génome sur ce dosage phénotypique a ainsi permis d’identifier les principaux facteurs hôtes impliqués dans le trafic de Mtb et la réplication intracellulaire mais aussi l’élucidation des voies de l’hôte exploitées par le bacille tuberculeux. Une autre adaptation de ce test phénotypique particulier était pour l’identification des facteurs bactériens essentiels à la persistance intra-phosomique de Mtb. Par exemple, l’arrêt de la maturation du phagosome est considéré comme l’un des principaux mécanismes qui facilitent la survie et la réplication du Mtb dans les macrophages. La surveillance de la localisation subcellulaire des mutants knock-out Mtb dans les compartiments acides marqués par fluorescence a permis d’identifier les gènes bactériens impliqués dans le processus de survie4. Enfin, l’imagerie à haute teneur de Mtb offre également une excellente méthode pour quantifier l’efficacité des médicaments pour inhiber divers phénomènes tels que la croissance bactérienne intracellulaire3. Au total, ce type de dosage phénotypique à haut débit permet d’accélérer la découverte de médicaments contre la tuberculose et les données collectées par ces différentes approches contribuent à une meilleure compréhension de la manipulation de l’hôte exercée par Mtb.
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Protocol
1. Criblage à haut débit de l’ARNsi à l’échelle du génome
Criblage effectué dans une lignée cellulaire humaine de pneumocytes de type II modèle A549 lors de l’infection par Mtb H37Rv exprimant la protéine fluorescente verte (GFP). Cette procédure est décrite à la figure 1A.
- Remettre en suspension la bibliothèque d’ARNsi séchés qui est stockée dans des plaques mères (plaques de 96 puits) avec 1x tampon d’ARNsi pour atteindre une concentration de 4 μM, puis transférer 10 μl du mélange dans une plaque fille de 384 puits (plaque fille 1).
- Ajouter 10 μl de tampon d’ARNsi 1x dans la plaque fille 1 pour diluer l’ARNsi par 2 fois. Après la remise en suspension de l’ARNsi, les plaques sont scellées avec un joint en aluminium pelable et peuvent être stockées à -20 ° C au moins 6 mois et jusqu’à 2-3 ans, mais le temps de stockage peut varier en fonction des recommandations du fabricant de la bibliothèque siRNA.
- Diluer les siARN de la plaque fille 1 en plaque fille 2 pour atteindre une concentration de 500 nM. Après la remise en suspension de l’ARNsi, les plaques sont scellées avec un joint en aluminium pelable et peuvent être stockées à -20 ° C au moins 6 mois et jusqu’à 2-3 ans, mais le temps de stockage peut varier en fonction des recommandations du fabricant de la bibliothèque siRNA.
- Avant utilisation, décongeler la plaque fille 2 à température ambiante.
- Prendre 2,5 μl d’ARNsi de la plaque fille 2 et placer dans une plaque d’analyse à 384 puits.
- Dans la même plaque d’analyse de 384 puits à l’étape 1.5, ajouter 2,5 μl d’ARNsi témoin négatif et positif à leurs puits respectifs.
- Diluer le réactif de transfection dans 1x D-PBS pour donner suffisamment de solution pour fournir 0,1 μl de réactif de transfection dans chaque puits et pré-incuber la solution de transfection diluée à température ambiante pendant 5 min.
- Ajouter 7,5 μl du mélange réactif de transfection/solution PBS à chaque puits de la plaque d’essai et incuber pendant 30 min à température ambiante.
- Ajouter 40 μl de cellules A549 (1 500 cellules/puits) en suspension dans un milieu RPMI 1640 complété par 10 % de sérum fœtal bovin (SBF). Maintenir les cellules pendant une période d’incubation de 3 jours à 37 °C dans une atmosphère contenant 5 % deCO2. Ces cellules se divisent toutes les 24 heures, soit environ 12 000 cellules se trouvent dans les puits trois jours après la transfection.
- Laver une culture Mtb H37Rv exprimant le GFP de deux semaines avec du D-PBS (exempt de MgCl2 et CaCl2)par centrifugation à 4 000 x g pendant 5 min et jeter les lavages. Répétez cette étape 3x. (Pour des conditions de culture deGFP-Mtb H37Rv voir le Protocole 3).
- Suspendre le culot bactérien dans 10 ml de milieu RPMI 1640 complété par 10% de FBS et décanter pendant 1 heure à température ambiante pour permettre aux agrégats bactériens de sédimenter.
- Recueillir le surnageant bactérien et mesurer la DO600 (LA600 doit être comprise entre 0,6 et 0,8) et la fluorescence GFP (valeur RFU) à l’aide d’un lecteur de microplaques pour déterminer la concentration bactérienne. Calculer le titre de la suspension à l’aide d’une droite de régression de référence affichant la valeur RFU = f (valeur CFU) qui avait été générée avant l’expérience sur une autre culture qui avait été préparée dans les mêmes conditions. Préparer une suspension bactérienne contenant 2,4 x 106 bactéries/ml, ce qui correspond à une multiplicité d’infection (MOI) de 5.
- Retirer le milieu dans la plaque d’analyse de 384 puits et ajouter 25 μl de suspension bactérienne fraîchement préparée.
- Incuber la plaque d’analyse à 384 puits à 37 °C pendant 5 heures dans une atmosphère contenant 5 % deCO2.
- Retirez le milieu et lavez doucement les cellules avec un milieu RPMI complété par 10% FBS 3x.
- Pour tuer les bactéries extracellulaires restantes, traiter les cellules avec 50 μl de milieu RPMI-FBS frais contenant 50 μg/ml d’amikacine à 37 °C pendant 1 h dans une atmosphère contenant 5 % deCO2.
- Retirer l’amikacine contenant du milieu et ajouter 50 μl de milieu RPMI frais complété par 10 % de FBS. Incuber la plaque d’analyse à 384 puits à 37 °C pendant 5 jours dans une atmosphère contenant 5 % deCO2.
- Avant l’acquisition de l’image, ajouter 10 μl de 30 μg/ml de DAPI fraîchement préparés dans du PBS (concentration finale de 5 μg/ml) et incuber pendant 10 min à 37 °C.
- Chargez la plaque dans un microscope confocal automatisé.
Cliquez ici pour agrandir l’image. - Définissez les paramètres d’exposition. Enregistrer la fluorescence DAPI à l’aide d’un laser d’excitation 405 nm avec filtre d’émission de 450 nm et la fluorescence GFP à l’aide d’un laser d’excitation de 488 nm avec filtre d’émission de 520 nm.
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Cliquez ici pour agrandir l’image. - Sélectionnez les puits et les champs de chaque puits à acquérir, ce qui est ensuite appelé paramètres de mise en page et de sous-disposition.
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Cliquez ici pour agrandir l’image. - Générez le fichier d’expérience à l’aide des paramètres des étapes 1.20 et 1.21, puis exécutez l’acquisition automatique.
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Cliquez ici pour agrandir l’image. - Transférer des images vers un serveur distant.
Cliquez ici pour agrandir l’image. - Évaluer les images à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Détecter les noyaux cellulaires du canal DAPI à l’aide de l’algorithme de détection des noyaux et la zone bactérienne du canal GFP à l’aide de l’algorithme des propriétés d’intensité des pixels (Figure 4A).
Remarque: Ce protocole est optimisé pour étudier l’effet du silençage génique sur la croissance intracellulaire de Mtb. Le VTT est une bactérie à croissance lente qui se divise toutes les 20 heures dans des conditions optimales. Après 5 jours post-infection, la quantité de VTT extracellulaire est encore faible en l’absence de lyse cellulaire et n’a pas affecté la qualité de l’analyse. Ce protocole doit être optimisé en termes de durée de traitement antibiotique et de temps d’incubation pour être adapté aux criblages siRNA utilisant des bactéries à croissance rapide comme Mycobacteria smegmatis et Escherichia coli qui sont largement libérées et peuvent infecter de nouvelles cellules.
2. Criblage composé à haut débit
Dépistage effectué sur des cellules hôtes infectées par Mtb H37Rv. Cette procédure est décrite à la figure 1B.
- Décongeler les plaques mères de 384 puits contenant la bibliothèque composée solubilisée dans le DMSO à 100%. Transférer 0,5 μl des composés dans des plaques filles de 384 puits contenant 10 μl de milieu RPMI 1640 complété par 10 % de FBS.
- Laver une culture Mtb H37Rv exprimant le GFP de deux semaines avec du D-PBS (exempt de MgCl2 et CaCl2)par centrifugation à 4 000 x g pendant 5 min et jeter les lavages. Répétez cette étape 3x (pour les conditions de cultureGFP-Mtb H37Rv voir protocole 3).
- Suspendre le culot bactérien dans 10 ml de milieu RPMI 1640 complété par 10% de FBS et décanter pendant 1 heure à température ambiante pour permettre aux agrégats bactériens de sédimenter.
- Recueillir le surnageant bactérien et mesurer la DO600 (DO600 doit être comprise entre 0,6 et 0,8) et la fluorescence GFP (valeur RFU) à l’aide d’un lecteur de microplaque. Calculer le titre de la suspension à l’aide d’une droite de régression de référence affichant la valeur RFU = f (valeur CFU) qui avait été générée avant l’expérience. La concentration typique est de 1 x 108 bactéries/ml.
- Récoltez des macrophages humains primaires âgés de 6 jours à 4 x 105 cellules/ml dans le milieu RPMI 1640 complété par 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et 50 ng/ml de M-CSF humain recombinant (pour la purification des cellules monocytaires du sang périphérique humain et la différenciation des macrophages, voir le protocole 4).
- Incuber les cellules primaires diluées avec des bacilles à différents MOI, allant de 1 à 5, en suspension avec des secousses légères à 90 rpm pendant 2 heures à 37 °C.
- Laver les cellules infectées par centrifugation à 350 x g pour éliminer les bactéries extracellulaires. Après chaque étape de centrifugation, ressusciter la pastille dans un milieu RPMI 1640 complété par 10% de FBS. Répétez cette étape 2x.
- Suspendre les cellules infectées dans le milieu RPMI 1640 complété par 10 % de FBS et d’amikacine à 50 μg/ml et incuber la suspension avec des secousses légères pendant 1 h à 37 °C.
- Retirer le milieu de culture cellulaire contenant de l’amikacine par centrifugation à 350 x g et laver les cellules infectées avec un milieu RPMI 1640 complet complété par 10 % de FBS et 50 ng/ml de M-CSF humain recombinant. Répétez une fois.
- Ajouter 40 μl de la suspension de macrophages infectés dans la même plaque d’essai à l’étape 2.1, qui contient déjà 10 μl des dilutions composées. La concentration finale de DMSO dans chaque puits a maintenant atteint 1%.
- Incuber les plaques d’essai pendant 5 jours à 37 °C dans une atmosphère contenant 5 % deCO2.
- Colorer les cellules vivantes avec un colorant fluorescent rouge lointain perméant.
- Chargez la plaque dans un microscope confocal automatisé.
Cliquez ici pour agrandir l’image. - Définissez les paramètres d’exposition. Enregistrer la fluorescence rouge lointain à l’aide d’un laser d’excitation 640 nm avec filtre d’émission de 690 nm et la fluorescence GFP à l’aide d’un laser d’excitation de 488 nm avec filtre d’émission de 520 nm.
Cliquez ici pour agrandir l’image.
Cliquez ici pour agrandir l’image. - Sélectionnez les puits et les champs de chaque puits à acquérir, ce qui est ensuite appelé paramètres de mise en page et de sous-disposition.
Cliquez ici pour agrandir l’image.
Cliquez ici pour agrandir l’image. - Générez le fichier d’expérience à l’aide des paramètres des étapes 2.14 et 2.15 et exécutez l’acquisition automatique.
Cliquez ici pour agrandir l’image.
Cliquez ici pour agrandir l’image. - Transférer des images vers un serveur distant.
Cliquez ici pour agrandir l’image. - Évaluer les images à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Détecter la zone cellulaire du canal rouge lointain à l’aide de l’algorithme des propriétés d’intensité des pixels et la zone bactérienne du canal GFP à l’aide de l’algorithme des propriétés d’intensité des pixels(Figure 4B).
Remarque : Ce protocole peut être adapté pour le criblage de la bibliothèque mutante Mtb en remplaçant les composés par des mutants exprimant une protéine fluorescente (Un puits/Un mutant) (Figure 1C, voir aussi Brodin et al. 4). Les mutants fluorescents sont d’abord ensemencés dans des puits (20 μl de suspension bactérienne par puits). Les bactéries sont ensuite récupérées par 30 μl de suspension cellulaire. Après centrifugation à 350 x g pendant 1 min, la plaque est incubée à 37 °C dans une atmosphère contenant 5 % deCO2. Le temps d’incubation et le MOI dépendent du test. Par exemple, pour la visualisation des premiers événements cellulaires tels que l’acidification des phagosomes, les cellules peuvent être infectées pendant 2 heures avec moi allant de 1-20. Les lysosomes sont colorés à l’aide du colorant Lysotracker à 2 μM pendant 1,5 h à 37 °C dans une atmosphère contenant 5 % deCO2, puis fixés avec 10 % de forcine ou 4 % de paraformaldéhyde (PFA). Les images confocales sont acquises et finalement analysées à l’aide de scripts d’analyse d’images comportant des algorithmes appropriés pour la détection des lysosomes et la localisation subcellulaire4.
3. Protéine fluorescente verte exprimant mycobacterium tuberculosis H37Rv (GFP-H37Rv) Conditions de culture
Pour le stockage à long terme, les GFP-H37Rv ont été congelés dans du D-PBS (environ 1 x10 8 mycobactéries par flacon).
- Résurciez un flacon congelé de GFP-H37Rv dans une fiole d’Erlenmeyer contenant 50 ml de bouillon 7H9 additionnés d’enrichissement en OADC de Middlebrook à 10 %, de glycérol à 0,5 %, de Tween-80 à 0,05 % et d’hygromycine B (50 μg/ml).
- Incuber 8 jours à 37 °C.
- Mesurer laDO 600 de la culture GFP-H37Rv.
- Diluer la culture GFP-H37Rv pour obtenirla DO 600 = 0,1 dans un bouillon 7H9 frais complété par un enrichissement en OADC de Middlebrook à 10 %, du glycérol à 0,5 %, du tween-80 à 0,05 % et de l’hygromycine B (50 μg/ml).
- Incuber le GFP-H37Rv à 37 °C pendant 8 jours de plus avant de l’utiliser pour le dosage.
4. Purification des cellules monocytaires du sang périphérique humain à partir de la préparation de sang total ou de buffy-coat
- Diluer la poche sanguine 2x dans 1x D-PBS (exempt deMgCl2 et CaCl2)contenant 1% fbs.
- Isoler les monocytes par centrifugation de gradient de densité de Ficoll à 400 x g pendant 20 min.
- Recueillir les monocytes isolés.
- Laver les monocytes 3x avec 1x D-PBS (exempt deMgCl2 etCaCl2)contenant 1% de FBS par centrifugation à 400 x g pendant 10 min à température ambiante.
- Concentrer les cellules jusqu’à 1 x 107 cellules/ml.
- Purifier les monocytes à l’aide de billes magnétiques CD14 selon le protocole du fabricant (voir Matériaux).
- Après purification des cd14-monocytes, ensemencer les cellules à 1,5 x10 6 cellules/ml dans RPMI 1640 complété par 10% FBS et 40 ng/ml de macrophages humains Colony Stimulating Factor (hM-CSF) et incubés pendant 4 jours à 37 °C dans une atmosphère contenant 5% deCO2.
- Après 4 jours, remplacer le milieu par du RPMI 1640 frais complété par 10% de FBS et 40 ng/ml de hM-CSF et incubé pendant 2 jours à 37°C dans une atmosphère contenant 5% deCO2.
- Après 6 jours, les cellules peuvent être utilisées pour le test.
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Representative Results
Criblage à haut débit de l’ARNsi à l’échelle du génome
Mtb est capable de coloniser les cellules immunitaires in vitro ainsi que plusieurs autres cellules épithéliales pulmonaires. Par exemple, Mtbest capable d’infecter et d’endommager les cellules épithéliales A549 qui sont couramment utilisées comme modèle pour les pneumocytes humains de type II5-7. Dectin-1 a été rapporté comme un récepteur de la cellule hôte impliqué dans l’absorption de Mtb, la réponse proinflammatory et l’effet antibactérien sur la croissance mycobactérienne intracellulaire dans les cellules A5498. l’état de siRNA décrit dans le protocole 1 a mené à 85% d’efficacité de silence (données non montrées). L’expression de Dectin-1 de silence avec le siRNA a mené à une diminution de quantité intracellulaire de mycobactéries en cellules A549. En effet, après 3 jours de silence et 5 jours d’infection, le pourcentage de cellules infectées est réduit deux fois dans les cellules A549 réduites au silence de Dectin-1 par rapport aux cellules transfectées avec de l’ARNsi brouillé non ciblant(figures 2A et 2B). Nous avons appliqué la normalisation basée sur l’échantillon de Dectin-1 ciblé par siRNA comparé au brouillage pour définir le Z-score. Comme le montre la figure 2C,nous avons obtenu une moyenne de Z-score autour de -15 pour l’ARNsi ciblé Dectin-1. Dectin-1 peut être employé comme contrôle positif pour l’écran de siRNA pour découvrir d’autre facteur nouveau d’hôte impliqué dans la colonisation de Mtb dans des pneumocytes qui pourraient avoir le même phénotype que celui avec le siRNA de Dectin. L’utilisation d’un siRNA impactant sur le phénotype comme contrôle sur chaque microplaque lors de l’écran permet la normalisation de chaque plaque, ce qui est utile lorsque l’on veut effectuer une analyse d’écran du génome entier. Le paramètre statistique Z' était de 0,1 en utilisant une normalisation basée sur le contrôle sur le brouillage et l’ARNsi ciblé Dectin1, ce qui est une valeur acceptable pour la validation des données de dépistage de l’ARNsi.
Criblage composé à haute teneur
L’efficacité du composé sur la croissance bactérienne intracellulaire est évaluée en établissant une courbe dose-réponse (DRC) et normalisée au composé positif de référence et aux témoins négatifs du solvant composé. La RDC représentative de deux composés de référence, l’isoniazide (INH) et la rifampicine (RIF), actifs contre la croissance du Mtb sont représentés à la figure 3. Ces courbes sont obtenues dans les macrophages primaires humains infectés par une souche Mtb H37Rv exprimant GFP, avec lecture après 5 jours post-infection. Le DMSO et l’INH à une concentration finale de respectivement 1 % et 0,1 μg/ml sont couramment utilisés comme témoins négatifs et positifs, offrant des niveaux basaux d’efficacité (0 et 100 %) (Figure 3A). Suivant le processus d’analyse d’image détaillé à la figure 4B, lesdonnées multiparamétriques sont extraites d’images de fluorescence confocale de macrophages humains infectés prises par microscope confocal automatisé. Les composés actifs impactant sur la réplication intracellulaire du Mtb dans les cellules hôtes ont conduit à une diminution de la charge mycobactérienne, ce qui correspond à la zone du signal GFP dans les cellules sur les images(Figure 3B). Le rapport entre la surface bactérienne intracellulaire et la surface cellulaire totale, calculé à l’aide d’un logiciel d’analyse basé sur l’image, est tracé en fonction de la concentration de composé, qui génère la RDC(Figure 3B). Ces courbes permettent de déterminer à la fois la concentration requise pour diminuer la charge bactérienne de 50% (IC50)et la concentration minimale requise pour inhiber 99% de la réplication bactérienne (MIC99)(Figure 3C). Z' basé sur le DMSO témoin 1% et le témoin INH 0.1 μg/ml était 0.49. Ce Z', vraiment proche de 0,5, est acceptable pour valider ce dosage.
Figure 1. Approches visuelles de filtrage à contenu élevé. Représentation schématique du système de modèle d’infection Mtb utilisé pour les écrans siRNA(A),composés chimiques(B)et mutants Mtb (C). (A) criblage de bibliothèque de siRNA : les cellules ont été transfectées avec siRNA pendant 3 jours dans des plaques de 384 puits utilisant la méthode de transfection inverse. Les cellules transfectées par l’ARNsi ont été infectées parGFP-Mtb et incubées pendant 5 jours à 37 °C dans une atmosphère contenant 5 % deCO2. Les cellules ont ensuite été colorées et des images ont été recueillies à l’aide d’un microscope confocal automatisé. (B) Écran de la bibliothèque des composés : les composés ont été distribués dans des plaques de 384 puits. La suspension cellulaire et leGFP-Mtb ont été incubés ensemble pendant 2 heures à 37 °C. Les cellules infectées ont été ensemencées dans les plaques et incubées pendant 5 jours à 37 °C dans une atmosphère contenant 5 % deCO2. Les cellules ont ensuite été colorées et des images ont été recueillies à l’aide d’un microscope confocal automatisé. (C) Fluorescent-Mtb mutant library: les mutants fluorescents Mtb ont été ensemencés dans des plaques de 384 puits et la suspension de la cellule hôte a été distribuée. Le temps d’incubation variait selon le dosage. Les cellules ou les vésicules cellulaires ont été souillées avant acquisition automatisée d’image. Cliquez ici pour agrandir l’image.
Figure 2. Le silence de Dectin-1 a un impact sur la colonisation par le Mtb dans les cellules A549. (A) Images confocales représentatives (lentille d’air 10X) de cellules A549 transfectées avec de l’ARNsi non ciblant (brouillage) ou avec de l’ARNsi spécifique pour Dectin-1 et infectées par GFP-Mtb H37Rv (MOI5) pendant 5 jours. La barre d’échelle représente 200 μm (A) GFP-Mtb H37Rv ont été visualisés en vert et les cellules en rouge. Le nombre de cellules(A. Détection cellulaire) et la charge intracellulaire GFP-Mtb H37Rv (A. Zone bactérienne) ont été déterminés à l’aide d’un logiciel d’analyse basé sur l’image. (B) Représentation graphique du pourcentage de cellules A549 infectées dans 5 répétitions (w1 à w5) de Scramble siRNA (cercles bleus) et Dectin-1 siRNA (cercles rouges). (C) Représentation graphique de la moyenne du score Z de l’ARNsi Scramble et de l’ARNsi Dectin-1. (*** valeur de p < 0,0001). Cliquez ici pour agrandir l’image.
Figure 3. Courbe dose-réponse des composés de référence actifs contre Mtb dans les macrophages humains. (A et B) Images confocales représentatives (lentille d’eau 20X) de macrophages humains (rouges, cellule étiquetée avec un colorant fluorescent rouge) infectés par GFP-Mtb H37Rv (vert) avec un MOI1 pendant 5 jours. La barre d’échelle représente 50 μm. (A) Images de cellules infectées incubées avec du DMSO 1% utilisé comme témoin négatif dans l’essai. (B) Images de cellules infectées incubées avec une concentration croissante de deux composés de référence isonazid (INH) et rifampicine (RIF). (C) Courbes dose-réponse (RDC) de l’INH et du RIF. L’analyse basée sur l’image a permis de déterminer la RDC pour chaque composé testé. DRC représente le rapport entre la surface GFP-bactérienne intracellulaire et la surface cellulaire totale (axe Y), en fonction de la concentration du composé (échelle logarithmique, axe des x). Dans chaque graphique, la RDC du composé a été normalisée à celle du témoin négatif DMSO 1% (inhibition de 0%) et du témoin positif INH à une concentration de 0,1 μg/ml (inhibition de 100%). Pour chaque composé, la concentration requise pour inhiber 50% de la colonisation bactérienne (IC50)et la concentration inhibitrice minimale (MIC99)ont été calculées à partir de la RDC. Cliquez ici pour agrandir l’image.
Figure 4. Analyse standard basée sur l’image pour déterminer les mycobactéries intracellulaires fluorescentes. Des images de plaques de 384 puits ont été acquises à l’aide d’un microscope confocal automatisé. Dans ce cas, 4 images différentes du même puits (champs) ont été enregistrées. Chaque champ a ensuite été analysé à l’aide du logiciel d’analyse basé sur l’image Acapella 2.6 (Perkin Elmer). (A) Chaque champ contenait deux canaux (deux couleurs), un pour les bactéries (vert) et un pour les noyaux cellulaires (canal bleu), qui ont été segmentés à l’aide de l’algorithme suivant: i) détection des noyaux à l’aide d’une procédure Acapella intégrée, ii) détection du cytoplasme, basée sur la population de noyaux, en utilisant une procédure Acapella intégrée, iii)détection des bactéries en ne gardant que les pixels dont l’intensité est supérieure à un seuil défini manuellement, iv) fusion de la position des cellules avec la position des bactéries pour identifier les cellules infectées. Les résultats finaux, exprimés en moyenne des quatre champs, sont la surface bactérienne totale, le nombre total de cellules, le pourcentage de cellules infectées et la surface bactérienne par cellule (moyenne de toutes les cellules infectées). (B) Chaque champ contenait deux canaux, un pour les bactéries (canal vert) et un pour les noyaux cellulaires et le cytoplasme (canal rouge lointain), qui ont été segmentés à l’aide de l’algorithme suivant: i) filtrer le canal d’origine à l’aide d’un filtre anti-médian, ii) ne garder que les pixels dont l’intensité est supérieure à un seuil défini manuellement (chaque canal a son propre seuil), iii) compter le nombre restant de pixels pour chaque canal, iv) fusionner les canaux et compter le nombre de pixels partagés par les bactéries et les noyaux pour quantifier les bactéries intracellulaires. Les résultats finaux, exprimés en moyenne des quatre champs, sont la surface bactérienne totale, la surface cellulaire totale, la surface totale des bactéries intracellulaires et le rapport entre la surface bactérienne intracellulaire et la surface totale des cellules. Cliquez ici pour agrandir l’image.
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Discussion
Nous décrivons ici les méthodes requises pour un essai phénotypique utilisant une contrainte de Mtb H37Rv exprimant GFP pour infecter les cellules hôtes fluorescentement étiquetées, ce qui le rend approprié pour des écrans à haute teneur/à haut débit. Ce protocole pourrait être appliqué à un large éventail de composés, de sondes fluorescentes et de mutants Mtb. Pour chaque protocole décrit ci-dessus, des étapes de fixation et d’immunomarquage pourraient être effectuées avant l’acquisition de l’image. Nous utilisons un microscope confocal fluorescent automatisé équipé d’une lentille d’eau 20X (NA 0.70) ou 60X (NA 1.2) pour acquérir des images. Le microscope confocal est équipé de lasers d’excitation de 405, 488, 561 et 640 nm. La fluorescence émise est capturée à l’aide de 3 caméras associées à un ensemble de filtres couvrant une longueur d’onde de détection allant de 450 à 690 nm. Il est important de noter que l’ajustement des paramètres d’excitation et d’émission du microscope dépend du type de colorants ou de fluorochromes utilisés dans chaque expérience. Pour les essais phénotypiques, le DAPI ou hoechst sont couramment utilisés à 5 μg/ml pendant 10 min pour colorer les noyaux. Cependant, les cellules peuvent également être colorées avec différents colorants fluorescents spécifiques pour la détection du cytoplasme, de la membrane ou du cytosquelette. Après l’acquisition de l’image, les images doivent être analysées à l’aide d’un logiciel d’analyse basé sur l’image. Des algorithmes de segmentation cellulaire basés sur l’intensité de chaque pixel doivent être utilisés pour déterminer respectivement le nombre de cellules ou la zone bactérienne intracellulaire (voir figure 4). Les données générées devraient être évaluées par rapport à un critère d’acceptation statistique pour valider la robustesse et l’exactitude de l’essai.
Les écrans à haut débit à grande échelle sont des expériences gourmandes en temps et en ressources. Par conséquent, il est de première importance d’évaluer au préalable la pertinence de l’essai. Les données recueillies à partir d’écrans phénotypiques ont été visualisées à l’aide d’un tableur comme Excel et généralement normalisées par plaque. Les mesures de qualité les plus couramment utilisées pour les écrans siRNA et à petites molécules sont le Z. Le Z est défini avec la moyenne et l’écart type des témoins positifs et négatifs9. Le Z quantifie si la réponse à l’analyse est suffisamment importante pour valider son application pour un crible complet d’échantillons. La plage du Z est négative infini à 1, avec >0,5 comme un très bon test, >0 un test acceptable et <0 un test inacceptable. Par rapport aux écrans à petites molécules pour lesquels la force des témoins permet la validation du dosage avec Z > 0,5, la variabilité des cribles d’ARNsi impacte le Z qui a tendance à être plus faible (souvent entre 0,0 et 0,5)10. En effet, le succès des criblages d’ARNsi dépend de l’optimisation de i)l’efficacité de la livraison de l’ARNsi dans les cellules, ii)la cytotoxicité induite par la transfection et iii)la condition de dosage pour l’efficacité du silençage génique. L’ARNsi peut facilement être transfecté dans diverses lignées cellulaires, telles que HeLa, en suivant le protocole de transfection du fabricant, mais la transfection efficace de l’ARNsi dans certaines lignées cellulaires, y compris les macrophages, reste toujours un défi. Néanmoins, l’expression à médiation vectorielle virale d’ARN courts en épingle à cheveux (SHRNA) pourrait représenter une bonne alternative11. Pour échapper à la difficulté d’interprétation, les données collectées à partir des écrans siRNA sont fréquemment normalisées par rapport à la distribution standard normale pour définir le score Z (également appelé valeur Z) pour chaque point10,12. Ensuite, les échantillons de succès ont été classés en fonction du score Z qui appartient généralement à moins de -2 ou plus de +2. Enfin, les résultats sélectionnés dans l’écran primaire ont été testés à nouveau dans un écran secondaire comprenant plus de répétitions afin de confirmer le phénotype observé dans l’écran primaire.
Notre protocole pourrait facilement être appliqué pour les écrans à petite échelle avec équipement. Pour ce faire, une miniaturisation d’essai dans les plaques de micro-titre et la manipulation de la bibliothèque de molécules sont nécessaires pour optimiser le processus de conservation, de distribution et de mélange13. En outre, il est recommandé d’utiliser une plate-forme robotique automatisée, y compris des distributeurs, afin de contrôler avec précision et reproductibilité les conditions d’essai dans les plaques de micro-titre. L’énorme quantité de données produites par le criblage à haut débit (HTS) devrait également être gérée par une base de données et un pipeline adapté pour l’analyse d’images de l’image confocale, le stockage et le transfert de données. Les essais présentés dans le présent rapport ont été effectués dans une installation de biosécurité de niveau 3 (BSL3). Le strict respect de la sécurité en BSL3 augmente la difficulté des écrans. En effet, de nombreux équipements requis pour les écrans doivent être disponibles en BSL3 et isolés pour protéger le travailleur et l’environnement de la contamination. Par conséquent, l’installation du pipeline adapté dans BSL3 a nécessité beaucoup d’espace. Pour cette raison, notre protocole a été développé pour avoir un maximum d’étapes effectuées sur le BSL3 comme la transfection de siRNA et le transfert composé aux plaques. L’infection de cellules par des étapes d’acquisition d’image ont été exécutées dans des conditions BSL3. Les images ont ensuite été transférées dans un serveur dédié et analysées hors du BSL3.
Le dosage phénotypique décrit ici était basé sur deux méthodes d’analyse d’image(figure 4). La première méthode, utilisée pour le dépistage de l’ARNsi, a été conçue pour donner le nombre de cellules infectées. Ce paramètre s’est avéré pour comparer efficacement l’effet du silençage génique sur la réplication intracellulaire de Mtb. Lors du criblage des composés cependant, une lecture plus basique basée sur la surface totale des cellules était suffisante pour identifier clairement les composés actifs. Comme cette deuxième méthode est plus rapide et plus facile à mettre en œuvre, elle a été préférée pour l’analyse d’images issues du criblage de composés. Pour aller plus loin, davantage de colorants fluorescents et/ou de sondes de marquage pourraient être ajoutés et des scripts d’analyse d’images pourraient être optimisés pour générer des données multiparamétriques telles que la colocalisation, la morphologie des noyaux et des cellules, la mort cellulaire, l’agrégation bactérienne, ainsi que le trafic intracellulaire des bactéries. Il est important de noter que pour les essais de trafic intracellulaire ou de colocalisation, il est essentiel d’obtenir des piles Z afin d’appliquer une évaluation cumulative.
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Disclosures
Aucun conflit d’intérêts déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu financièrement par la Communauté européenne (ERC-STG INTRACELLTB Grant n° 260901, MM4TB Grant n° 260872), l’Agence Nationale de Recherche, le Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed), et la Région Nord Pas de Calais. Nous remercions Gaspard Deloison, Elizabeth Werkmeister, Antonino Bongiovanni et Frank Lafont de la plateforme BICeL pour leur assistance technique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µclear-plate black, 384-well | Greiner Bio-One | 781091 | 127.8/86/15 MM with Lid, TC treated |
| CellCarrier 384-well plate | PerkinElmer | 6007550 | Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated |
| V-bottom white, 384-well plate | Greiner Bio-One | 781280 | |
| sealing tape, breathable, sterile | Corning | 3345 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | Transfection reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Cell culture medium |
| D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 2610040-79 | |
| Ficoll Paque PLUS | Dutscher | 17-1440-03 | Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi | 130-050-201 | Purification of CD14+ Monocytes |
| Human M-CSF, premium gr. (1000 μg) | Miltenyi | 130-096-493 | Macrophage Colony Stimulating Factor |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | Columns for CD14+ Monocytes isolation |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Mycobacteria culture |
| Glycerol high purity | Euromedex | 50405-EX | Mycobacteria culture |
| Middlebrook OADC enrichment | Becton-Dickinson | 211886 | Mycobacteria culture |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Mycobacteria culture |
| Versene 1x | Life Technologies | 15040033 | Nonenzymatic cell dissociation solution |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Nuclei dye |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nuclei dye |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Nuclei/cytoplasm dye |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT5014 | Cell fixation solution |
| siRNA targeting Dectin-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* Nontargeted siRNA pool | Dharmacon | D-001206-14 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Isoniazid (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-50G | antibiotic |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | antibiotic |
| Amikacin | Sigma-Aldrich | A1774 | antibiotic |
| Automated Confocal Microscope OPERA | PerkinElmer | Image acquisition | |
| Columbus 2.3.1 Server Database | PerkinElmer | Data transfer, storage, and analysis | |
| Acapella 2.6 software | PerkinElmer | Image-based analysis | |
| GraphPad Prism5 software | GraphPad | Statistical analysis | |
| Excel 2010 | Microsoft | Statistical analysis |
References
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