Summary
심장 질환의 세포 기준으로 현재의 지식은 주로 동물 모델에 대한 연구에 의존한다. 여기에서 우리는 기술과 인간의 심실의 심근의 작은 수술 샘플에서 하나의 실행 가능한 심근을 얻기 위해 새로운 방법을 확인합니다. 인간 심실 근세포은 전기 생리학 연구와 약물 검사를 위해 사용될 수있다.
Abstract
병에 걸린 심장에서 심근 세포는 세포 구조의 변화, 여진 수축 결합 및 막 이온 전류를 포함하는 복잡한 리모델링 과정을 실시한다. 이러한 변화는 증가 부정맥 위험과 심장병 환자의 수축기 및 이완기 기능 장애로 이어지는 수축 변경에 대한 책임을 져야 할 가능성이있다. 그러나, 심장 질환에서 심근 기능의 변화에 대한 대부분의 정보는 동물 모델에서왔다.
여기에 우리가 설명하고 심장 수술 작업을받은 환자에서 심실의 심근의 작은 수술 샘플에서 실행 가능한 심근 세포를 분리 할 수있는 프로토콜을 확인합니다. 프로토콜 상세하게 설명한다. 전기 생리학 및 세포 내 칼슘 측정이 방법으로 얻은 인간의 심실의 심근에서 단일 세포 측정의 숫자의 타당성을 입증하는 것으로보고있다.
이 프로토콜은 그에게보고다시 다른 심장 질환의 존재에서 인간의 마음의 기능 변경의 세포 및 분자 단위의 미래 연구에 유용 할 수 있습니다. 또한,이 방법은 세포 수준에서 새로운 치료 표적을 식별하고 직접 병진 값으로, 인간의 심장 근세포에서 신규 화합물의 효과를 시험하는데 사용될 수있다.
Introduction
심근의 전기 생리학 속성의 해부는 하나의 심장 근육 세포의 분리를위한 기술의 개발 이후에 현저하게 진행되고있다. 심장 흥분 수축 커플 링 (EC-커플 링)의 이해의 최근 발전은 그대로 조직의 모든 생리 학적 특성을 보유 가능한 단일 심근를 분리하는 능력에 의해 가능하게되었다. 패치 클램프 방법은 일상적 sarcolemmal 심장 이온 전류의 함수 및 약리학 적 변조를 연구하기 위해 사용된다. 칼슘 2 +에 민감한 염료와 세포 내 칼슘 역학의 녹음은 정기적으로 EC-커플 링의 생리에뿐만 아니라 내 Ca 2 +의 병리학 적 변화에 중요한 데이터를 제공하고, 건강하고 병에 걸린 다양한 모델에서 하나의 심장 근육 세포에서 수행됩니다 기계적 손상과 심장 질환의 증가 부정맥 부담으로 이어지는 항상성. 인포이 연구에서 기 임상 설정에서 약물의 전기 생리학 및 기계적 효과를 이해하는 데 매우 중요합니다. 그러나, 횡단 전류와 심장 활동 전위와 심장 역학의 특정 기능을 설명 EC-커플 링 단백질의 종 특정 차이가 있습니다. 비 인간의 포유 동물에서 분리 된 심근 세포의 연구는 생물 물리학 적 특성과 특정 횡단 이온 채널과 EC-결합 단백질의 생리 학적 역할을 밝혀 반면 따라서, 그들은 반드시 인간의 심장 근육 세포의 관련 모델을 제공하지 않습니다. 인간의 심근에서 실행 가능한 심근 세포의 분리는 완전히 심장 질환의 병태 생리를 이해하고 새로운 치료 방법을 확인하는 것이 필수적이다.
심방 부속기는 종종 수술 과정에서 폐기 될 때 인간의 심방 조직을 쉽게 사용할 수 있습니다. 성인의 심장 활동 전위와 이온 CU의 초기 양적 연구rrents는 효소 고립 심방 세포 1-4을 채택했다. 활동 전위 또는 격리 된 성인의 심실 세포에서 전류의 기록은 이후 3,5-10을보고되었습니다. 이러한 연구의 대부분은 외식 마음에서 얻은 고립 된 세포를 얻기 위해 콜라하는 관상 동맥 세그먼트 또는 절제된 조직의 상대적으로 많은 양의 노출의 콜라게나 제 관류 중 하나를 활용 한 세포를 사용했습니다. 이러한 연구는 건강한 마음에서 인간의 심실의 심근에서 터미널 심부전 환자에서 횡단 이온 전류의 수의 상세한 특성을 허용했다. L 형의 기록은 칼슘 2 + 전류 (I CA-L) 5-7, 일시적인 외부 칼륨 전류 (I가) 8, 정류기의 칼륨 내향 전류 (I가 κ1) 8, 지연 정류기의 칼륨 전류의 다른 구성 요소는 (나는 κ ) 9가보고되었습니다. 발전 및 정제분리 절차 (10)는, 활동 전위 연장 (11)를 포함하는 단말기 심장 마비의 증가 부정맥 가능성의 이온 기준의 명확한 특성을 허용 depolarizations 12 후 지연 및 이완기 탈분극과 조기 박동을 선도 재미 현재 13 증가.
성인 심장 근육 세포는 일반적으로 다양한 효소 혼합물과 온 마음, 칼슘 2 + 허용 전지 (14)의 높은 수율을 생산하는 기술의 역 행성 관류 작은 동물에서 격리됩니다. 조직의 파편에서 심장 근육 세포의 분리는 아마 때문에 관상 동맥의 관류에 의해 달성과 비교하여 각각의 근육 세포에 효소의 제한된 액세스의 본질적으로 덜 성공합니다. 인해 미사용 도너 하트 매우 제한된 가용성, 정기적으로 통상의 인간 심실 세포를 얻는 유일한 실용적인 방법은 효소 digestio입니다선택적 수술 중에 절제 종종 매우 작은 조직 조각의 명. 철저하게 세포 수준에서 특징으로 한 인간 질병 모델은 이식 마음에 접근성으로 인해 터미널 심장 마비입니다. 그러나 터미널 심장 마비 환자의 소수에서 발생하고 종종 근본적인 원인 (15)의 상대적으로 독립적 인 심근 세포의 심한 개조의 일반적인 경로를 포함한다. 질병의 초기 단계에서 비 실패한 환자에서 단일 심장 근세포의 기능을 평가하는 능력은 다른 상속 또는 취득 조건의 구체적인 기전을 이해하는 것이 중요하다. 비후성 심근증 (HCM)는 말하고 예입니다. HCM은 일반 (1 / 500 개인) 심장 비대 특징으로 상속 심장 조건으로 인해 유출로 협착 및 이완기 기능 장애 16 부정맥 위험과 수축 변경을 증가합니다. HCM의 마음에서 심근 U셀 구조의 변화 (비대, 근원 섬유 혼란)과 EC-커플 링 (17)을 포함하는 복잡한 리모델링 프로세스를 ndergo. 그러나, HCM의 심장 세포 기능 장애의 대부분의 정보는 형질 전환 동물 모델에서왔다. HCM 환자의 소수에 불과 터미널 심부전으로 발전과 심장 이식을 필요로하기 때문에, HCM 마음은 표준 방법과 세포의 분리에 매우 드물게 사용할 수 있습니다. 그러나, HCM 환자의 30 % 이상은 수축기 (HCM) 18시 대규모 중격 비대 바꾸는 유출 요로 혈액의 흐름에 의한 폐색 증상을 개발할 수 있습니다. HCM에 방해의 기복을위한 가장 효과적인 가능한 치료 옵션은 수술 중격 절제술입니다 :이 수술하는 동안, 상단 격막의 변수 크기의 부분은 트랜스 대동맥 접근 방식에 의해 제거된다. 비대 격막의이 부분은 신선한 조직에서 세포 분리를위한 따라서 사용할 수 있습니다.
인간 ventricula의 분리를위한 방법R 하나의 작은 경정맥 심 내막 심근 생검 조직에서 근육 세포는 이전에 개발 된 19를 발표하고있다. 우리는 중격 절제술 및 밸브 교체 절차를받은 환자를받은 HCM 환자를 포함하여 심장 수술을받은 환자에서 심실의 심근 샘플에서 단일 중격 근육 세포를 분리하는 방법을 구현했습니다. 분리 프로토콜, 대표적인 전기 생리학 및 CA 2 + 형광에 대한 자세한 설명뿐만 아니라 측정은 고립 된 인간의 심실의 심근 세포의 생존 및 패치 클램프 및 세포 내 칼슘 2 + 연구의 가능성을 보여되게됩니다.
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Protocol
인체 조직에 대한 실험 프로토콜은 Careggi 대학 병원 (, 2009 년 갱신 2006 / 0024713)의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 각 환자는 서면 동의서를 주었다.
1. 솔루션 및 장비 제조
용액은 표 1에 기재되어있다. 세포 격리 절차의 간략화 흐름도는도 1에서 발견된다.
| 해결 | CP | DB | KB | TB | PS | EB1 | EB2 | |
| 시약 (MM) | KH 2 PO 4 | (50) | ||||||
| 망초 | 8 | 1.2 | 5 | 1.2 | 1.2 | |||
| HEPES | 10 | 10 | 10 | |||||
| 아데노신 | 5 | |||||||
| 포도당 | (140) | 10 | (20) | 10 | 10 | 10 | ||
| 만니톨 | (100) | |||||||
| 타우린 | 10 | (20) | 5 | (20) | (20) | |||
| 염화나트륨 | 113 | 136 | 113 | 113 | ||||
| 의 KCl | 4.7 | 85 | 5.4 | 25 | 4.7 | 4.7 | ||
| MgCl2를 | </ TD> | 1.2 | 5 | |||||
| KH 2 PO 4 | 0.6 | (30) | 0.6 | 0.6 | ||||
| 나 2 HPO 4 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | |||||
| 탄산 수소 나트륨 | 12 | 12 | 12 | |||||
| KHCO 3 | 10 | 10 | 10 | |||||
| NA-피루 베이트 | 4 | 4 | 4 | |||||
| BDM | 10 | 10 | 10 | |||||
| BHBA | 5 </ TD> | |||||||
| 숙신산 | 5 | |||||||
| EGTA | 0.5 | |||||||
| K 2 - ATP | 2 | |||||||
| 피루브산 | 5 | |||||||
| 크레아틴 | 5 | |||||||
| KMES | 115 | |||||||
| 효소 (U / ㎖) | 콜라게나 유형 V | 250 </ TD> | (250) | |||||
| 단백질 분해 효소 타입 XXIV | 4 | |||||||
| pH를 | 7.4 KOH | 7.3의 NaOH | 7.1 KOH | 7.35의 NaOH | 7.2 KOH | 7.3의 NaOH | 7.3의 NaOH | |
.. 표 1 표본 수집, 세포 분리 및 근육 세포의 기능 특성 CP = 심정지 솔루션에 사용되는 솔루션; DB = 해리 버퍼; KB는 = 크래프트 - Bruhe 솔루션; TB = 타이로드 버퍼; PS = 피펫 솔루션; EB1 = 효소 버퍼 1; EB2 = 효소 완충액 2.
- 심정지 (CP) 솔루션을 준비합니다. CP 솔루션은 최대 1 주일 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 칼슘 2 + 무료 해리 버퍼 (DB)를 준비합니다. 이 솔루션은 일 이내에 사용해야합니다.
- 크래프트 - Bruhe (KB) 솔루션을 준비합니다. KB 솔루션은 최대 1 잠깐 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다K.
- 칼슘 2 + 무료 타이로드 버퍼 (TB)를 준비합니다. 이 솔루션은 일 이내에 사용해야합니다.
- 사용 전에 주사기 필터를 사용하여 모든 해법 필터.
- 소화 장치 (그림 2), 전기 모터에 의해 회전 중 하나는 실리콘 엘라스토머의 마주 보는 두 브러쉬, 만든 긁는 용기를 준비합니다. 소화 장치가 정의되어 있습니다. 소화 장치에 대한 세부 사항은 그림 8에있다; 장치의 이미지는 그림 2 C 및 2D에 있습니다. 70 %의 에탄올과 물과 조직 챔버를 씻으십시오.
심근 샘플 2. 수집 및 처리
- 50 ML 튜브에 cardiplegic (CP) 용액 40 ㎖를 붓고는 세포 격리 실험실에 수술 방에서 표본 교통 얼음에 저장합니다.
- 얼음 추위로 씻어, 즉시 절제 후 수술 방에서 심실 심근 표본을 수집CP 솔루션과 튜브에 저장합니다. 심장 수술시 상단 간 심실 중격, 가중치> 100 밀리그램 절제 심 내막 표본을 사용합니다.
- 급속 랩 영역으로 시험편을 전송; 시편 절단에서 10 분 이내에 시료 처리를 시작합니다.
- 아이스 콜드 CP 버퍼의 표본을 유지하면서, 신중하게 실체 현미경 하에서 미세 가위를 사용하여 심 내막 섬유 성 층을 제거; 그 후, 작은 조각 (긴 2-3mm)에 심근 조직을 잘라. 조직 샘플의 크기에 따라, 각각의 분리를 위해 100 밀리그램 1g 사이의 심실의 심근의 총 금액을 잘라.
- 조직 닦지 완료되면 깨끗한 얼음 차가운 CP 솔루션, 소화 장치에 심근 청크를 전송합니다. 더 이상 전체 조직의 1g 이상을 사용하지 않고, 심근 덩어리 두 개의 실리콘 브러쉬의 전체 볼륨 (3-4 ㎖)에 작성하지 마십시오.
3. 세탁 및 심근 덩어리의 소화
- 선미덩어리가 소화 장치의 스크 레이 핑 챔버로 전송 어, 차가운 칼슘 2 + 무료 해리 버퍼 (DB)와 챔버의 CP 버퍼를 변경합니다.
- 욕조에서 가열 된 물 (그림 1)과 접촉 될 수있는 챔버에 대한 위해, 온도 조절 욕조에 소화 장치를 놓습니다. 37.5 ° C로 목욕을 설정하고 천천히 조직 챔버의 온도를 올리기 위하여, 전원을 켜십시오. 1 회전 / 초에 회전 속도를 설정, 소화 장치의 모터의 전원을 켭니다.
- 매 8 분 깨끗한 DB와 챔버 내의 용액을 변경 DB로 3 회 세척을 수행한다. DB는 (37 ° C에서)를 따뜻하게하고 산소가 심근 덩어리와 접촉 얻기 전에 포화 상태입니다.
- DB 솔루션에 콜라게나 유형 V와 4 U / ㎖ 프로테아제 유형 XXIV 250 U / ㎖를 추가하여 효소 버퍼 1 (EB1)를 준비합니다. DB 솔루션에 250 U / ㎖의 콜라게나 제 유형 V를 추가하여 효소 버퍼 2 (EB2)을 준비합니다. (37 ℃)과 oxygenat 워밍업전자 EB1과 EB2.
- (37 ° C에서) 100 % 산소 EB1으로 회전 소화 장치에서 소화의 두 12 분주기를 수행합니다. 각주기에서 EB1의 ~ 3 ㎖를 사용합니다. 피펫 흡인하여 솔루션을 제거하고 각 사이클 후 폐기합니다.
- 세포 수집 및 ~ 버퍼를 용출 감기 (4 ° C) KB 용액 80 ㎖를 위해 6 ~ 15 ML 튜브를 준비합니다.
- 37 ℃에서 3 ㎖ 100 % 산소 EB2로 처음 15 분 소화주기를 수행 소화 사이클 후, 15 ㎖의 튜브에서 제 해리 근세포를 포함하는 용액을 수집하고 12 ml의 차가운 KB 용액으로 세포 현탁액을 희석. 실온에서 튜브를 보관.
- 다음 소화 사이클 동안 콜라게나 V의 농도를 반감하기 위해 DB의 동일한 양으로 잔존 EB2 용액을 희석.
- 37 ° C에서 3 ㎖의 EB2와 다른 5 12 분 소화주기를 수행; 각각 후 15 ML 원뿔 튜브에 버퍼를 포함하는 심근 세포의 수집12 ML의 KB 솔루션을 희석. 실온에서 30 분 동안 6 셀 함유 튜브를 저장한다.
4. 셀의 재 부상과 칼슘 2 + Readaptation
- 20 ㎖ 칼슘 2 + 무료 타이로드 버퍼 (TB)에 1 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민 (BSA)를 추가합니다. 솔루션을 필터링합니다.
- 해결하는 심근 세포를 강제로 5 분 100 XG에 여섯 심근 포함하는 원뿔 튜브를 원심 분리기. 뜨는을 제거하고 실온에서 TB를 포함하는 BSA의 (수율에 따라 1-3 ML) 변수 양의 각각의 튜브에 세포를 재현 탁.
- 점차적으로 100 밀리몰 / L의 염화칼슘 용액을 작은 분량 씩 추가하여 셀이 포함 버퍼에 칼슘 2 + 농도를 증가시킨다. 제 1 및 제 2 단계에서 칼슘 2 + 농도는 각각 50 μmol / L, 100 μmol / L까지 발생합니다. 다음 칼슘 2 + 추가 단계는 5 분마다 수행하고 농도는 각 단계 t에서 100 μmol / L에 의해 발생합니다0.9 밀리몰 / L의 OA 최종 농도
- 분리 과정의 수율을 평가. 현미경의 유리 바닥 챔버에 심근 함유 용액 0.5 ㎖를 전송합니다. 10 배 목표 배율에서 15 현미경 필드를 평가하고 (클리어 줄무늬와 유의 흠 예를 들어, 막대 모양의 세포, 그림 2) 건강한 심근 세포의 비율을 계산합니다. 예상 수익률은 약 20 %이다.
고립 된 심근 5. 기능 평가.
다음 프로토콜은 활동 전위와 세포 내 칼슘 이온 플럭스의 동시 등을 포함하여 인간의 심근 세포 기능 평가의 예입니다.
- 천공 패치 구성의 패치 클램프 실험을 위해 피펫 솔루션 (PS)을 준비합니다. 이 솔루션은 최대 3 개월 동안 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 칼슘 2 + 무료 타이로드 버퍼 (TB)에 1.8 밀리몰 / L의 염화칼슘을 추가합니다. 유SE 패치 클램프 / 형광 실험 도중 심근 superfusion이 솔루션입니다.
- 1.5 ML 튜브로 전송 세포 현탁액 1 ㎖를 10 μmol / L Fluoforte 10 μL의 Powerload 집중을 추가합니다. RT에서 30 분 동안 품어. 그 후, 수직으로 튜브를 설정하고 5 분 동안 정착 셀을 떠나; 캘리포니아에있는 세포를 재현 탁 2 + TB를 포함.
- (: 37 ± 0.5 ° C의 온도)의 작은 (0.5 ㎖)에 세포 현탁액 0.25 ㎖의 전송, 온도 조절 현미경은 0.3 ㎖ / 분의 유속으로 가열 microperfusor 시스템 중력 superfused 기록 챔버를 탑재.
- 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 3 ~ 5 ㎛의 팁 직경 PS 가득 3 M 4.5에의 저항으로 패치 클램프 피펫을 준비합니다.
- PS (250 ㎍ / ㎖)의 배치에 암포 테리 신 B를 추가하고 전극을 채우기 위해 사용합니다.
- 흠없는 명확한 줄무늬가있는 막대 모양의 세포, FO를 선택접속 저항이 20 MΩ을 떨어질 때까지 RM, 5 ~ 10 분 기가 씰을 기다립니다.
- 자극의 상이한 주파수 (Hz에서 0.2, 0.5 Hz에서 1 Hz의 각 주파수에서 1 분)에서 짧은 펄스 (<3 밀리 초)를 사용하여 전류 클램프 모드에서 활동 전위를 유도. 녹음 단계에서 492 ± 3 nm의 시야 조명을 켜고 505-520 nm에서 Fluoforte 형광을 감지합니다. 형광을 획득하고 Digidata 1440A와 pClamp 10.0 소프트웨어를 사용하여 잠재적 인 신호를 멤브레인. 필요한 경우 기록 순서를 여러 번 반복; 그러나, 각 셀에 대한 15 분 아래의 총 녹화 시간을 유지.
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Representative Results
비 실패한 비 비후성 수술 환자 (21)와 비교하여 상술 한 방법은, 조작 절제술을 시행 비대성 심근증 (HCM)를 가진 환자의 심실 중격으로부터 격리 심근의 기능적 이상을 특성화하기 위해 사용 하였다. 이 섹션에 포함 된 결과를 해당 워크 (21)로부터 유도되며이 기술은 심장 질환 조건에서 심근 세포 기능의 변화를 특성화하는 데 사용될 수있는 방법의 예로서 여기에 도시되어있다.
HCM을 가진 환자의 담당자 수술 샘플은 그림 2A에 표시됩니다. 수술 용 샘플은 크기 및 내막 섬유상 줄무늬의 두께의 점에서 매우 변수되었습니다. 우리는 HCM 샘플에서 각각의 분리 절차를 사용 심근 조직의 양을 1g 주위에 있었다. 대신, 제어 샘플에 사용 조직의 양 (100 ~ 500 밀리그램). 작았 로우로 인해연구 조직의 가용성을 제공합니다. 조직 내에서 실행 가능한 심근 세포의 상대적인 양이 HCM 심근의 감소와 심 내막 심근 섬유증이 22 증가 아마 때문에 수율은, 제어 샘플 HCM에 대한 처리 때 유의하게 높았다. 이들 관찰로부터 우리는 생존 세포를 얻기 위해 조직의 필요량은 심근 질환의 유무에 따라 가변 될 수 있다는 결론을 내렸다.
도 2b에 도시 된 바와 같이 시료를 작은 조각으로 절단 하였다. 그 후, 청크는 소화 장치 (도 2c)의 챔버로 이송하고 (도 2d) 전술 한 바와 같은 단일 셀 분리에 사용 하였다. 심실 중격 샘플에서 설명한 세포 분리 과정을 사용하여 얻은 세포 현탁액의 주제 현미경 사진은도 3a 및도 3b에 도시되어있다; 단일 심실 캘리포니아의 확대 이미지rdiomyocytes는 그림 3C-3F에 묘사되어있다. HCM 샘플로부터 심근 세포가 활동 전위와 프로토콜 절에 설명 된대로 내 Ca 2 + 변화의 동시 기록을 위해 사용 하였다. 3 개의 다른 주파수에서 자극하는 동안 막 전압 (위) 및 세포 내 칼슘 2 + (아래)를 보여주는 대표적인 동시 추적은 그림 4에 나타내었다 이러한 흔적은 HCM 샘플에서 고립 된 단일 심근 세포에서 기록되었다.
패치 클램프 연구의 결과는 자극의 다양한 주파수에 기록 된 활동 전위 기간 (APD)가 현저하게 컨트롤 (그림 5a 및도 5b)에 비해 HCM (HCM의 심근)을 가진 환자에서 심근으로 연장 된 것으로 나타났다. β-adrener : 7 M (그림 5C) - 고립 된 심근 세포의 생리적 반응의 유지를 확인하기 위해, 우리는 10에서 사용, 이소 프로의 효과를 테스트GIC 자극 제어 심근 세포의 예상 AP 단축을 생산. 장기간 APD 초기 depolarisations (EADS) 23 이후의 위험 증가로 연결하기 때문에, EADS의 발생, AP의 고원 단계에서 자발적인 depolarisations 감지를 측정 하였다. HCM의 심근에서 이즈 컨트롤 (그림 5D)에 비해 훨씬 더 많았다. 여러 EADS을 보여주는 대표적인 추적은 그림 5E에 표시됩니다
이상 APD와 이온 전류 이상이 HCM의 심근에 여기 수축 커플 링 메커니즘에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 테스트하려면 내 Ca 2 + 변화의 속성을 자극하는 동안 평가했다. 2 + 과도 전류 클램프 조건에서 유발 CA의 진폭은 심근 (그림 6A)를 제어에 비해 HCM에서 유사했다. 반대로, 칼슘 2 + 과도의 반응 속도는 (그림 HCM에서 유의하게 길었다(b)). 또한, 세포 내 이완기 칼슘 2 + 농도는 심근 (그림 6C)를 제어에 비해 HCM에서 현저하게 높았다 자극 주파수의 증가에 따라 더 눈에 띄게 증가했다.
특히, 인간의 심실 샘플에서이 방법으로 격리 심근가 성공적으로 세포 내 칼슘은 + 및 / 또는 세포 전기장 자극하는 동안 기록을 단축 (그림, 특정 횡단 전류 (그림 7A)의 전압 클램프 등을 포함하여 다른 응용 프로그램을 위해 2 사용되어왔다 (b)) 및 공 초점 현미경 및 막 결합 형광 라벨 (그림 7C)를 사용하여 sarcolemma의 미세 구조의 평가.
세포 격리 절차 1. 흐름도를 그림.
중격 절제술의 수술을 시행 HCM을 가진 환자에서 심실의 심근의 샘플을 보여주는 세포 분리를위한 심실 샘플 그림 2. 처리. (A) 대표 이미지. 심실 수술 표본에서 심실 조직 컷의 교정 바 = 5mm. (B) 덩어리, 세포 분리에 사용되는. 교정 바 = 소화 장치의 5mm. (C) 이미지. 장치는 두 개의 실리콘 브러쉬 소화 챔버를 포함한다 : 뛰어난 브러시 모터에 의해 이동 될 때 회전 할 수있는 심실 조직의 효소 소화 동안 항온 배스 소화 장치를 나타내는 (D) 이미지.. P>
그림 3. 고립 된 인간의 심실의 심근. (AB) 패널은 대표적인 심근 현탁액을 보여주는 두 개의 현미경 필드 (10X 목적)의 현미경 사진을 보여줍니다. 참고로, 세포의 약 30 %는 막대 모양이고 명확한 줄무늬를 표시합니다. 교정 바 = 100 μm의. (CE) HCM 환자 (40 배 목표)의 검체에서 분리 된 3 사람의 심근의 대표 이미지. 교정 바 = 레코딩을위한 패치 피펫의 팁 감동 인간의 심실의 심근을 보여주는 20 ㎛. (F) 이미지. 교정 바 = 20 ㎛.
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막 전위 (위) 및 세포 내 칼슘을 보여주는 그림 4. 막 잠재력과 세포 내 칼슘의 동시 녹음. 대표 추적 (아래) HCM 샘플에서 고립 된 단일 심근 세포에서 기록했다. 심근 세포는 패치 0.2 Hz에서 피펫, 0.5 Hz에서 1 Hz에서를 통해 자극한다.
그림 5. HCM 샘플에서 심실의 심근의 활동 전위의 수선. (A) 대표, 오른쪽 검은 흔적 (0.2 Hz에서 0.5 Hz에서 제어 (왼쪽, 회색 흔적) 심근 및 HCM의 심근에서 1 Hz에서 유도 활동 전위를 겹쳐 ). (B) 평균 활동 전위 HCM의 90 % 재분극 (APD90 %)의 기간 (N = 81)과HCM 환자 및 제어 샘플에서 심근에 EADS의 제어 심근 (N = 29) 시험 세 서성 주파수. (C) 발생. (D)는 부재 (연속 추적)에서 제어 심근 세포에서은 0.5Hz에서 활동 전위를 거듭하고 10 -7 M의 이소의 존재. (E) 화살표로 표시 (초기 depolarizations, EADS 후) 고원 단계에서 발생하는 여러 가지 자연 depolarizations을 표시 HCM 환자에서 심근 세포의 막 잠재력을 보여주는 대표적인 추적. 자극은 추적 아래에 짧은 선으로 표시됩니다. * = p <0.01 짝이 t-검정. 그림의 모든 패널은 Coppini 등의 허가를 수정합니다.는 2012 년 21.
그림6. HCM 샘플에서 심실의 심근에서 칼슘 과도 수선. (A) 대표는 칼슘 과도 제어 심근에 패치 피펫 (회색)과 HCM 셀 (검정)를 통해 0.2 Hz로 자극시 유발 중첩. 특히, 칼슘 2 + 과도의 진폭은 두 세포 사이에 차이가 없습니다 (B) HCM에서 칼슘 2 + 과도 반응 속도 (N = 42) 및 제어 (N = 24) 심근 :. 시간 자극에서 과도 (TP를 피크 ), 50 % 붕괴 (T50 %)의 과도의 90 % 붕괴 (T90의 %)에 피크 시간에 피크 시간이 표시됩니다. (C) 세포 내 칼슘 보여주는 대표적인 긴 트레이스 HCM에있는 3 개의 다른 주파수에서 자극 동안 2 +과 HCM의 심근 세포에서 높은 페이싱 속도로 증가 이완기 칼슘 2 +를 강조 제어 근육 세포,. (D) 3 가지 서성 거려 라에서 평균 이완기 칼슘 HCM에있는 + (N = 42) 및 제어 (N = 24) 심근TES. * = p <0.01 짝 t 검정. 그림의 모든 패널은 Coppini 등의 허가를 수정합니다.는 2012 년 21.
.. 인간의 심실 근육 세포를 사용하여 그림 7과 추가 실험 응용 프로그램 (A)는 왼쪽 : 대표는 L-형 칼슘을 보여주는 흔적을 겹쳐 2 + 전류 (자세한 내용은 21 참조) 특정 프로토콜과 다른 막 전압에서 전압 클램프 아래에 기록했다. 오른쪽 : 다른 막에 HCM 샘플에서 격리 된 18 세포에서 평균 L-형 칼슘 2 + 피크 전류 밀도. 전압. (B) 세포 내 칼슘 2 + 추적 1 Hz에서 전기장 자극하는 동안 심실 심근 세포에서 기록했다. 심실 cardiom의 (C) 공 초점 이미지형광 막 결합 염료 (DI-3-ANEPPDHQ)로 염색 HCM 샘플에서 yocyte. 참고로, ttubules의 밀도는 HCM의 형태 막 리모델링을 제안, 낮습니다.
그림 8. 소화 장치. 소화 장치 (AB) 구성 요소. 가변속 회전 모터는 제 하나에 접속되어 제 플라스틱 아암에 연결된다. 제 플라스틱 아암 제외하고 상부 브러시에 접속된다. 브러쉬는 실리콘 엘라스토머로 만들어집니다. ~ 1.5 mm 이격 100 구멍 PTFE 부정적 금형, 액상 실리콘으로부터 브러시를 캐스팅하기 위해 사용되었다. 몰드의 내부 공간은 1.9 cm 직경을 가지고 있으며, 동일한 크기의 브러시의 제조 두께 6mm이다. 몰드의 한쪽 편에 위치한 홀은 8mm 긴 강모를 생성하기 위해 제 때 브러쉬몰드 캐스팅 및 제거됩니다. 액상 실리콘 몰드에 투입 한 후, 적어도 48 시간은 완전한 경화를 위해 필요하다. 브러쉬 유리관 내부에 장착된다 (내경 = 2cm, 두께 2mm)와이 브러쉬 및 유리 벽에 의해 형성된 원통형의 챔버는 기밀이 고무 O-링에 의해 밀봉된다. 브러시는 다른 하나를 푸시 할 필요가있다; 아래 하나는 상단 하나가 모터 암의 플라스틱 끝에 붙어있는 동안, 플라스틱베이스에 붙어 따라서 회전 할 수 있습니다. (C) 상단 브러시의 전망을 확대했습니다. 참고로, 브러시는 (D) 챔버의 구성 요소는 자신의 최종 위치에 나타낸다을 회전시키기 위해서는 모터 아암의 단부에 접착 할 필요가있다. 두 브러쉬 (실제 실) 사이의 공간은 ~ 2cm 폭이 넓고 높은 7~8밀리미터; 이 공간은 쉽게 심근 조직의 1g까지 이외의 버퍼의 3 ~ 4 ㎖에, 맞습니다.
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Discussion
우리는 기술과 인간의 심실의 심근의 수술 샘플에서 실행 가능한 심근 세포를 분리하는 방법을 확인했다. 성공적으로 병에 걸린 심실의 심근에서 하나의 실행 가능한 심근 세포의 분리가 개발 및 미세 조정 된 수 있도록 심방 외과 샘플, 기술에서 고립 된 세포에 사용되었던 이전에 설명한 프로토콜에서 시작. 초기 보고서는 선택적으로, 생리 학적 자극 8,24에 변경된 전기 생리학 특성 및 응답의 결과로, 칼륨 전류를 repolarizing 장애인 심방과 심실 조직의 덩어리에서 단일 심근 분리 관상 동맥 관류를 통해 버퍼를 포함하는 효소의 배달이 지연 정류기을 손상하지 않은 반면 것으로 나타났다 분리 셀 (25)의 전류. 불행하게도, 심실 심근의 수술 표본에서 인간의 심실의 심근 세포의 분리는 관상 동맥 분지의 무결성 이후 관상 동맥 재관류에 의해 수행 할 수 없습니다외식 마음과 모순, 손실됩니다. 우리의 방법을 사용하여 심근 덩어리에서 분리 된 심근 페이싱 주파수의 변화에 따라 활동 전위 기간의 명확한 적응을 표시하거나 아드레날린 자극을 β 할 수 있습니다. 생기는 그러한 응답을 위해, 지연된 정류 칼륨 채널의 무결성 트립 분리 방법에 의해 손상되지 않는 이러한 채널의 전체 무결성을 제안, 26-28 요구된다. 또한, 우리의 방법과 고립 된 세포는 일반 전기 생리학 응답 (그림 3, 4)를 보여, 또한 칼슘 예상되는 형태 및 기간의 과도 (그림 3 및 5)와 일반 sarcomeric 조직 (그림 2)와 단축 속성 (하지를 표시 할뿐만 아니라, ) 표시, 그 세포의 전반적인 구조적 무결성이 분리 절차에 의해 유지됩니다 것을 제안. 이전에이 방법의 주요 발전기술들은 과도한 손상없이 단일 세포 분리를 허용하는, 조직 덩어리의 부드러운 기계적 교반을 얻어 새롭게 설계된 분해 장치가 제공된다. 또한, 소화 장치의 사용은 우리가 세포 격리 버퍼에 효소의 낮은 농도를 사용하는 것이 허용; 특히 우리는 이전에보고 된 방법 (24)에 비해, 비 선택적 프로테아제의 훨씬 더 낮은 농도를 사용한다. 이 장치는 사용자 지정 연구실 제 : 건물의 설계도는 그림 8에 나타낸다.
심플한 디자인과 구조는이 프로토콜의 성공적인 결과를위한 복제하기가 매우 쉽습니다. 그림 8과 전설은 실리콘 브러쉬를 생산하고 긁는 챔버를 만들기 위해 필요한 절차에 대해 설명합니다. 소화 장치의 장점에 의해, 생존 세포의 상대적으로 높은 번호 (100 MG 최저) 심실 조직의 비교적 낮은 양으로부터 구할 수있다.이전에 발행 된 방법 (19)는 작은 생검 (도 <20 mg)을에서 칼슘 허용 근육 세포를 제공하는 것으로 나타났다. 그러나보고 된 심장 세포 수율은 매우 낮고 저자는 그 방법으로 고립 된 세포가 세포 내 칼슘 순환과 수축 기능의 특성에 가능했다 여부를 표시하지 않았다. 심실 중격의 작은 부분이 자주 밸브 교체 절차 (예를 들면. 대동맥 밸브 교체) 동안 절제하기 때문에이 기술은 많은 수술 환자에게 잠재적으로 적용 할 수있다. 그러나, 성공적인 분리를 얻기 위해 중요한 요점은 수술실에서의 시료 채취 후 절차의 급속한 개시이다. 따라서, 생육이 기술에 대한 위해, 심장 수술 클리닉에 근접 할 세포 실험실이 필요합니다. 또한 적절한 효소 활성은 성공적인 분리에도 매우 중요하다. 이후 비 선택적 단백질 분해 효소 활성 오F 각 콜라게나 배치는 일반적으로 완전히 테스트되지 않고, 각 많은 세포 격리하는 동안 다르게 수행 할 가능성이있다. 따라서, 최적의 결과를 달성하기 위해 세부 조정 콜라게나 제의 최종 농도에 필수적이다. 우리는 가능한 세포주기 3에 나타나는 시작 있는지 확인하기 위해, 각 사이클에서 현미경으로 세포 현탁액을 관찰하는 것이 좋습니다 세포의 초기 모습이 과도한 효소 활성을 제안 효소 농도의 감소를 향해 메시지를 표시합니다.; 사이클 3 후 세포의 모양은 부족 효소 활성을 제안합니다. 우리의 경험에서, 이것은 정확한 효소 농도의 가장 효과적인 지표이다.
우리는 성공적으로 좌심실 유출로 협착 수술 중격 절제술을받은뿐만 아니라 비 실패 비 비대 수술 환자 21와 HCM 환자의 간 심실 중격에서 단일 심근 세포를 얻기 위해이 방법을 사용했습니다. 이 논문의 결과동시에 형광 염료와 세포 내 칼슘 역학을 기록하여, EC-커플 링의 이상을 평가하는 동안이 방법으로 고립 된 근육 세포 패치 클램프 기술과 완전한 전기 생리학 평가를 위해 이용 될 수 있음을 보여준다. 여기에 설명 된 기록 절차주세요 따라서 세포 샘플의 제한된 개수로 대량의 데이터를 생산하고, 각각의 셀에서 하나의 기록 셀과 몇개의 생리적 파라미터를 수집 할 수 있었다. 비 비대의 환자 (21)에 비해 다음과 같은 이점 덕분에,이 방법은 성공적 HCM 환자의 심실의 심근 특정 기능적 이상을 특성화하기 위해 사용되어왔다. 이온 전류 및 활동 전위 지속 기간뿐만 아니라 키네틱 기형 이상은 OD 내 Ca 2 + 순환 명확 높은 재현성으로,이 기술을 사용하여 확인 하였다. 또한, 우리는 늦게 나 +의 선택적 억제제가 치료를 보여 주었다 대 ranolazine와 이중 맹검 임상 시험의 개발을 주도. 현재 진행되고 HCM 29 일 환자에서 위약.
인간의 심장 표본 가용성도 전문 센터에서, 상대적으로 소극적이고, 이것은이 기술의 다양한 적용 가능성을 제한 할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 직접 심근 기능 질환 관련된 변화에 대한 환자의 샘플들로부터 획득 될 수있는 정보의 품질 HCM 및 기타 심장 질환의 동물 모델에서 그 달성에 대등하다. 사이의 광대 한 차이를 감안할 때인간과 쥐의 심장 근육 세포의 생리학은 인간의 근육 세포의 기능 평가에서 데이터는 매우 중요 할 수 있습니다. 결론적으로, 우리는 우리의 프로토콜은 즉시 번역 값으로, 환자 샘플에서 직접 세포 기능 평가의 완전한 세트를 수행 할 수있는 가능성을 제공하기 때문에이 기술의 미래 응용 프로그램은 크게, 심장 질환에 대한 지식에 기여할 수 있다고 생각합니다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 EU (STREP 프로젝트 241577 "큰 마음,"제 7 회 유럽 프레임 워크 프로그램, CP), MENARINI 국제 운영 룩셈부르크 (AM), 텔레 톤 GGP07133 (CP)과 길르앗 과학 (AM)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4*7H2O) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Sigma-Aldrich | 237205 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Sodium hydroxide(NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate | Sigma-Aldrich | 49601 | |
| Pyruvic acid | Sigma-Aldrich | 107360 | |
| 3-Hydroxybutyric acid | Sigma-Aldrich | 166898 | |
| Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| Succinic Acid | Sigma-Aldrich | S3674 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E0396 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A0281 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V | Sigma-Aldrich | C9263 | |
| Proteinase, Bacterial, Type XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | |
| Calcium chloride solution, ~1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | |
| Calcium chloride 0.1 M solution | Sigma-Aldrich | 53704 | |
| Potassium methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 83000 | |
| FluoForte Reagent | Enzo Life Sciences | ENZ-52015 | |
| Powerload concentrate, 100X | Life Technologies | P10020 | |
| Perfusion Fast-Step System | Warner Instruments | VC-77SP | |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528 | |
| Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | ||
| Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
| pClamp10.0 | Molecular Devices | ||
| Digestion Device | CUSTOM | CUSTOM | The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Figure 1C-1D and in Figure7. We can provide further details if requested. |
| Silicone elastomer for the digestion device's brushes | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Variable speed rotating motor for the digestion device | Crouzet | Crouzet 178-4765 | |
| Mold for brushes casting | N.A. | N.A. | The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods. |
References
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