Summary
여기서는 작은 간섭 합성 RNA(siRNA), 화학 화합물 및 진균 결핵 돌연변이 라이브러리의 고처리량/고함량 스크린에 적용되는 표현성 분석을 설명합니다. 이 방법은 자동 공초점 현미경 검사를 사용하여 형광으로 표지된 숙주 세포 내의 형광표지 진균 결핵의 검출에 의존합니다.
Abstract
치료와 백신의 가용성에도 불구하고 결핵 (TB)은 세계에서 가장 치명적이고 광범위한 세균 감염 중 하나입니다. 수십 년 이후, 다중 및 광범위 하 게 약물 저항 하는 긴장의 갑작스런 버스트는 결핵의 제어에 대 한 심각한 위협. 따라서 결핵, 진균 결핵(Mtb)의 원인제에 중요한 새로운 표적과 경로를 식별하고 결핵 치료제가 될 수있는 새로운 화학물질을 찾는 것이 필수적이다. 한 가지 접근법은 건초 더미에서 바늘을 검색 할 수 있도록 대규모 라이브러리의 유전 및 화학 적 스크린에 적합한 방법을 설정하는 것입니다. 이를 위해, 우리는 자동 공초점 현미경 검사를 사용하여 형광 표지 숙주 세포 내에서 형광 표지 Mtb의 검출에 의존하는 phenotypic 분석법을 개발했습니다. 이러한 시험관 내 분석법은 Mtb의 식민지화 공정을 숙주로 정량화할 수 있으며, siRNA-, 화학 화합물 또는 Mtb 돌연변이 라이브러리의 스크린에 적합한 384웰 마이크로플레이트 포맷에 최적화되었다. 그런 다음 이미지는 다중 파라메트릭 분석을 위해 처리되며, 이는 숙주 세포 내의 Mtb의 발병기에서 추론을 제공합니다.
Introduction
지난 몇 년 동안 보고된 신흥 및 재발하는 전염하는 병원균 중, 진균 결핵(Mtb)은 2011년에 140만 명의 사망자와 870만 건의 새로운 감염을 담당하는 두드러진 장소를 보유하고 있습니다(글로벌 결핵 보고서 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). 다약물 치료의 가용성에도 불구하고, 감염된 사람들의 수는 여전히 증가하고 다중 약물 내성 (MDR) 뿐만 아니라 광범위하게 약물 내성 (XDR) Mtb는 빠르게 전 세계적으로확산1. 더욱이, Mtb 항원의 존재를 고려할 때, 전 세계 인구의 3분의 1이 Mtb에 의해 잠잠하게 감염된 것으로 간주된다는 것이 분명합니다. 따라서 Mtb과 싸우는 새로운 수단이 절실히 필요합니다. 이러한 맥락에서, 우리는 자동화된 공초점 형광 현미경3에의하여 숙주 세포로 Mtb 침입 및 곱셈을 감시에 의존하는 체외 시각적 표현체 분석법을 개발하였다. 384웰 마이크로티터 플레이트에서 자동 이미지 수집 및 분석과 결합하여 분석체의 적응은 화합물, siRNAs 및 세균 돌연변이의 중간 규모의 라이브러리의 고함량/고처리량 스크리닝(HC/HTS)을 허용했습니다. 이 표현성 분석에 게놈 넓은 RNAi 라이브러리의 검사는 따라서 Mtb 인신 매매 및 세포 내 복제에 관련된 주요 호스트 요인뿐만 아니라 결핵 바실러스에 의해 악용 호스트 경로의 용해를 가능하게했다. 이 특정 현상 분석의 또 다른 적응은 Mtb 내 phagosomal 지속성에 필수적인 세균인의 식별을 위한 것이었습니다. 예를 들어, phagosome 성숙의 체포는 대식세포에서 Mtb의 생존 그리고 복제를 용이하게 하는 주요 기계장치 의 한으로 간주됩니다. 형광 표지산산구획에서 Mtb 녹아웃 돌연변이체의 세포외 국소화 모니터링은 생존 과정에 관여하는 세균 유전자의 식별을허용4. 마지막으로, Mtb의 고함량 이미징은 세포내 세균 성장3과같은 다양한 현상을 억제하기 위한 약물 효율을 정량화하는 우수한 방법을 제공한다. 전부, 높은 처리량 표현분석의 이 모형은 결핵에 대하여 약 발견을 가속화하고 이러한 다른 접근에 의해 집합된 데이터는 Mtb에의해 발휘된 호스트 조작의 더 나은 이해에 기여합니다.
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Protocol
1. 높은 처리량 게놈 와이드 siRNA 스크리닝
인간 유형-II 폐렴구체 모델 A549 세포주에서 수행된 스크리닝은 Mtb H37Rv를 통해 바이러스 성형 단백질(GFP)을 발현하는 감염 시 수행하였다. 이 절차는 그림 1A에설명되어 있습니다.
- 4 μM의 농도에 도달하기 위해 1 x siRNA 버퍼로 어머니 판 (96 웰 플레이트)에 저장된 말린 siRNA 라이브러리를 다시 중단한 다음 혼합물의 10 μl을 384 웰 딸 플레이트 (딸 플레이트 1)로 옮길 수 있습니다.
- 딸 플레이트 1에 1x siRNA 버퍼 10 μl을 추가하여 siRNA를 2배 희석시 합니다. siRNA 재서스펜션 후, 플레이트는 벗겨질 수 있는 알루미늄 씰로 밀봉되어 -20°C이상 에서 최소 6개월 및 최대 2-3년까지 보관할 수 있지만, 저장 시간은 siRNA 라이브러리 제조업체의 권장 사항에 따라 달라질 수 있습니다.
- 딸 접시 1에 siRNAs를 희석하여 딸 플레이트 2에 넣고 500 nM의 농도에 도달하십시오. siRNA 재서스펜션 후, 플레이트는 벗겨질 수 있는 알루미늄 씰로 밀봉되어 -20°C이상 에서 최소 6개월 및 최대 2-3년까지 보관할 수 있지만, 저장 시간은 siRNA 라이브러리 제조업체의 권장 사항에 따라 달라질 수 있습니다.
- 사용하기 전에 실온에서 딸 플레이트 2를 해동하십시오.
- 딸 플레이트 2에서 siRNA2.5 μl을 가져 와서 384 웰 분석 플레이트에 넣습니다.
- 1.5단계에서 동일한 384-음분석 플레이트에서 각각의 우물에 2.5 μl 음수 및 양수 제어 siRNA를 추가합니다.
- 1x D-PBS에서 트랜스페션 시약을 희석하여 각 우물에서 0.1 μl 형질 전환 시약을 제공하고 5분 동안 실온에서 희석된 형질 방출 용액을 미리 배양할 수 있는 충분한 용액을 산출합니다.
- 형질 전환 시약/PBS 용액 혼합물의 7.5 μl을 분석 판에 각각 잘 넣고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
- 10% 태아 소 혈청(FBS)으로 보충된 RPMI 1640 배지에서 중단된 A549 세포(1,500세포/웰)의 40μl을 추가합니다. 5%CO2를함유하는 대기에서 37°C에서 3일 배양 기간 동안 세포를 유지한다. 이 세포는 매 24 시간 마다 분할, 따라서 대략 12,000 세포는 경질 후에 3 일 우물에 있습니다.
- 2주 된 GFP 표현 Mtb H37Rv 문화를 D-PBS(MgCl2 및 CaCl2무료)로 씻어 내고 원심분리를 5분 동안 4,000 x g로 씻어 내고 세척을 폐기합니다. 이 단계를 3배 반복합니다(GFP-Mtb H37Rv 문화 조건의 경우 프로토콜 3참조).
- 세균성 골을 10 ml의 RPMI 1640 배지에 10% FBS로 보충하고 세균성 골체가 퇴적물을 허용하도록 실온에서 1 시간 동안 데캔트를 보충합니다.
- 세균성 상체를 수집하고 OD600(OD 600은 0.6-0.8 사이여야 함)과 GFP-형광(RFU 값) 및 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 세균 농도를 결정한다. 동일한 조건에서 제조된 다른 배양에 대한 실험 전에 생성된 RFU 값 = f(CFU 값)를 표시하는 참조 회귀 선을 사용하여 서스펜션의 티터를 계산한다. 감염(MOI)의 복합성에 해당하는 2.4 x 106 박테리아/ml를 함유한 세균현탁액을 준비한다.
- 384-음 분석 플레이트의 배지를 제거하고 갓 준비된 세균 현탁액 25 μl을 추가합니다.
- 384-음분석 플레이트를 37°C에서 5%CO2를함유한 대기시 5시간 동안 배양한다.
- 매체를 제거하고 10% FBS 3x로 보충된 RPMI 배지로 세포를 부드럽게 세척합니다.
- 남은 세포외 세균을 죽이기 위해, 5%CO2를함유한 대기시 37°C에서 37°C에서 50 μg/ml를 함유한 신선한 RPMI-FBS 배지50 μl로 세포를 치료한다.
- 중간 함유 아미카신을 제거하고 10% FBS로 보충된 신선한 RPMI 배지 50 μl을 추가합니다. 384-잘 분석 플레이트를 37°C에서 5일 동안 5%CO2를함유한 대기권에서 배양한다.
- 이미지 수집 에 앞서 PBS (최종 농도 5 μg /ml)에 갓 준비 된 30 μg /ml의 10 μl을 추가하고 37 ° C에서 10 분 동안 배양하십시오.
- 플레이트를 자동 공초점 현미경으로 로드합니다.
큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. - 노출 매개 변수를 설정합니다. 방출 필터 450 nm및 GFP 형광을 이용한 발산 레이저 405 nm를 사용하여 DAPI 형광을 기록하여 방출 필터 520 nm를 가진 엑아시 레이저 488 nm를 사용한다.
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큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. - 획득할 각 웰의 우물과 필드를 선택하여 레이아웃 및 하위 레이아웃 매개 변수라고 합니다.
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큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. - 1.20 및 1.21 단계의 매개 변수를 사용하여 실험 파일을 생성하고 자동 수집을 실행합니다.
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큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. - 이미지를 원격 서버로 전송합니다.
큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. - 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지를 평가합니다. 픽셀 강도 특성알고리즘(도 4A)을사용하여 GFP 채널로부터 핵 검출 알고리즘 및 세균 영역을 사용하여 DAPI 채널에서 세포 핵을 검출한다.
참고: 이 프로토콜은 세포 내 Mtb 성장에 대한 유전자 침묵의 효과를 연구하도록 최적화되어 있습니다. Mtb는 최적의 조건에서 매 20 시간마다 분할 느린 성장 박테리아입니다. 감염 후 5 일 후 세포 외 Mtb의 양은 세포 용해가 없는 상태에서 여전히 낮으며 분석의 품질에 영향을 미치지 않았습니다. 이 프로토콜은 광범위하게 방출되고 새로운 세포를 감염시킬 수 있는 Mycobacteria smegmatis 및 Escherichia coli 같이 급속한 성장 박테리아를 사용하여 siRNA 스크린에 적응하기 위하여 항생제 처리 및 잠복기 시간의 기간에, 최적화되어야 합니다.
2. 높은 처리량 화합물 스크리닝
Mtb H37Rv 감염 호스트 세포에 수행 된 스크리닝. 이 절차는 그림 1B에설명되어 있습니다.
- DMSO 100%에서 용해된 화합물 라이브러리를 포함하는 384웰의 어머니 판을 해동한다. 10% FBS로 보충된 RPMI 1640 배지의 10 μl을 포함하는 384웰 딸 플레이트에서 화합물의 0.5 μl을 전송한다.
- 2주 된 GFP 표현 Mtb H37Rv 문화를 D-PBS(MgCl2 및 CaCl2무료)로 씻어 내고 원심분리를 5분 동안 4,000 x g로 씻어 내고 세척을 폐기합니다. 이 단계를 3배 반복합니다(GFP-Mtb H37Rv 문화 조건의 경우 프로토콜 3참조).
- 세균성 골을 10 ml의 RPMI 1640 배지에 10% FBS로 보충하고 세균성 골체가 퇴적물을 허용하도록 실온에서 1 시간 동안 데캔트를 보충합니다.
- 세균상수체를 수집하고 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 OD600(OD 600 은 0.6-0.8 사이여야 함)과 GFP 형광(RFU 값) 측정한다. 실험 전에 생성된 RFU 값 = f(CFU 값)를 표시하는 참조 회귀 선을 사용하여 서스펜션의 티터를 계산합니다. 일반적인 농도는 1 x 108 박테리아/ml입니다.
- 수확 6 일 된 기본 인간 대식세포에서 4 x 105 세포/ml RPMI 1640 배지10% 태아 소 혈청 (FBS) 및 50 ng/ml 재조합 인간 M-CSF (인간 말초 혈액 모노사이클 세포 정화 및 대식세포 분화의 경우 프로토콜 4 참조).
- 1-5에 이르는 다른 MOI에서 원액1차 세포를 37°C에서 2시간 동안 90rpm에서 가벼운 흔들림으로 현탁액하여 다른 MOI에서 바실리로 배양한다.
- 감염된 세포를 350 x g에서 원심분리로 세척하여 세포외 박테리아를 제거합니다. 각 원심 분리 단계 후, 10% FBS로 보충된 RPMI 1640 배지에서 펠릿을 다시 놓습니다. 이 단계를 2배 반복합니다.
- 50 μg/ml에서 10% FBS 및 아키카신으로 보충된 RPMI 1640 배지에서 감염된 세포를 중단하고 37°C에서 1시간 동안 가벼운 흔들림으로 현탁액을 배양한다.
- 350 x g에서 원심분리에 의해 아키카신을 함유하는 세포 배양 배지를 제거하고 10% FBS 및 50 ng/ml 재조합 인간 M-CSF로 보충된 완전한 RPMI 1640 배지로 감염된 세포를 세척한다. 한 번 반복합니다.
- 감염된 대식세포 현탁액의 40 μl을 2.1단계에서 동일한 분석 플레이트에 추가하여 이미 화합물 희석제의 10 μl을 함유하고 있습니다. 각 우물에서 DMSO의 최종 농도는 이제 1 %에 도달했습니다.
- 5%CO2를함유한 대기에서 37°C에서 5일간 분석플레이트를 배양한다.
- 세포가 구형극홍형염으로 살아있는 세포를 얼룩지게 합니다.
- 플레이트를 자동 공초점 현미경으로 로드합니다.
큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. - 노출 매개 변수를 설정합니다. 방출 필터 690 nm와 GFP 형광을 사용하여 방출 필터 640 nm와 GFP 형광을 사용하여 광적 형광을 기록 520 nm.
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큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. - 획득할 각 웰의 우물과 필드를 선택하여 레이아웃 및 하위 레이아웃 매개 변수라고 합니다.
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큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. - 2.14 및 2.15 단계의 매개 변수를 사용하여 실험 파일을 생성하고 자동 수집을 실행합니다.
큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. - 이미지를 원격 서버로 전송합니다.
큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. - 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지를 평가합니다. 픽셀 강도 속성알고리즘(그림 4B)을사용하여 GFP 채널에서 픽셀 강도 특성 알고리즘 및 세균 영역을 사용하여 극적 채널에서 셀 영역을 감지합니다.
참고: 이 프로토콜은 형광 단백질(1개 우물/1 돌연변이)을 표현하는 돌연변이체에 의한 화합물을 대체하여 Mtb 돌연변이 라이브러리 스크리닝에 적용될 수있다(도 1C,브로딘 외 참조) 4).형광 돌연변이는 우물에서 먼저 시드된다 (잘 당 세균 현탁액의 20 μl). 박테리아는 그 때 세포 현탁액의 30 μl에 의해 복구됩니다. 원심분리후 350 x g에서 1분 동안, 플레이트는 5%CO2를함유하는 대기에서 37°C로 배양된다. 인큐베이션 시간 및 MOI는 분석에 의존합니다. 예를 들어, phagosome 산성화와 같은 초기 세포 이벤트의 시각화를 위해, 세포는 1-20에서 배열하는 MOI를 가진 2 시간 동안 감염될 수 있다. 리소솜은 리소트래커 염료를 2μM에서 1.5시간 동안 37°C에서 37°C로염색한 후 10% 포름알린 또는 4%의 파라포름데히드(PFA)로 고정된다. 공초점 이미지는 리소좀 검출 및 세포극 지역화4에적합한 알고리즘을 특징으로 하는 이미지 분석 스크립트를 사용하여 획득및 최종 적으로 분석된다.
3. 진균 결핵 H37Rv (GFP-H37Rv) 문화 조건을 표현하는 녹색 형광 단백질
장기 보관을 위해 GFP-H37Rv는 D-PBS(유리병당 약 1 x 108 균주)로 동결되었습니다.
- 미들브룩 OADC 농축 10%, 글리세롤 0.5%, 트웬-80 0.05%, 하이그로마이신 B(50 μg/ml)로 보충된 7H9 국물 중형 50ml를 함유한 Erlenmeyer 플라스크에서 GFP-H37Rv의 냉동 육수 바이알 1개를 재차 중단합니다.
- 37 °C에서 8 일 동안 배양하십시오.
- GFP-H37Rv 배양의 OD600을 측정합니다.
- GFP-H37Rv 배양을 희석하여 미들브룩 OADC 농축10%, 글리세롤 0.5%, 트위엔-80 0.05%, 하이그로미신 B(50 μg/ml)로 보충된 신선한 7H9 국물 배지에서 OD 600 = 0.1을 얻습니다.
- GFP-H37Rv를 37°C에서 37°C에서 8일 더 배양한 후 분석에 사용한다.
4. 전신 혈액 또는 버피 코트 준비에서 인간의 말초 혈액 단화 세포 정화
- 1%의 FBS를 함유한 1x D-PBS(MgCl 2 및 CaCl2에서 무료)로 혈액 파우치2x를희석시합니다.
- Ficoll 밀도 그라데이션 원심분리에 의해 단핵구를 400 x g에서 20분 동안 분리합니다.
- 격리된 단핵구를 수집합니다.
- 1x D-PBS(MgCl2 및 CaCl2에서무료)로 모노사이클 3x를 세척하여 실온에서 10분 동안 400 x g에서 원심분리로 1% FBS를 함유하고 있습니다.
- 세포를 최대 1 x 107 셀/ml로 농축합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 CD14 자성 구슬을 사용하여 단백구를 정화합니다(재료 참조).
- CD14-단핵구 정제 후, RPMI 1640에서 1.5 x 106 셀/ml의 세포를 종자 10% FBS와 40 ng/ml의 인간 대식세포 콜로니 자극 인자(hM-CSF)를 보완하고 5%CO2를함유한 대기 중 37°C에서 4일 동안 배양하였다.
- 4일 후 신선한 RPMI 1640으로 배지를 10% FBS와 40 ng/mlhM-CSF로 보완하고 5%CO2를함유한 대기 중 37°C에서 2일간 배양하였다.
- 6 일 후, 세포는 분석에 사용할 수 있습니다.
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Representative Results
높은 처리량 게놈 와이드 siRNA 스크리닝
Mtb는 체외뿐만 아니라 여러 가지 다른 폐 상피 세포에서 면역 세포를 식민지화 할 수 있습니다. 예를 들어, Mtb는인간 형 II 폐렴구균5-7의모델로 일반적으로 사용되는 A549 상피 세포를 감염시키고 손상시킬 수 있다. Dectin-1은 A549 세포에서 세포 내 진균 성장에 Mtb uptake, 프로염증 반응 및 항균 효과에 관여하는 숙주 세포 수용체로 보고되었다8. 프로토콜 1에 기술된 siRNA 상태는 침묵 효율의 85%를 이끌어 냈습니다 (데이터는 도시되지 않음). siRNA를 가진 침묵 Dectin-1 발현은 A549 세포에 있는 세포내 진균 량의 감소로 이끌어 냈습니다. 실제로, 3일간의 침묵과 5일간의 감염 후, 감염된 세포의 백분율은 비표적 스크램블 siRNA(그림2A 및 2B)에감염된 세포에 비해 Dectin-1 침묵 A549 세포에서 두 배 감소된다. 우리는 Z 점수를 정의하기 위해 스크램블에 비해 siRNA 표적 Dectin-1의 샘플 기반 정규화를 적용했습니다. 도 2C에도시된 바와 같이, 우리는 siRNA 표적 Dectin-1에 대해 -15 주위의 Z 점수 평균을 얻었습니다. Dectin-1은 Dectin siRNA와 동일한 표현형을 가질 수 있는 폐렴구에 Mtb 식민지화에 관여하는 다른 새로운 호스트 인자를 발견하기 위해 siRNA 화면에 대한 긍정적 인 제어로 사용될 수 있습니다. 화면 동안 각 마이크로 플레이트에 대한 제어로서 표현형에 영향을 미치는 siRNA를 사용하면 전체 게놈 스크린 분석을 수행하려는 경우 각 플레이트의 정상화가 가능합니다. 통계적 파라미터 Z'는 0.1을 사용하여 스크램블 및 siRNA 표적 Dectin1에 대한 제어 기반 정규화를 사용하여 siRNA 스크리닝 데이터의 유효성을 검사할 수 있는 값이다.
고함량 복합 스크리닝
세포내 세균 성장에 대한 화합물 효율은 투여량 반응 곡선(DRC)을 확립하고 기준 양성 화합물 및 음수 화합물 용매 제어로 정규화하여 평가된다. 2개의 기준 화합물, 이소니아지드(INH) 및 리팜피신(RIF)의 대표적인 DRC가, Mtb 성장에 대하여 활성이 도 3에도시된다. 이러한 곡선은 GFP 발현 Mtb H37Rv 균주에 의해 감염된 인간 1차 대식세포에서 얻어지며, 5일 후 판독을 통해 감염 후 판독을 한다. DMSO와 INH는 각각 1%와 0.1 μg/ml의 최종 농도에서 일반적으로 음수 및 양성 제어로 사용되며, 기저 효율 수준(0및 100%)을 제공합니다. (그림3A). 도 4B에상세히 설명된 영상 분석 과정에 따라, 다중 파라메트릭 데이터는 자동 공초점 현미경에 의해 취해진 감염된 인간 대식세포의 공초점 형광 심상에서 추출된다. 숙주 세포에서 Mtb의 세포 내 복제에 영향을 미치는 활성 화합물은 진균 하중의 감소를 주도, 이는 사진에 세포에서 GFP 신호의 영역에 해당(도 3B). 세포내 세균 영역과 총 세포 영역 사이의 비율은 이미지 기반 분석 소프트웨어를 사용하여 계산되며 DRC(도3B)를생성하는 화합물 농도의 기능으로 플롯됩니다. 이러한 곡선은 세균 부하를 50%(IC50)로감소시키고 세균 복제(MIC99)의99%를 억제하는 데 필요한 최소 농도(도3C)의측정을 허용한다. Z'는 대조군 DMSO 1%와 제어INH 0.1 μg/ml에 기초하여 0.49였다. 이 Z'는 0.5에 가까우며 이 분석의 유효성을 검사할 수 있습니다.
그림 1. 시각적 높은 콘텐츠 스크리닝 접근 방식. siRNA(A),화학 화합물(B)및 Mtb 돌연변이(C)스크린에 사용되는 Mtb 감염 모델 시스템의 회로도 표현. (A)siRNA 라이브러리 스크린: 세포는 역형 경질 방법을 사용하여 384웰 플레이트에서 3일 동안 siRNA로 감염되었다. siRNA 전감염 된 세포는GFP-Mtb에 감염되었고 5 % CO2를포함하는 대기에서 37 °C에서 5 일 동안 배양되었다. 그 때 세포는 염색되고 이미지는 자동화된 공초점 현미경을 사용하여 집합되었습니다. (B)화합물 라이브러리 스크린: 화합물은 384웰 플레이트로 배분되었다. 세포 현탁액 및GFP-Mtb는 37°C에서 2시간 동안 함께 배양하였다. 감염된 세포는 플레이트에서 씨를 뿌리고 5%CO2를포함하는 대기에서 37°C에서 5일 동안 배양되었다. 그 때 세포는 염색되고 이미지는 자동화된 공초점 현미경을 사용하여 집합되었습니다. (C)형광-Mtb 돌연변이 라이브러리: 형광 Mtb 돌연변이체는 384웰 플레이트로 시드되고 숙주 세포 현탁액이 분배되었다. 인큐베이션 시간은 분석에 따라 다양합니다. 세포 또는 세포 소포는 자동화된 이미지 수집 전에 염색되었습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. Dectin-1 침묵은 A549 세포에 있는 Mtb 식민지에 충격을. (A)대표적인 공초점 영상(10X 에어렌즈)은 비표적성 siRNA(스크램블) 또는 데스티인-1에 특이적인 siRNA로 5일간 GFP-Mtb H37Rv(MOI5)에 감염되었다. 스케일 바는 200 μm(A)GFP-Mtb H37Rv를 나타내고 녹색으로 시각화되었고, 빨간색의 셀. 세포수(A. 세포 검출) 및 세포내 GFP-Mtb H37Rv 부하(A. 세균 영역)는 이미지 기반 분석 소프트웨어를 사용하여 결정되었다. (B)스크램블 시RNA(블루 원) 및 데신-1 siRNA(빨간 원)의 5개 복제(w1 ~ w5)에서 감염된 A549 세포의 백분율의 그래픽 표현. (C)스크램블 시RNA 및 데신-1 siRNA의 Z 점수 평균의 그래픽 표현. (*** p-값 < 0.0001). 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 인간 대식세포에서 Mtb에 대한 활성 기준 화합물의 투여량 반응 곡선. (A와 B)대표적인 공초점 영상(20X 수분 렌즈)의 인간 대식세포(적색, 적색 형광염으로 표지된 세포)는 5일간 MOI1을 가진 GFP-Mtb H37Rv(녹색)에 감염되었다. 스케일 바는 50 μm을 나타냅니다. (a)DMSO 1%로 배양된 감염된 세포의 이미지는 분석에서 음의 대조군으로 사용된다. (b)감염된 세포의 이미지는 두 개의 기준 화합물이 증가하여 이소나치드(INH) 및 리팜피신(RIF)의 농도를 증가시한다. (C)INH 및 RIF의 용량 반응 곡선(DRC). 이미지 기반 분석을 통해 각 화합물에 대해 DRC의 측정을 테스트할 수 있었습니다. DRC는 세포내 GFP-세균 영역과 총 세포 영역(Y축) 사이의 비율을 나타내며, 화합물 농도(로그 스케일, x축)의 기능에서. 각 그래프에서, 화합물의 DRC는 음의 대조군 DMSO 1%(0% 억제) 및 양성 대조군 INH의 농도0.1 μg/ml(100% 억제)로 정규화되었다. 각 화합물에 대해, 세균식민지(IC 50)와 최소한의 억제 농도(MIC99)의50%를억제하는 데 필요한 농도는 DRC로부터 계산되었다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 형광성 세포 내 균균을 결정하는 표준 이미지 기반 분석. 384웰 플레이트의 이미지는 자동 공초점 현미경을 사용하여 획득되었습니다. 이 경우 동일한 웰(필드)의 4가지 이미지가 기록되었습니다. 각 필드는 이미지 기반 분석 소프트웨어 아카펠라 2.6(Perkin Elmer)을 사용하여 분석하였다. (A)각 필드에는 2개의 채널(2색), 박테리아(녹색)와 세포 핵(blue channel)에 대한 1개의 채널이 포함되어 있으며, 이는 다음과 같은 알고리즘을 사용하여 분할되었다: i)내장된 아카펠라 절차를 이용하여 핵 검출; ii)세포질 검출은 핵 집단에 기초하여, 내장된 아카펠라 절차를 이용하여, iii)박테리아 검출은 수동으로 정의된 임계값보다 높은 픽셀만 유지하여, iv)감염된 세포를 식별하기 위해 박테리아 위치와 세포를 병합하는 것을 한다. 최종 결과는, 4개의 필드의 평균으로 표현되는, 총 세균영역, 세포의 총 수, 감염된 세포의 백분율 및 세포당 세균 지역(모든 감염된 세포의 평균)이다. (b)각 필드에는 다음 알고리즘을 사용하여 분할된 박테리아(green channel)와 세포 핵 및 세포질(far-red channel)에 대한 두 개의 채널이 포함되어 있습니다. ii)수동으로 정의된 임계값(각 채널에 자체 임계값을가지고 있음)보다 높은 픽셀만 유지하여 각 채널에 대한 나머지 픽셀 수를 계산하고, iv)채널을 병합하고 박테리아와 핵이 공유하는 픽셀 수를 계산하여 세포내 박테리아를 정량화한다. 최종 결과는, 4개의 필드의 평균으로 표현되는, 총 세균 지역, 총 세포 영역, 세포내 세균의 총 면적 및 세포내 세균 영역과 세포의 총 면적 사이 비율입니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 여기에 GFP 표현 Mtb H37Rv 균주를 사용하여 표현 형광 숙주 세포를 감염시키는 표현적 분석에 필요한 방법을 설명, 이는 높은 함량 / 높은 처리량 스크린에 적합하게. 이 프로토콜은 광범위한 화합물, 형광 프로브 및 Mtb 돌연변이체에 적용될 수 있습니다. 위에서 설명한 각 프로토콜에 대해 이미지 수집 전에 고정 및 면역 라벨링 단계를 수행할 수 있습니다. 우리는 이미지를 얻기 위해 20X (NA 0.70) 또는 60X (NA 1.2) 물 렌즈가 장착 된 자동 형광 공초점 현미경을 사용합니다. 공초점 현미경에는 405, 488, 561 및 640 nm 흥분 레이저가 장착되어 있습니다. 방출된 형광은 450-690 nm에 이르는 검출 파장을 덮는 필터 세트와 관련된 3대의 카메라를 사용하여 캡처됩니다. 현미경 흥분 및 방출 설정의 조정은 각 실험에 사용된 염료 또는 불소크롬의 모형에 달려 있다는 것을 주의하는 것이 중요합니다. 페노티픽 어세스의 경우, DAPI 또는 Hoechst는 일반적으로 5 μg/ml에서 10분 동안 핵을 염색하는 데 사용됩니다. 그러나, 세포는 또한 세포질, 막 또는 세포골격의 검출을 위해 특정한 다른 형광염으로 얼룩질 수 있다. 이미지 수집 후 이미지 기반 분석 소프트웨어를 사용하여 사진을 분석해야 합니다. 각 픽셀의 강도에 기초한 세포 세분화 알고리즘은 각각 세포 수 또는 세포내 세균 영역을 확인하는 데 사용되어야 합니다(그림 4참조). 생성된 데이터는 분석의 견고성과 정확성을 검증하기 위해 통계기반 수용 기준에 무게를 두어야 합니다.
대규모 고처리량 화면은 시간과 리소스소모적인 실험입니다. 따라서 분석의 적합성을 미리 평가하는 것이 매우 중요합니다. phenotypic 화면에서 수집된 데이터는 Excel과 같은 스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 시각화되었으며 일반적으로 플레이트당 정규화되었습니다. siRNA및 소분자 스크린 둘 다에 이용되는 일반적인 질 측정지는 Z입니다. Z는 양수 및 음수 컨트롤9의평균 및 표준 편차로 정의됩니다. Z는 분석 응답이 샘플의 본격적인 화면에 대한 응용 프로그램의 유효성을 검사할 만큼 충분히 큰지 여부를 정량화합니다. Z의 범위는 매우 좋은 분석으로 >0.5, >0 허용 분석 및 <0 받아 들일 수없는 분석으로, 1에 음수 무한대입니다. 대조군의 강도가 Z > 0.5로 분석의 유효성을 검사할 수 있는 소분자 스크린과 비교하여, siRNA 스크린의 가변성은 더 낮은 경향이 있는 Z(0.0-0.5 사이)10에영향을 미친다. 실제로, siRNA 스크린의 성공은 i)세포내 시RNA 전달의 효율, ii)경질및 iii)유전자 침묵의 효율을 위한 분석 조건의 최적화에 달려 있다. siRNA는 제조자의 transfection 프로토콜에 따라 HeLa와 같은 각종 세포주에서 쉽게 전염될 수 있습니다, 그러나 대식세포를 포함하여 몇몇 세포주에서 능률적인 siRNA transfection는 아직도 도전남아 있습니다. 그럼에도 불구하고, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)의 바이러스 벡터 매개 발현은 좋은대안(11)을나타낼 수 있다. 해석의 어려움을 피하기 위해 siRNA 화면에서 수집된 데이터는 일반 표준 분포에 비해 자주 정규화되어 각점(10,12)에대한 Z-score(Z-값이라고도 함)를 정의합니다. 그런 다음 히트 샘플은 일반적으로 -2 미만 또는 +2 미만에 속하는 Z 점수에 따라 순위가 매겨졌습니다. 마지막으로 기본 화면에서 선택한 조회는 기본 화면에서 관찰된 표현형을 확인하기 위해 더 많은 복제를 포함하여 보조 화면에서 다시 테스트되었습니다.
우리의 프로토콜은 장비가있는 소규모 스크린에 쉽게 적용 할 수 있습니다. 이를 달성하기 위해서는, 마이크로 티터 플레이트내의 분석 소형화 및 분자 라이브러리의 조작이 보존, 분배 및 혼합 의 과정을 최적화하는 데 필요하다13. 또한, 마이크로 티터 플레이트의 분석 조건을 정확하고 재현적으로 제어하기 위해 디스펜서를 포함한 자동화된 로봇 플랫폼을 사용하는 것이 좋습니다. 높은 처리량 스크리닝(HTS)에 의해 생성된 방대한 양의 데이터는 또한 데이터베이스와 공초점 사진, 데이터 저장 및 전송의 이미지 분석을 위한 조정된 파이프라인에 의해 관리되어야 합니다. 이 보고서에 제시된 약은 생물안전 수준 3 시설(BSL3)에서 수행되었습니다. BSL3의 안전을 엄격하게 준수하여 화면의 어려움을 증가시킵니다. 실제로, 스크린에 필요한 많은 장비는 BSL3에서 사용할 수 있어야 하며 오염으로부터 작업자와 환경을 보호하기 위해 격리되어야 합니다. 따라서 BSL3에 적응된 파이프라인을 설치하려면 많은 공간이 필요했습니다. 이러한 이유로, 우리의 프로토콜은 플레이트에 siRNA 트랜스포션 및 화합물 전송과 같은 BSL3를 수행 하는 단계의 최대를 가지고 개발 되었다. 화상 획득 단계를 통해 세포 감염은 BSL3 조건에서 수행되었다. 그런 다음 이미지를 전용 서버로 전송하고 BSL3에서 분석했습니다.
여기에 설명된 표현성 분석법은 두 가지 이미지 분석방법(도 4)을기반으로 하였다. siRNA 스크리닝에 사용되는 첫 번째 방법은 감염된 세포의 수를 제공하도록 설계되었습니다. 이 매개 변수는 Mtb 세포 내 복제에 대한 유전자 침묵의 효과를 효율적으로 비교하는 것으로 나타났습니다. 그러나 화합물을 선별할 때, 세포의 총 면적에 기초한 보다 기본적인 판독은 활성 화합물을 명확하게 식별하기에 충분했다. 이 두 번째 방법은 구현하기 쉽기 때문에 화합물 스크리닝에서 발생하는 이미지의 분석을 선호하였다. 더 나아가기 위해, 더 많은 형광 염료 및/또는 라벨링 프로브가 추가될 수 있고 화상 분석 스크립트는 박테리아의 세포 내 인신 매매뿐만 아니라 공동지역화, 핵 및 세포 형태학, 세포 사멸, 세균 집계와 같은 다중 파라메트릭 데이터를 생성하도록 최적화될 수 있었다. 세포내 인신 매매 또는 공동 현지화 에 대해서는 누적 평가를 적용하기 위해 Z 스택을 얻는 것이 필수적이라는 점에 유의해야 합니다.
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Disclosures
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
Acknowledgments
이 작업에 대한 재정 지원은 유럽 공동체 (ERC-STG INTRACELLTB 그랜트 n ° 260901, MM4TB 그랜트 n ° 260872), 기관 국립 드 레체쉬, 페더 (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed), 및 지역 노르드 파스 칼레에 의해 제공되었다. 우리는 플랫폼 BICeL에서 가스파드 딜로이슨, 엘리자베스 베르크마이스터, 안토니노 본지오반니, 프랭크 라폰트의 기술적 도움을 감사하게 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µclear-plate black, 384-well | Greiner Bio-One | 781091 | 127.8/86/15 MM with Lid, TC treated |
| CellCarrier 384-well plate | PerkinElmer | 6007550 | Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated |
| V-bottom white, 384-well plate | Greiner Bio-One | 781280 | |
| sealing tape, breathable, sterile | Corning | 3345 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | Transfection reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Cell culture medium |
| D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 2610040-79 | |
| Ficoll Paque PLUS | Dutscher | 17-1440-03 | Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi | 130-050-201 | Purification of CD14+ Monocytes |
| Human M-CSF, premium gr. (1000 μg) | Miltenyi | 130-096-493 | Macrophage Colony Stimulating Factor |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | Columns for CD14+ Monocytes isolation |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Mycobacteria culture |
| Glycerol high purity | Euromedex | 50405-EX | Mycobacteria culture |
| Middlebrook OADC enrichment | Becton-Dickinson | 211886 | Mycobacteria culture |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Mycobacteria culture |
| Versene 1x | Life Technologies | 15040033 | Nonenzymatic cell dissociation solution |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Nuclei dye |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nuclei dye |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Nuclei/cytoplasm dye |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT5014 | Cell fixation solution |
| siRNA targeting Dectin-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* Nontargeted siRNA pool | Dharmacon | D-001206-14 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Isoniazid (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-50G | antibiotic |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | antibiotic |
| Amikacin | Sigma-Aldrich | A1774 | antibiotic |
| Automated Confocal Microscope OPERA | PerkinElmer | Image acquisition | |
| Columbus 2.3.1 Server Database | PerkinElmer | Data transfer, storage, and analysis | |
| Acapella 2.6 software | PerkinElmer | Image-based analysis | |
| GraphPad Prism5 software | GraphPad | Statistical analysis | |
| Excel 2010 | Microsoft | Statistical analysis |
References
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