Summary
Hier beschrijven we een fenotypische test die van toepassing is op de high-throughput/high-content schermen van small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemische verbinding en Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. Deze methode is gebaseerd op de detectie van fluorescerend gelabelde Mycobacterium tuberculosis in fluorescerend gelabelde gastheercel met behulp van geautomatiseerde confocale microscopie.
Abstract
Ondanks de beschikbaarheid van therapie en vaccin blijft tuberculose (tbc) een van de meest dodelijke en wijdverspreide bacteriële infecties ter wereld. Sinds enkele decennia is de plotselinge uitbarsting van multi- en uitgebreid resistente stammen een ernstige bedreiging voor de bestrijding van tuberculose. Daarom is het essentieel om nieuwe doelen en paden te identificeren die van cruciaal belang zijn voor de veroorzaker van de tuberculose, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) en om te zoeken naar nieuwe chemicaliën die tbc-medicijnen kunnen worden. Een aanpak is het opzetten van methoden die geschikt zijn voor de genetische en chemische schermen van grootschalige bibliotheken, waardoor het zoeken naar een naald in een hooiberg mogelijk is. Hiervoor ontwikkelden we een fenotypische test gebaseerd op de detectie van fluorescerend gelabelde Mtb in fluorescerend gelabelde hostcellen met behulp van geautomatiseerde confocale microscopie. Deze in vitro test maakt een beeldgebaseerde kwantificering van het kolonisatieproces van Mtb in de host mogelijk en is geoptimaliseerd voor het 384-well microplate-formaat, dat geschikt is voor schermen van siRNA-, chemische verbindingen- of Mtb-mutantbibliotheken. De beelden worden vervolgens verwerkt voor multiparametrische analyse, die voorlezen geeft over de pathogenese van Mtb in gastheercellen.
Introduction
Onder de opkomende en opnieuw opkomende infectieuze pathogenen die de afgelopen jaren zijn gemeld, heeft Mycobacterium tuberculosis (Mtb) een prominente plaats in voor 1,4 miljoen sterfgevallen en 8,7 miljoen nieuwe infecties in 2011 (Global tuberculosis report 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). Ondanks de beschikbaarheid van multidrug therapieën, het aantal geïnfecteerde mensen is nog steeds in opkomst en multidrug resistente (MDR) evenals uitgebreid drug resistente (XDR) Mtb zijn snel verspreid over de hele wereld1. Bovendien, wanneer rekening wordt gehouden met de aanwezigheid van Mtb-antigenen, is het duidelijk dat een derde van de wereldbevolking wordt beschouwd als latent geïnfecteerd door Mtb. Statistisch gezien is er in één van de tien gevallen evolutie naar de actieve vorm van de ziekte met daaropvolgende klinische symptomen2. Daarom zijn er dringend nieuwe middelen nodig om Mtb te bestrijden. In deze context ontwikkelden we een in vitro visuele fenotypische test gebaseerd op het monitoren van Mtb-invasie en -vermenigvuldiging in gastheercellen door geautomatiseerde confocale fluorescentiemicroscopie3. De aanpassing van de test in 384-well microtiterplaten in combinatie met geautomatiseerde beeldverwerving en -analyse maakte High-content/High-throughput Screening (HC/HTS) van middelgrote bibliotheken van verbindingen, siRNAs en bacteriële mutanten mogelijk. De screening van een genoombrede RNAi-bibliotheek op deze fenotypische test maakte het dus mogelijk om de belangrijkste gastheerfactoren te identificeren die betrokken zijn bij Mtb-handel en intracellulaire replicatie, maar ook de opheldering van gastheerroutes die door de tuberkel bacillus worden geëxploiteerd. Een andere aanpassing van deze specifieke fenotypische test was voor de identificatie van bacteriële factoren die essentieel zijn voor Mtb intra-phagosomale persistentie. De arrestatie van fagosome rijping wordt bijvoorbeeld beschouwd als een van de belangrijkste mechanismen die het overleven en repliceren van Mtb in macrofaag vergemakkelijkt. De monitoring van de subcellulaire lokalisatie van Mtb knock-out mutanten in fluorescerend gelabelde zure compartimenten maakte het mogelijk om bacteriële genen te identificeren die betrokken zijn bij het overlevingsproces4. Ten slotte biedt de hoog-inhoud beeldvorming van Mtb ook een uitstekende methode om de efficiëntie van geneesmiddelen te kwantificeren voor het remmen van verschillende verschijnselen zoals intracellulaire bacteriële groei3. Al met al maakt dit type fenotypische test met hoge doorvoer het mogelijk om de ontdekking van geneesmiddelen tegen tbc te versnellen en de gegevens die door deze verschillende benaderingen worden verzameld, dragen bij aan een beter begrip van de gastheermanipulatie die door Mtbwordt uitgeoefend .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SiRNA-screening met hoge doorvoer genoombreed
Screening uitgevoerd in een menselijke Type-II pneumocyten model A549 cellijn bij infectie met Mtb H37Rv uitdrukkend Groen Fluorescerend Eiwit (GFP). Deze procedure is beschreven in figuur 1A.
- Resuspend de gedroogde siRNA-bibliotheek die is opgeslagen in moederplaten (96-putplaten) met 1x siRNA-buffer om een concentratie van 4 μM te bereiken en breng vervolgens 10 μl van het mengsel over in een 384-put dochterplaat (dochterplaat 1).
- Voeg 10 μl 1x siRNA buffer toe in dochterplaat 1 om siRNA 2 keer te verdunnen. Na siRNA resuspensie worden platen verzegeld met afpelbare aluminium afdichting en kunnen ze ten minste 6 maanden en maximaal 2-3 jaar bij -20 °C worden bewaard, maar de bewaartijd kan variëren afhankelijk van de aanbevelingen van de fabrikant van de siRNA-bibliotheek.
- Verdun siRNAs in dochterplaat 1 in dochterplaat 2 om een concentratie van 500 nM te bereiken. Na siRNA resuspensie worden platen verzegeld met afpelbare aluminium afdichting en kunnen ze ten minste 6 maanden en maximaal 2-3 jaar bij -20 °C worden bewaard, maar de bewaartijd kan variëren afhankelijk van de aanbevelingen van de fabrikant van de siRNA-bibliotheek.
- Ontdooi voor gebruik dochterplaat 2 bij kamertemperatuur.
- Neem 2,5 μl siRNA van dochterplaat 2 en plaats het in een 384-well assay plaat.
- Voeg in dezelfde 384-well assay plaat in stap 1.5 2,5 μl negatieve en positieve controle siRNA toe aan hun respectievelijke putten.
- Verdun het transfectiereagens in 1x D-PBS om voldoende oplossing te leveren om 0,1 μl transfectiereagens in elke put te leveren en de verdunde transfectieoplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur voor te stellen.
- Voeg 7,5 μl van het mengsel van transfectiereagens/PBS-oplossing toe aan elke put in de testplaat en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 40 μl A549-cellen (1.500 cellen/put) toe die zijn gesuspendeerd in RPMI 1640 medium, aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS). Cellen gedurende een incubatieperiode van 3 dagen bij 37 °C bewaren in een atmosfeer met 5% CO2. Deze cellen delen elke 24 uur, dus ongeveer 12.000 cellen bevinden zich drie dagen na transfectie in de putten.
- Was een twee weken oude GFP-expresserende Mtb H37Rv-cultuur uit met D-PBS (vrij van MgCl2 en CaCl2)door centrifugeren op 4.000 x g gedurende 5 minuten en gooi de wasbeurten weg. Herhaal deze stap 3x. (Voor GFP-Mtb H37Rv cultuuromstandigheden zie Protocol 3).
- Schors de bacteriële pellet in 10 ml RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS en decanteer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om bacteriële aggregaten te laten bezinken.
- Verzamel het bacteriële supernatant en meet OD600 (OD600 moet tussen 0,6-0,8) en GFP-fluorescentie (RFU-waarde) zijn met behulp van een microplaatlezer om de bacteriële concentratie te bepalen. Bereken de titer van de suspensie met behulp van een referentieregressielijn met RFU-waarde = f (CFU-waarde) die vóór het experiment was gegenereerd op een andere cultuur die onder dezelfde omstandigheden was voorbereid. Bereid bacteriële suspensie voor die 2,4 x10 6 bacteriën/ml bevat, wat overeenkomt met een veelheid aan infecties (MOI) van 5.
- Verwijder het medium in de 384-well assay plate en voeg 25 μl vers bereide bacteriële suspensie toe.
- Incubeer de 384-well assay plaat bij 37 °C gedurende 5 uur in een atmosfeer die 5% CO2bevat .
- Verwijder het medium en was de cellen voorzichtig met RPMI medium aangevuld met 10% FBS 3x.
- Om de resterende extracellulaire bacteriën te doden, moet u de cellen behandelen met 50 μl vers RPMI-FBS-medium met 50 μg/ml amikacine bij 37 °C gedurende 1 uur in een atmosfeer met 5% CO2.
- Verwijder het medium bevattende amikacine en voeg 50 μl vers RPMI-medium toe, aangevuld met 10% FBS. Incubeer de 384-well assay plaat bij 37 °C gedurende 5 dagen in een atmosfeer die 5% CO2bevat .
- Voeg vóór het verkrijgen van het beeld 10 μl vers bereide 30 μg/ml DAPI toe in PBS (eindconcentratie 5 μg/ml) en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C.
- Plaats de plaat in een geautomatiseerde confocale microscoop.
Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken. - Stel de belichtingsparameters in. Registreer DAPI fluorescentie met excitatielaser 405 nm met emissiefilter 450 nm en GFP fluorescentie met excitatielaser 488 nm met emissiefilter 520 nm.
Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken. - Selecteer de putten en de velden in elke aan te verkrijgen put, die vervolgens lay-out- en sublayoutparameters wordt genoemd.
Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken. - Genereer het experimenteerbestand met behulp van de parameters uit stap 1.20 en 1.21 en voer de automatische verwerving uit.
Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken. - Afbeeldingen overbrengen naar een externe server.
Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken. - Evalueer afbeeldingen met behulp van beeldanalysesoftware. Detecteer celkernen van het DAPI-kanaal met behulp van het nuclei-detectiealgoritme en het bacteriële gebied van het GFP-kanaal met behulp van het algoritme pixelintensiteitseigenschappen (figuur 4A).
Opmerking: Dit protocol is geoptimaliseerd om het effect van genuitschakeling op de intracellulaire Mtb-groei te bestuderen. Mtb is een langzaam groeiende bacterie die zich elke 20 uur in optimale omstandigheden verdeelt. Na 5 dagen na infectie is de hoeveelheid extracellulaire Mtb nog steeds laag bij afwezigheid van cellysis en had geen invloed op de kwaliteit van de analyse. Dit protocol moet worden geoptimaliseerd in termen van lengte van antibioticabehandeling en incubatietijd om te worden aangepast voor siRNA-schermen met behulp van snelgroeiende bacteriën zoals Mycobacteria smegmatis en Escherichia coli die uitgebreid worden vrijgegeven en nieuwe cellen kunnen infecteren.
2. Compound Screening met hoge doorvoer
Screening uitgevoerd op Mtb H37Rv geïnfecteerde hostcellen. Deze procedure is beschreven in figuur 1B.
- Ontdooi de 384-put moederplaten met de samengestelde bibliotheek oplosbaar in DMSO 100%. Breng 0,5 μl van de verbindingen over in 384-well dochterplaten met 10 μl RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS.
- Was een twee weken oude GFP-expresserende Mtb H37Rv-cultuur uit met D-PBS (vrij van MgCl2 en CaCl2)door centrifugeren op 4.000 x g gedurende 5 minuten en gooi de wasbeurten weg. Herhaal deze stap 3x (Voor GFP-Mtb H37Rv cultuuromstandigheden zie Protocol 3).
- Schors de bacteriële pellet in 10 ml RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS en decanteer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om bacteriële aggregaten te laten bezinken.
- Verzamel het bacteriële supernatant en meet OD600 (OD600 moet tussen 0,6-0,8) en GFP-fluorescentie (RFU-waarde) met behulp van een microplaatlezer. Bereken de titer van de suspensie met behulp van een referentieregressielijn met RFU-waarde = f (CFU-waarde) die vóór het experiment was gegenereerd. Typische concentratie is 1 x 108 bacteriën/ml.
- Oogst 6 dagen oude primaire menselijke macrofagen bij 4 x 105 cellen/ml in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en 50 ng/ml recombinante humane M-CSF (Voor menselijke perifere bloedmonocytencellen zuivering en macrofagen differentiatie zie Protocol 4).
- Incubeer de verdunde primaire cellen met bacillen bij verschillende MOI, variërend van 1-5, in suspensie met mild schudden bij 90 tpm gedurende 2 uur bij 37 °C.
- Was de geïnfecteerde cellen door centrifugeren op 350 x g om de extracellulaire bacteriën te verwijderen. Na elke centrifugeerstap, resuspend de pellet in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS. Herhaal deze stap 2x.
- Schorste de geïnfecteerde cellen in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS en amikacine bij 50 μg/ml en incubeer de suspensie met mild schudden gedurende 1 uur bij 37 °C.
- Verwijder het celkweekmedium dat amikacine bevat door centrifugeren bij 350 x g en was de geïnfecteerde cellen met een compleet RPMI 1640-medium aangevuld met 10% FBS en 50 ng/ml recombinant humaan M-CSF. Herhaal dit één keer.
- Voeg in stap 2.1 40 μl van de geïnfecteerde macrofagensususpensie toe in dezelfde testplaat, die al 10 μl van de samengestelde verdunningen bevat. De uiteindelijke concentratie DMSO in elke put is nu 1%.
- Incubeer de testplaten gedurende 5 dagen bij 37 °C in een atmosfeer met 5% CO2.
- Bevlek de levende cellen met celdoorlatende verrode fluorescerende kleurstof.
- Plaats de plaat in een geautomatiseerde confocale microscoop.
Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken. - Stel de belichtingsparameters in. Registreer verrode fluorescentie met excitatielaser 640 nm met emissiefilter 690 nm en GFP fluorescentie met excitatielaser 488 nm met emissiefilter 520 nm.
Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken. - Selecteer de putten en de velden in elke aan te verkrijgen put, die vervolgens lay-out- en sublayoutparameters wordt genoemd.
Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken. - Genereer het experimenteerbestand met behulp van de parameters uit stap 2.14 en 2.15 en voer de automatische acquisitie uit.
Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken. - Afbeeldingen overbrengen naar een externe server.
Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken. - Evalueer afbeeldingen met behulp van beeldanalysesoftware. Detecteer celgebied vanaf een ver rood kanaal met behulp van het algoritme pixelintensiteitseigenschappen en het bacteriële gebied van het GFP-kanaal met behulp van het algoritme pixelintensiteitseigenschappen (figuur 4B).
Opmerking: Dit protocol kan worden aangepast voor Mtb mutant library screening door verbindingen te vervangen door mutanten die een fluorescerend eiwit uitdrukken (One well/One mutant) (Figuur 1C, zie ook Brodin et al. 4). Fluorescerende mutanten worden eerst in putten gezaaid (20 μl bacteriële suspensie per put). Bacteriën worden dan teruggewonnen door 30 μl celsuspensie. Na centrifugeren bij 350 x g gedurende 1 min wordt de plaat bij 37 °C geïncubeerd in een atmosfeer met 5% CO2. Incubatietijd en MOI zijn afhankelijk van de test. Als voorbeeld, voor visualisatie van vroege cellulaire gebeurtenissen zoals fagosome verzuring, kunnen de cellen gedurende 2 uur worden geïnfecteerd met MOI variërend van 1-20. Lysosomen worden gekleurd met Lysotracker-kleurstof bij 2 μM gedurende 1,5 uur bij 37 °C in een atmosfeer met 5% CO2 en vervolgens gefixeerd met 10% formaline of 4% paraformaldehyde (PFA). Confocale afbeeldingen worden verkregen en uiteindelijk geanalyseerd met behulp van beeldanalysescripts met geschikte algoritmen voor lysosomendetectie en subcellulaire lokalisatie4.
3. Groene fluorescerende eiwit uitdrukken mycobacterium tuberculosis H37Rv (GFP-H37Rv) cultuuromstandigheden
Voor langdurige opslag werd GFP-H37Rv ingevroren in D-PBS (ongeveer 1 x 108 mycobacteriën per flacon).
- Resuspend één bevroren flacon GFP-H37Rv in een Erlenmeyer met 50 ml 7H9 bouillonmedium aangevuld met Middlebrook OADC verrijking 10%, Glycerol 0,5%, Tween-80 0,05% en Hygromycine B (50 μg/ml).
- Incubeer 8 dagen bij 37 °C.
- Meet OD600 van de GFP-H37Rv cultuur.
- Verdun de GFP-H37Rv-cultuur om OD600 = 0,1 te verkrijgen in vers 7H9 bouillonmedium aangevuld met Middlebrook OADC-verrijking 10%, Glycerol 0,5%, Tween-80 0,05% en Hygromycine B (50 μg/ml).
- Incubeer de GFP-H37Rv bij 37 °C gedurende 8 dagen meer voor gebruik voor de test.
4. Menselijke perifere bloedmonocytcellen zuivering van volbloed of Buffy-coat voorbereiding
- Verdun het bloedzakje 2x in 1x D-PBS (vrij van MgCl2 en CaCl2) met 1% FBS.
- Isoleer de monocyten door Ficoll dichtheid gradiënt centrifugeren op 400 x g gedurende 20 min.
- Verzamel de geïsoleerde monocyten.
- Was de monocyten 3x met 1x D-PBS (vrij van MgCl2 en CaCl2) met 1% FBS door centrifugeren op 400 x g gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
- Concentreer de cellen tot 1 x 107 cel/ml.
- Zuiver monocyten met behulp van CD14-magnetische kralen volgens het protocol van de fabrikant (zie Materialen).
- Na de zuivering van CD14-monocyten, zaait u de cellen op 1,5 x10 6 cel/ml in RPMI 1640 aangevuld met 10% FBS en 40 ng/ml menselijke macrofagen koloniestimulerende factor (hM-CSF) en gedurende 4 dagen geïncubeerd bij 37 °C in een atmosfeer met 5% CO2.
- Vervang na 4 dagen het medium door verse RPMI 1640 aangevuld met 10% FBS en 40 ng/ml hM-CSF en gedurende 2 dagen geïncubeerd bij 37 °C in een atmosfeer met 5% CO2.
- Na 6 dagen kunnen de cellen worden gebruikt voor de test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SiRNA-screening met hoge doorvoer voor het hele genoom
Mtb is in staat om immuuncellen in vitro te koloniseren, evenals verschillende andere longepitheelcellen. Mtbis bijvoorbeeld in staat om A549-epitheelcellen te infecteren en te beschadigen die vaak worden gebruikt als model voor pneumocyten van het menselijke type II5-7. Dectine-1 werd gemeld als een gastheercelreceptor die betrokken is bij de opname van Mtb, pro-inflammatoire respons en antibacterieel effect op intracellulaire mycobacteriële groei in A549-cellen8. siRNA-toestand beschreven in Protocol 1 leidde tot 85% van de geluiddempingsefficiëntie (gegevens niet weergegeven). Het dempen van de Dectine-1 expressie met siRNA leidde tot een afname van de intracellulaire mycobacteriën hoeveelheid in A549 cellen. Inderdaad, na 3 dagen van demping en 5 dagen van infectie, het percentage geïnfecteerde cellen wordt tweemaal verminderd in Dectine-1 gedempte A549 cellen in vergelijking met cellen getransfecteerd met nontargeting scramble siRNA (Figuren 2A en 2B). We pasten sample-based normalisatie van siRNA gerichte Dectine-1 toe in vergelijking met scramble om Z-score te definiëren. Zoals weergegeven in figuur 2C, hebben we een Z-score gemiddelde rond -15 verkregen voor siRNA gericht Dectine-1. Dectine-1 kan worden gebruikt als positieve controle voor het siRNA-scherm om andere nieuwe gastheerfactor te ontdekken die betrokken is bij Mtb-kolonisatie in pneumocyten die hetzelfde fenotype kunnen hebben als dat met het Dectin siRNA. Het gebruik van een siRNA-effect op het fenotype als een controle op elke microplaat tijdens het scherm maakt normalisatie van elke plaat mogelijk, wat handig is wanneer men een hele genoomschermanalyse wil uitvoeren. De statistische parameter Z' was 0,1 met behulp van op controle gebaseerde normalisatie op scramble en siRNA-gerichte Dectine1, wat een aanvaardbare waarde is voor de validatie van de siRNA-screeningsgegevens.
Samengestelde screening met hoog gehalte
De samengestelde efficiëntie op intracellulaire bacteriegroei wordt geëvalueerd door een dosisresponscurve (DRC) vast te stellen en genormaliseerd naar de referentiepositieve samenstellings- en negatieve oplosmiddelcontroles. Representatieve DRC van twee referentieverbindingen, isoniazide (INH) en rifampicine (RIF), actief tegen Mtb-groei, zijn weergegeven in figuur 3. Deze curven worden verkregen in menselijke primaire macrofagen geïnfecteerd door een GFP-expresserende Mtb H37Rv stam, met uitlezing na 5 dagen na infectie. DMSO en INH bij een eindconcentratie van respectievelijk 1% en 0,1 μg/ml worden vaak gebruikt als negatieve en positieve controles, waardoor basale efficiëntieniveaus (0 en 100%) (figuur 3A). Na het beeldanalyseproces dat in figuur 4Bwordt beschreven, worden multiparametrische gegevens geëxtraheerd uit confocale fluorescentiebeelden van geïnfecteerde menselijke macrofagen die door geautomatiseerde confocale microscoop zijn genomen. Actieve verbindingen die van invloed zijn op de intracellulaire replicatie van Mtb in gastheercellen leidden tot een afname van de mycobacteriële belasting, wat overeenkomt met het gebied van het GFP-signaal in cellen op afbeeldingen (Figuur 3B). De verhouding tussen intracellulair bacterieel gebied en totaal celoppervlak, berekend met behulp van op afbeeldingen gebaseerde analysesoftware, wordt uitgezet in functie van de samengestelde concentratie, die de DRC genereert (Figuur 3B). Deze curven maken het mogelijk zowel de concentratie te bepalen die nodig is om de bacteriële belasting met 50% (IC50) te verminderen als de minimale concentratie die nodig is om 99% van de bacteriële replicatie te remmen (MIC99) (figuur 3C). Z' op basis van de controle DMSO 1% en de controle-INH 0,1 μg/ml was 0,49. Deze Z', echt dicht bij 0,5, is acceptabel om deze test te valideren.
Figuur 1. Visuele screeningsbenaderingen met hoge inhoud. Schematische weergave van het Mtb-infectiemodelsysteem dat wordt gebruikt voor de schermen siRNA (A), chemische verbindingen (B) en Mtb-mutanten (C). (A) siRNA-bibliotheekscherm: de cellen werden gedurende 3 dagen met siRNA getransfecteerd in 384-putplaten met behulp van omgekeerde transfectiemethode. siRNA-getransfecteerde cellen werden geïnfecteerd metGFP-Mtb en gedurende 5 dagen geïncubeerd bij 37 °C in een atmosfeer met 5% CO2. De cellen werden vervolgens bevlekt en beelden werden verzameld met behulp van een geautomatiseerde confocale microscoop. (B) Compounds library screen: de compounds werden verdeeld in 384-well platen. Celsuspensie en GFP-Mtb werden samen geïncubeerd gedurende 2 uur bij 37 °C. Geïnfecteerde cellen werden in de platen gezaaid en gedurende 5 dagen bij 37 °C geïncubeerd in een atmosfeer met 5% CO2. De cellen werden vervolgens bevlekt en beelden werden verzameld met behulp van een geautomatiseerde confocale microscoop. (C) FluorescerendeMtb mutantenbibliotheek: de fluorescerende Mtb mutanten werden gezaaid in 384-put platen en de hostcel suspensie werd verdeeld. De incubatietijd varieerde afhankelijk van de test. De cellen of cellulaire blaasjes werden gekleurd voordat ze automatisch beeld kregen. Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Dectine-1 demping effecten op Mtb kolonisatie in A549 cellen. (A) Representatieve confocale beelden (10X luchtlens) van A549 cellen getransfecteerd met niet-doelgerichte siRNA (scramble) of met siRNA specifiek voor Dectine-1 en geïnfecteerd met GFP-Mtb H37Rv (MOI5) gedurende 5 dagen. De schaalbalk vertegenwoordigt 200 μm (A) GFP-Mtb H37Rv werden gevisualiseerd in groen en de cellen in rood. Het aantal cellen (A. Celdetectie) en de intracellulaire GFP-Mtb H37Rv belasting (A. Bacterieel gebied) werden bepaald met behulp van beeldgebaseerde analysesoftware. (B) Grafische weergave van het percentage geïnfecteerde A549-cellen in 5 repliceert (w1 tot w5) scramble siRNA (blauwe cirkels) en Dectine-1 siRNA (rode cirkels). (C) Grafische weergave van Z-score gemiddelde van Scramble siRNA en Dectin-1 siRNA. (*** p-waarde < 0,0001). Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Dosisresponscurve van actieve referentieverbindingen tegen Mtb in menselijke macrofagen. (A en B) Representatieve confocale beelden (20X waterlens) van menselijke macrofagen (rood, cel gelabeld met rode fluorescerende kleurstof) geïnfecteerd met GFP-Mtb H37Rv (groen) met een MOI1 gedurende 5 dagen. De schaalbalk vertegenwoordigt 50 μm. (A) Afbeeldingen van geïnfecteerde cellen geïncubeerd met DMSO 1% gebruikt als negatieve controle in de test. (B) Afbeeldingen van geïnfecteerde cellen geïncubeerd met toenemende concentratie van twee referentieverbindingen isonazid (INH) en rifampicine (RIF). (C) Dosis-responscurven (DRC) van INH en RIF. Beeldgebaseerde analyse maakte het mogelijk om de DRC voor elke geteste verbinding te bepalen. DRC vertegenwoordigt de verhouding tussen intracellulair GFP-bacteriegebied en totaal celoppervlak (Y-as), in functie van de samengestelde concentratie (logschaal, x-as). In elke grafiek werd de DRC van de verbinding genormaliseerd tot die van de negatieve controle DMSO 1% (0% inhibitie) en de positieve controle-INH bij een concentratie van 0,1 μg/ml (100% remming). Voor elke verbinding werden de concentratie die nodig is om 50% van de bacteriële kolonisatie (IC50) en de minimale remmende concentratie (MIC99) te remmen, berekend op basis van de DRC. Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Standaard beeldgebaseerde analyse om fluorescerende intracellulaire mycobacteriën te bepalen. Beelden van 384-putplaten werden verkregen met behulp van een geautomatiseerde confocale microscoop. In dit geval werden 4 verschillende afbeeldingen van dezelfde put (velden) opgenomen. Elk veld werd vervolgens geanalyseerd met behulp van beeldgebaseerde analysesoftware Acapella 2.6 (Perkin Elmer). (A) Elk veld bevatte twee kanalen (twee kleuren), één voor de bacteriën (groen) en één voor de celkernen (blauw kanaal), die werden gesegmenteerd met behulp van het volgende algoritme: i) kerndetectie met behulp van een ingebouwde Acapella-procedure, ii) cytoplasmadetectie, gebaseerd op de kernenpopulatie, met behulp van een ingebouwde Acapella-procedure, iii) bacteriedetectie door alleen pixels te houden die de intensiteit hoger zijn dan een handmatig gedefinieerde drempel, iv) celpositie samenvoegen met bacteriën. De uiteindelijke resultaten, uitgedrukt als een gemiddelde van de vier velden, zijn het totale bacteriële gebied, het totale aantal cellen, het percentage geïnfecteerde cellen en het bacteriële gebied per cel (gemiddelde van alle geïnfecteerde cellen). (B) Elk veld bevatte twee kanalen, één voor de bacteriën (groen kanaal) en één voor de celkernen en cytoplasma (verrood kanaal), die werden gesegmenteerd met behulp van het volgende algoritme: i) het oorspronkelijke kanaal filteren met behulp van een anti-mediaanfilter, ii) alleen pixels houden die de intensiteit hoger zijn dan een handmatig gedefinieerde drempel (elk kanaal heeft zijn eigen drempel), iii) het resterende aantal pixels voor elk kanaal tellen, iv) kanalen samenvoegen en het aantal pixelen tellen dat door beide bacteriën wordt gedeeld. De uiteindelijke resultaten, uitgedrukt als een gemiddelde van de vier velden, zijn het totale bacteriële gebied, het totale cellulaire gebied, het totale gebied van intracellulaire bacteriën en de verhouding tussen intracellulair bacteriegebied en totale celoppervlakte. Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven hier de methoden die nodig zijn voor een fenotypische test met behulp van een GFP-expresserende Mtb H37Rv-stam om fluorescerend gelabelde hostcellen te infecteren, waardoor het geschikt is voor schermen met een hoog gehalte / hoge doorvoer. Dit protocol kan worden toegepast op een breed scala aan verbindingen, fluorescerende sondes en Mtb-mutanten. Voor elk hierboven beschreven protocol kunnen fixatie- en immunolabelingstappen worden uitgevoerd voorafgaand aan het verkrijgen van afbeeldingen. We gebruiken een geautomatiseerde fluorescerende confocale microscoop uitgerust met een 20X (NA 0.70) of 60X (NA 1.2) waterlens om beelden te verkrijgen. De confocale microscoop is uitgerust met 405, 488, 561 en 640 nm excitatielasers. De uitgezonden fluorescentie wordt vastgelegd met behulp van 3 camera's die zijn gekoppeld aan een set filters met een detectiegolflengte variërend van 450-690 nm. Het is belangrijk op te merken dat de aanpassing van de microscoop excitatie en emissie-instellingen afhankelijk is van het type kleurstoffen of fluorchromen dat in elk experiment wordt gebruikt. Voor fenotypische assays worden DAPI of Hoechst vaak gebruikt bij 5 μg/ml gedurende 10 minuten om kernen te bevlekken. Cellen kunnen echter ook worden gekleurd met verschillende fluorescerende kleurstoffen die specifiek zijn voor de detectie van cytoplasma, membraan of cytoskelet. Na het verkrijgen van afbeeldingen moeten afbeeldingen worden geanalyseerd met behulp van een op afbeeldingen gebaseerde analysesoftware. Celsegmentatiealgoritmen op basis van de intensiteit van elke pixel moeten worden gebruikt om respectievelijk het aantal cellen of het intracellulaire bacteriële gebied vast te stellen (zie figuur 4). De gegenereerde gegevens moeten worden afgewogen tegen een statistisch gebaseerde acceptatiecriteria om de robuustheid en nauwkeurigheid van de test te valideren.
Grootschalige high-throughput schermen zijn tijd- en resource-verbruikende experimenten. Daarom is het van het grootste belang om vooraf de geschiktheid van de test te beoordelen. De gegevens verzameld van fenotypische schermen werden gevisualiseerd met behulp van spreadsheet software zoals Excel en over het algemeen genormaliseerd per plaat. De meest voorkomende kwaliteitsstatistieken die worden gebruikt voor zowel siRNA- als kleine moleculenschermen is de Z. De Z wordt gedefinieerd met gemiddelde en standaardafwijking van zowel positieve als negatieve controles9. De Z kwantificeert of de testrespons groot genoeg is om de toepassing ervan te valideren voor een volledig scherm met monsters. Het bereik van de Z is negatief oneindig tot 1, met >0,5 als een zeer goede test, >0 een acceptabele test en <0 een onaanvaardbare test. In vergelijking met de schermen met kleine moleculen waarvoor de sterkte van de controles de validatie van de test met Z > 0,5 mogelijk maakt, heeft de variabiliteit van siRNA-schermen invloed op de Z die meestal lager is (vaak tussen 0,0-0,5)10. Het succes van siRNA-schermen hangt namelijk af van de optimalisatie van i) de efficiëntie van siRNA-toediening in de cellen, ii) de cytotoxiciteit veroorzaakt door de transfectie en iii) de testvoorwaarde voor de efficiëntie van genuitschakeling. Het siRNA kan gemakkelijk worden getransfecteerd in verschillende cellijnen, zoals HeLa, volgens het transfectieprotocol van de fabrikant, maar efficiënte siRNA-transfectie in sommige cellijnen, waaronder macrofagen, blijft een uitdaging. Niettemin zou virale vectorgemedieerde expressie van korte haarspeldboA's (shRNA) een goed alternatief kunnen zijn11. Om aan de moeilijkheid van interpretatie te ontsnappen, worden de gegevens die worden verzameld van siRNA-schermen vaak genormaliseerd ten opzichte van de normale standaardverdeling om de Z-score (ook wel Z-waarde genoemd) voor elk punt10,12te definiëren . Vervolgens werden hit-samples gerangschikt op basis van de Z-score die meestal tot minder dan -2 of meer dan +2 behoort. Ten slotte werden geselecteerde hits in het primaire scherm opnieuw getest in een secundair scherm, inclusief meer replica's om het fenotype te bevestigen dat in het primaire scherm werd waargenomen.
Ons protocol kan eenvoudig worden toegepast voor kleinschalige schermen met apparatuur. Om dit te bereiken, zijn miniaturisatie in de micro-titerplaten en manipulatie van de bibliotheek van moleculen nodig om het proces van conservering, afgifte en mengen te optimaliseren13. Bovendien wordt aanbevolen om een geautomatiseerd robotplatform, inclusief dispensers, te gebruiken om de testomstandigheden in de micro-titerplaten nauwkeurig en reproduceerbaar te regelen. De enorme hoeveelheid gegevens die wordt geproduceerd door high throughput screening (HTS) moet ook worden beheerd door een database en een aangepaste pijplijn voor beeldanalyse van het confocale beeld, gegevensopslag en -overdracht. De in dit rapport gepresenteerde testtesten werden uitgevoerd in de Biosafety Level 3-faciliteit (BSL3). De strikte naleving van de veiligheid in BSL3 verhoogt de moeilijkheidsgraad van de schermen. Veel apparatuur die nodig is voor de schermen moet namelijk beschikbaar zijn in BSL3 en geïsoleerd zijn om de werknemer en het milieu te beschermen tegen verontreiniging. Daarom vergde de installatie van de aangepaste pijpleiding in BSL3 veel ruimte. Om deze reden is ons protocol ontwikkeld om een maximum aan stappen uit te voeren uit de BSL3, zoals siRNA-transfectie en samengestelde overdracht naar de platen. De celinfectie via beeldverwervingsstappen werd uitgevoerd in BSL3-omstandigheden. De images werden vervolgens overgebracht naar een dedicated server en geanalyseerd vanuit de BSL3.
De hier beschreven fenotypische test was gebaseerd op twee methoden voor beeldanalyse (figuur 4). De eerste methode, gebruikt voor siRNA-screening, was ontworpen om het aantal geïnfecteerde cellen te geven. Deze parameter bleek het effect van genuitschakeling op Mtb intracellulaire replicatie efficiënt te vergelijken. Bij het screenen van verbindingen was echter een meer elementaire uitlezing op basis van het totale celoppervlak voldoende om actieve verbindingen duidelijk te identificeren. Omdat deze tweede methode sneller en gemakkelijker te implementeren is, had het de voorkeur voor de analyse van beelden die voortkomen uit screening van verbindingen. Om verder te gaan, kunnen meer fluorescerende kleurstoffen en/of etiketteersondes worden toegevoegd en kunnen beeldanalysescripts worden geoptimaliseerd om multiparametrische gegevens te genereren, zoals colocalisatie, kernen en celmorfologie, celdood, bacteriële aggregatie, evenals intracellulaire handel in de bacteriën. Het is belangrijk op te merken dat het voor intracellulaire handel of colocalisatietesten essentieel is om Z-stacks te krijgen om een cumulatieve beoordeling toe te passen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten aangegeven.
Acknowledgments
Financiële steun voor deze werkzaamheden werd verleend door de Europese Gemeenschap (ERC-STG INTRACELLTB Grant n° 260901, MM4TB Grant n° 260872), de Agence Nationale de Recherche, de Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) en de regio Nord Pas de Calais. We erkennen dankbaar de technische assistentie van Gaspard Deloison, Elizabeth Werkmeister, Antonino Bongiovanni en Frank Lafont van het platform BICeL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µclear-plate black, 384-well | Greiner Bio-One | 781091 | 127.8/86/15 MM with Lid, TC treated |
| CellCarrier 384-well plate | PerkinElmer | 6007550 | Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated |
| V-bottom white, 384-well plate | Greiner Bio-One | 781280 | |
| sealing tape, breathable, sterile | Corning | 3345 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | Transfection reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Cell culture medium |
| D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 2610040-79 | |
| Ficoll Paque PLUS | Dutscher | 17-1440-03 | Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi | 130-050-201 | Purification of CD14+ Monocytes |
| Human M-CSF, premium gr. (1000 μg) | Miltenyi | 130-096-493 | Macrophage Colony Stimulating Factor |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | Columns for CD14+ Monocytes isolation |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Mycobacteria culture |
| Glycerol high purity | Euromedex | 50405-EX | Mycobacteria culture |
| Middlebrook OADC enrichment | Becton-Dickinson | 211886 | Mycobacteria culture |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Mycobacteria culture |
| Versene 1x | Life Technologies | 15040033 | Nonenzymatic cell dissociation solution |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Nuclei dye |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nuclei dye |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Nuclei/cytoplasm dye |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT5014 | Cell fixation solution |
| siRNA targeting Dectin-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* Nontargeted siRNA pool | Dharmacon | D-001206-14 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Isoniazid (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-50G | antibiotic |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | antibiotic |
| Amikacin | Sigma-Aldrich | A1774 | antibiotic |
| Automated Confocal Microscope OPERA | PerkinElmer | Image acquisition | |
| Columbus 2.3.1 Server Database | PerkinElmer | Data transfer, storage, and analysis | |
| Acapella 2.6 software | PerkinElmer | Image-based analysis | |
| GraphPad Prism5 software | GraphPad | Statistical analysis | |
| Excel 2010 | Microsoft | Statistical analysis |
References
- Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
- Barry, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).
- Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery. Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).
- Brodin, P., et al. High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling. PLoS Pathog. 6, (2010).
- Bermudez, L. E., Goodman, J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).
- Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation. Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).
- McDonough, K. A., Kress, Y. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).
- Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells. J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).
- Song, O. R., et al. Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening. J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).
