Summary
Aktuelle Erkenntnisse über die zellulären Grundlagen von Herzerkrankungen meist stützt sich auf Studien an Tiermodellen. Hier beschreiben wir und Validierung einer neuen Methode, um einzelne lebende Herzmuskelzellen von kleinen chirurgischen Proben menschlichen Myokard zu erhalten. Menschen Kardiomyozyten können für elektrophysiologische Studien-und Drogentests verwendet werden.
Abstract
Kardiomyozyten von erkrankten Herzen sind komplexe Umbauprozesse, die Änderungen in der Zellstruktur, Erregung Kontraktion Kupplung und Membranionenströme unterzogen. Diese Veränderungen sind wahrscheinlich für das erhöhte Risiko und die arrhythmogene Kontraktions Veränderungen, die zu den systolischen und diastolischen Dysfunktion bei Herzpatienten verantwortlich zu sein. Allerdings hat die meisten Informationen über die Veränderungen der Myozyten-Funktion im Herzerkrankungen aus Tiermodellen zu kommen.
Hier beschreiben wir ein Protokoll und zu validieren, um lebensfähige Muskelzellen von kleinen chirurgischen Proben von ventrikulären Myokard von Patienten, die Herzchirurgie Operationen zu isolieren. Das Protokoll wird im Detail beschrieben. Elektrophysiologischen und intrazellulären Calciummessungen berichtet, um die Durchführbarkeit einer Anzahl von Einzelzellmessungen in menschlichen Kardiomyozyten mit diesem Verfahren erhalten zu demonstrieren.
Das Protokoll berichtet erWieder kann für zukünftige Untersuchungen der zellulären und molekularen Basis der funktionellen Veränderungen des menschlichen Herzens in Gegenwart verschiedener Herzkrankheiten sein. Außerdem kann diese Methode verwendet, um neue therapeutische Targets auf zellulärer Ebene zu identifizieren und die Wirksamkeit der neuen Verbindungen auf die menschliche Herzmuskelzellen zu testen, mit direktem Translationswert werden.
Introduction
Dissection der elektrophysiologischen Eigenschaften des Herzmuskels hat sich deutlich nach der Entwicklung von Techniken für die einzelnen Herzmuskelzellen Isolation vorangekommen. Die jüngsten Fortschritte im Verständnis der Herzkontraktion Anregung Kopplung (EC-Coupling) haben auch durch die Fähigkeit der Isolierung lebensfähigen Einzel Kardiomyozyten, die alle physiologischen Eigenschaften des intakten Gewebes behalten gemacht worden. Patch-Clamp-Verfahren werden routinemäßig verwendet, um die Funktion und pharmakologische Modulation von Herz sarkolemmalen Ionenströme zu untersuchen. Aufnahmen der intrazellulären Calcium-Dynamik mit Ca 2 +-sensitiven Farbstoffen werden auch regelmäßig auf einzelne Herzmuskelzellen aus einer Vielzahl von gesunden und kranken Modelle durchgeführt wird, liefert wichtige Daten über die Physiologie des EG-Kupplung als auch auf die pathologischen Veränderungen der intrazellulären Ca 2 + Homöostase, die zu mechanischen Beeinträchtigungen und erhöhte Belastung in arrhythmogene Herzkrankheiten. Information aus diesen Studien ist entscheidend für das Verständnis der elektrophysiologischen und mechanischen Auswirkungen von Drogen in der Klinik. Es gibt jedoch bestimmte Arten Unterschiede in den Transmembranströmen und in den EG-Kupplung Proteine, die für bestimmte Funktionen des Herzaktionspotentials und der Herzmechanik zu berücksichtigen. Während also Studien von Myozyten aus nicht-menschlichen Säugetieren isoliert haben die biophysikalischen Eigenschaften und physiologischen Rollen von spezifischen Transmembranionenkanäle und EC-Kopplung Proteine aufgeklärt, sie sind nicht zwangsläufig relevanten Modelle der menschlichen Herzmuskelzellen. Isolation von lebensfähigen Muskelzellen aus menschlichen Herzmuskel ist daher unerlässlich, um die Pathophysiologie von Herzerkrankungen verstehen und Validierung neuer therapeutischer Ansätze.
Menschenvorhofgewebe ist leicht verfügbar, wie Vorhof Anhänge werden oft während der chirurgischen Verfahren verworfen. Erste quantitative Untersuchungen der erwachsenen menschlichen Herzaktionspotentiale und Ionen currents beschäftigt enzymatisch isolierten Vorhofzellen 1-4. Aufnahmen von Aktionspotentialen oder Ströme aus isolierten erwachsenen Menschen ventrikuläre Zellen wurden anschließend berichtet 3,5-10. Die meisten dieser Studien wurden Zellen aus explantierten Herzen gewonnen und verwendet entweder Collagenase-Perfusion einer Koronararterie Segment oder Belichtung von relativ großen Mengen an Kollagenase Exzidate isolierte Zellen zu erhalten. Diese Studien ermöglichte eine detaillierte Charakterisierung einer Anzahl von Transmembran-Ionenströme aus humanen Kardiomyozyten aus gesunden Herzen und von Patienten mit terminaler Herzinsuffizienz. Aufnahmen von L-Typ-Ca 2 +-Strom (I CA-L) 5-7, transiente Kalium-Auswärtsstrom (I to) 8, Einwärtsgleichrichter Kaliumstrom (I κ1) 8, die verschiedenen Komponenten des verzögerten Gleichrichter-Kaliumstrom (I κ ) 9 berichtet. Vorschüsse und Raffination vondie Isolationsverfahren 10, erlaubt eine eindeutige Charakterisierung der ionischen Basis der erhöhten arrhythmogene Potential in terminaler Herzinsuffizienz, bestehend aus Aktionspotential-Verlängerung 11 nach Depolarisationen 12 verzögert und erhöhte lustig Strom 13 führt zu diastolischen Depolarisation und Extrasystolen.
Erwachsene Herzmuskelzellen werden in der Regel von kleinen Tieren durch retrograde Perfusion des ganzen Herzens mit verschiedenen Enzymmischungen, eine Technik, die hohe Ausbeuten von Ca 2 +-Zellen tolerant 14 erzeugt isoliert. Isolierung von Herzmuskelzellen, die aus Fragmenten von Gewebe von Natur aus weniger erfolgreich wahrscheinlich wegen des begrenzten Zugangs zu einzelnen Enzyme Myozyten verglichen mit der durch Perfusion der Koronararterien erreicht. Wegen der sehr begrenzten Verfügbarkeit von Spenderherzen ungenutzt ist der einzige praktische Weg, um normale menschliche ventrikuläre Zellen auf einer regelmäßigen Basis zu erhalten, die durch enzymatische digestion der oft sehr kleinen Gewebefragmenten bei elektiven chirurgischen Verfahren ausgeschnitten. Die einzige menschliche Krankheitsmodell, die gründlich auf Zellebene charakterisiert worden ist terminaler Herzinsuffizienz aufgrund der Zugänglichkeit zu transplantierten Herzen. Allerdings tritt terminaler Herzinsuffizienz in einer Minderheit der Patienten und oft mit einem gemeinsamen Weg von schweren Umbau des Herzmuskelzellen, die relativ unabhängig von der zugrunde liegenden Ursache 15 ist. Die Fähigkeit, die Funktion der einzelnen Herzmuskelzellen von Patienten zu einem früheren nicht andernfalls Stadium der Erkrankung zu beurteilen ist entscheidend, um die spezifische Pathophysiologie verschiedener ererbte oder erworbene Zustände zu verstehen. Die hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) ist ein beredtes Beispiel. HCM ist eine gemeinsame (1/500 Personen) vererbbare Herzerkrankung, die durch Herzhypertrophie, erhöhter arrhythmogene Risiko-und Kontraktions Änderungen aufgrund Ausflusstraktobstruktion und diastolischen Dysfunktion 16. Kardiomyozyten aus HCM Herzen undergo eine komplexe Umbauprozesse, die Änderungen in der Zellstruktur (Hypertrophie, myofibrillären Unordnung) und EC-Kupplung 17. Allerdings hat die meisten Informationen von Myozyten Dysfunktion bei HCM aus transgenen Tiermodellen zu kommen. Da nur eine Minderheit von HCM-Patienten entwickelt sich in Richtung Terminal Herzinsuffizienz und Herztransplantation benötigt, sind HCM Herzen sehr selten zur Zellisolierung mit Standard-Methoden zur Verfügung. Jedoch mindestens 30% der HCM-Patienten entwickeln obstruktive Symptome aufgrund massiver Blut Septumhypertrophie verändernde Ausflusstrakt Fluss während der Systole (HCM) 18. Die wirksamste verfügbare therapeutische Option für die Entlastung der Obstruktion in HCM ist die chirurgische Septum Myektomie: während dieser chirurgische Eingriff ist eine variable Größe oberen Teil der Scheidewand von trans Aorten-Ansatz entfernt. Dieser Teil des hypertrophierten Septum ist deshalb zur Zellisolierung aus dem frischen Gewebe zur Verfügung.
Verfahren zur Isolierung von menschlichen ventricular Muskelzellen von einzelnen, kleinen transvenous Endomyokardbiopsie Proben zuvor entwickelt und veröffentlicht 19. Wir implementierten eine Methode, um einzelne septalen Myozyten von Myokard-Proben von Patienten, die Herzchirurgie, einschließlich Patienten mit HCM unterziehen Septum Myektomie und Patienten, die sich Ventil Ersatzverfahren zu isolieren. Zusätzlich zu einer detaillierten Beschreibung der Trennprotokolls, repräsentativen elektrophysiologischen und Ca 2 +-Fluoreszenzmessungen vorgestellt werden, was die Lebensfähigkeit der isolierten humanen Kardiomyozyten und die Durchführbarkeit der Patch-Clamp-und intrazellulären Ca 2 +-Studien.
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Protocol
Die Versuchsprotokolle auf menschlichem Gewebe wurden von der Ethikkommission der Universität Careggi-Krankenhaus (; erneuert Mai 2009 2006/0024713) zugelassen. Jeder Patient hat eine schriftliche Einverständniserklärung.
1. Solutions und Vorbereitung der Ausrüstung
Lösungen werden in Tabelle 1 beschrieben. Ein vereinfachtes Flussdiagramm des Zellisolationsverfahren ist in Fig. 1 angegeben.
| Lösung | CP | DB | KB | TB | PS | EB1 | EB2 | |
| Reagens (mM) | KH 2 PO 4 | 50 | ||||||
| MgSO 4 | 8 | 1.2 | 5 | 1.2 | 1.2 | |||
| HEPES | 10 | 10 | 10 | |||||
| Adenosin | 5 | |||||||
| Glucose | 140 | 10 | 20 | 10 | 10 | 10 | ||
| Mannit | 100 | |||||||
| Taurin | 10 | 20 | 5 | 20 | 20 | |||
| NaCl | 113 | 136 | 113 | 113 | ||||
| KCl | 4.7 | 85 | 5.4 | 25 | 4.7 | 4.7 | ||
| MgCl 2 | </ Td> | 1.2 | 5 | |||||
| KH 2 PO 4 | 0,6 | 30 | 0,6 | 0,6 | ||||
| Na 2 HPO 4 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | |||||
| NaHCO 3 | 12 | 12 | 12 | |||||
| KHCO 3 | 10 | 10 | 10 | |||||
| Na-Pyruvat | 4 | 4 | 4 | |||||
| BDM | 10 | 10 | 10 | |||||
| BHBA | 5 </ Td> | |||||||
| Bernsteinsäure | 5 | |||||||
| EGTA | 0,5 | |||||||
| 2 K-ATP | 2 | |||||||
| Brenztraubensäure | 5 | |||||||
| Kreatin | 5 | |||||||
| KMES | 115 | |||||||
| Enzyme (U / ml) | Collagenase Typ V | 250 </ Td> | 250 | |||||
| Protease Typ XXIV | 4 | |||||||
| pH-Wert | 7,4 KOH | 7.3 NaOH | 7.1 KOH | 7,35 NaOH | 7.2 KOH | 7.3 NaOH | 7.3 NaOH | |
. Tabelle 1 Lösungen für die Probengewinnung, Zellisolierung und funktionelle Charakterisierung von Myozyten CP = kardioplegischen Lösung verwendet. DB = Dissoziationspuffer; KB = Kraft-Brühe Lösung; TB = Tyrode-Puffer; PS = Pipettenlösung; EB1 = Enzympuffer 1; EB2 = Enzympuffer 2.
- Bereiten kardioplegischen (CP)-Lösung. CP-Lösung kann bei 4 ° C für bis zu 1 Woche gelagert werden.
- Bereiten Ca 2 +-freien Puffer Dissoziation (DB). Diese Lösung sollte innerhalb des Tages verwendet werden.
- Bereiten Kraft-Brühe (KB)-Lösung. KB-Lösung kann bei 4 ° C für bis zu 1 wee gespeichert werdenk.
- Bereiten Ca 2 +-freien Tyrode-Puffer (TB). Diese Lösung sollte innerhalb des Tages verwendet werden.
- Alle Lösungen mit Spritzenfilter vor der Verwendung.
- Bereiten Sie die Aufschlussgerät (2), ein Schaben des Behälters zwei einander gegen Bürsten aus Silikonelastomer, von denen einer drehbar durch einen Elektromotor gebildet. Die Aufschlussgerät ist eine Sonderanfertigung. Einzelheiten zur Verdauung Vorrichtung sind in Fig. 8; Bilder der Vorrichtung sind in den Fig. 2C und 2D. Das Gewebe Kammer mit 70% Ethanol und Wasser waschen.
2. Erhebung und Verarbeitung der myokardialen Proben
- Gießen Sie 40 ml cardiplegic (CP)-Lösung in einem 50 ml-Tube und speichern sie in Eis für den Transport von der Probe operative Zimmer zur Zellisolierung Labor.
- Sammeln Sie die ventrikuläre Herzmuskelprobe aus dem operativen Raum sofort nach der Exzision, waschen Sie es mit eiskaltemCP-Lösung und speichern sie in der Röhre. Verwenden endokardialen Proben aus dem oberen Zwischenkammerscheidewand bei Operationen am offenen Herzen, Gewichtung> 100 mg ausgeschnitten.
- Schnelle Übertragung von der Probe an das Labor Bereich; Start der Verarbeitung von Proben innerhalb von 10 min von der Probe Exzision.
- Während man die Probe in eiskaltem CP-Puffer, entfernen Sie vorsichtig die fibrotischen endokardialen Schicht mit einer feinen Schere unter einem Stereomikroskop; danach, schneiden Sie den myokardialen Gewebe in kleine Stücke (2-3 mm lang). Je nach Gewebeprobe, Größe, schneiden Sie einen Gesamtbetrag von ventrikulären Myokard zwischen 100 mg und 1 g für jede Isolation.
- Nach Abschluss der Gewebewolf, übertragen Sie die myokardiale Brocken in der Aufschlussgerät, mit sauberen eiskalt CP Lösung. Vermeiden Füllen des gesamten Volumens zwischen den beiden Silizium Bürsten (3-4 ml) mit myokardialen Brocken mit nicht mehr als 1 g der gesamten Gewebes.
3. Waschen und Verdauung der myokardialen Chunks
- Achterner die Brocken in die Schaben Kammer der Verdauung Gerät übertragen, ändern Sie die CP-Puffer in der Kammer mit kaltem Ca 2 +-freien Puffer Dissoziation (DB).
- Den Aufschluss Vorrichtung in einem thermostatischen Bad, um die Kammer in Kontakt mit dem erhitzten Wasser in der Wanne (Abbildung 1). Stellen Sie das Bad auf 37,5 ° C und schalten Sie ihn ein, um die Temperatur des Gewebes Kammer langsam erhöhen. Schalten Sie den Motor des Aufschlussgerät, Einstellung der Rotationsgeschwindigkeit auf 1 Umdrehung / Sekunde.
- Führen Sie 3 Waschzyklen mit der DB, die Änderung der Lösung in der Kammer mit sauberen DB alle 8 min. Die DB erwärmt (37 ° C) und Sauerstoff, bevor sie in Kontakt mit der Herzstücke gesättigt.
- Vorbereitung Enzympuffer 1 (EB1) durch Zugabe von 250 U / ml Collagenase Typ V und 4 U / ml Protease Typ XXIV DB Lösung. Bereiten Enzympuffer 2 (EB2) durch Zugabe von 250 U / ml Kollagenase Typ V an die DB-Lösung. Warm (37 ° C) und oxygenatE EB1 und EB2.
- Führen zwei Zyklen von 12 min Verdau in der Drehvorrichtung Verdauung mit 100% Sauerstoff angereicherten EB1 (bei 37 ° C). Bei jedem Zyklus werden ~ 3 ml EB1. Entfernen Sie die Lösung mit einer Pipette Aspiration und entsorgen Sie sie nach jedem Zyklus.
- Bereiten 6 15-ml-Röhrchen für Zellsammlung und ~ 80 ml kaltem (4 ° C) KB Lösung zur Elution der Puffer.
- Durchführen einer ersten 15 min Verdau Zyklus mit 3 ml 100% mit Sauerstoff angereichert EB2 bei 37 ° C. Nach der Verdauung Zyklus, sammeln die Lösung, die die ersten getrennt Muskelzellen in einer 15 ml Tube und verdünnt das Zellsuspension mit 12 ml kaltem KB Lösung. Bewahren Sie das Flachrohr bei Raumtemperatur.
- Verdünnt das verbleibende EB2 Lösung mit einer gleichen Menge von DB, um die Konzentration von Kollagenase V für die folgenden Zyklen Verdauung halbieren.
- Ausführen anderer 5 12 min Verdau Zyklen mit 3 ml EB2 bei 37 ° C; nachdem jedes von ihnen zu sammeln von Myozyten-enthaltenden Puffer in einem 15 ml konischen Röhrchen undverdünnen Sie es mit 12 ml Lösung KB. 6 speichern die Zelle, die Röhrchen bei Raumtemperatur für 30 min.
4. Zell Resuspension und Ca 2 + réadaptation
- 1 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA) in 20 ml Ca 2 +-freien Tyrode-Puffer (TB). Filtern Sie die Lösung.
- Zentrifugieren Sie die sechs myocyte enthält konische Röhrchen bei 100 xg für 5 min auf Muskelzellen zu begleichen erzwingen. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren der Zellen in jedem Röhrchen mit einer variablen Menge (1-3 ml, abhängig von der Ausbeute) BSA enthält TB bei RT.
- Ca 2 +-Konzentration schrittweise erhöhen, in der Zelle, die Puffer durch Zugabe von kleinen Portionen von 100 mmol / l CaCl 2-Lösung. In den ersten und zweiten Schritten von Ca 2 +-Konzentration bis zu 50 &mgr; mol / l und 100 mmol / L bzw. angehoben. Folgende Ca 2 +-Zugabe Schritte alle 5 min durchgeführt und die Konzentration von 100 &mgr; mol / L bei jedem Schritt t angehobenoa endgültige Konzentration von 0,9 mmol / L.
- Bewerten Sie die Ausbeute des Isolierungsverfahren. Übertragen Sie 0,5 ml myocyte haltigen Lösung auf die Glasbodenkammer eines Mikroskops. Bewerten 15 Mikroskopfelder bei 10-facher Vergrößerung und Ziel berechnen den Anteil der gesunden Muskelzellen (zB stabförmige Zellen mit klaren Rillen und keine signifikanten Einschlüsse, Abbildung 2). Die erwartete Rendite liegt bei etwa 20%.
5. Funktionale Bewertung von isolierten Kardiomyozyten.
Das folgende Protokoll ist ein Beispiel für menschlichen Kardiomyozyten funktionelle Beurteilung einschließlich simultane Messungen von Aktionspotentialen und intrazelluläre Ca2 +-Flüsse.
- Bereiten Pipettenlösung (PS) für die Patch-Clamp-Experimente in perforierten Patch-Konfiguration. Die Lösung kann bei -20 ° C für bis zu 3 Monate aufbewahrt werden.
- In 1,8 mmol / l CaCl 2 Ca 2 +-freien Tyrode-Puffer (TB). Use diese Lösung für Superfusion der Herzmuskelzellen während der Patch-Clamp-/ Fluoreszenzexperimente.
- 1 ml der Zellsuspension in ein 1,5-ml-Röhrchen und fügen 10 mmol / L Fluoforte und 10 ul Antriebsladung Konzentrat. Inkubation 30 min bei RT. Danach stellen Sie den Schlauch in vertikale Position und die Zelle verlassen, um für 5 min zu regeln; Resuspendieren der Zellen in Ca 2 + TB enthält.
- Übertragen 0,25 ml der Zellsuspension in ein kleines (0,5 ml), montiert temperaturgesteuerten Mikroskop-Aufzeichnungskammer, durch die Schwerkraft mit einem beheizten microperfusor System bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,3 ml / min superfundiert (Temperatur: 37 ± 0,5 ° C).
- Verwendung einer Pipettenziehvorrichtung, herzustellen Patch-Clamp-Pipetten mit einem Spitzendurchmesser von 3 bis 5 &mgr; m und einem Widerstand von 3 bis 4,5 M, wenn sie mit PS gefüllt.
- In Amphotericin B zu einer Charge von PS (250 pg / ml) und verwenden Sie es, um die Elektroden zu füllen.
- Wählen Sie eine stabförmige Zelle mit klaren Schichten, frei von Einschlüssen, form die Giga-Dichtung und warten Sie 5 bis 10 Minuten, bis der Zugriff Widerstand unter 20 MOhm.
- Elicit Aktionspotentiale in der Stromzange Modus mit kurzen Pulsen (<3 ms) bei unterschiedlichen Frequenzen der Stimulation (0,2 Hz, 0,5 Hz und 1 Hz, 1 min bei jeder Frequenz). Während der Aufzeichnungsphase, schalten Hellfeldbeleuchtung bei 492 ± 3 nm und erkennen Fluoforte Fluoreszenz bei 505-520 nm auf. Erwerben Fluoreszenz und Membranpotential Signale mit Digidata 1440A und pClamp 10.0 Software. Wiederholen Sie die Aufnahmesequenz mehrmals, wenn nötig; allerdings halten die Gesamtaufnahmezeit von unter 15 min für jede Zelle.
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Representative Results
Das oben beschriebene Verfahren wurde verwendet, um die funktionellen Störungen von Kardiomyozyten aus der Scheidewand des Patienten mit hypertropher Kardiomyopathie (HCM) die Myektomie Operation unterzog isoliert charakterisieren, verglichen mit nicht andernfalls nicht hypertrophe chirurgischen Patienten 21. Die in diesem Abschnitt enthalten sind, aus diesem Werkstück 21 ab und sind hier als ein Beispiel, wie diese Technik verwendet, um die Änderungen der Herzmuskelzellfunktion bei Herzerkrankungen Bedingungen charakterisieren gezeigt.
Eine repräsentative Probe von einem chirurgischen Patienten mit HCM ist in 2A gezeigt. Chirurgische Proben waren in Bezug auf Größe und Dicke des endokardialen Faserstreifen extrem variabel. Die Höhe der Herzgewebe, die wir für jede Isolierungsverfahren aus HCM-Proben verwendet wurde um 1g. Stattdessen wird die Menge des Gewebes für die Kontrollproben verwendet wurde, war kleiner (100-500 mg). Aufgrund Lower Verfügbarkeit Gewebe. Die Ausbeute war signifikant höher als die Kontrollproben wurden hinsichtlich HCM verarbeitet, wahrscheinlich, weil die relative Menge an lebensfähigen Zellen innerhalb des myokardialen Gewebes in HCM Myokard verringert und Endomyokard Fibrose erhöht 22. Aus diesen Beobachtungen schlossen wir, dass die erforderliche Menge an Gewebe, um lebensfähige Zellen zu erhalten, kann variabel in Abhängigkeit von der Abwesenheit oder Anwesenheit von Herzkrankheit.
Proben wurden in kleine Stücke geschnitten, wie in Fig. 2B gezeigt. Danach wurden die Stücke in die Kammer des Aufschlussvorrichtung (2C) übertragen und als Einzelzellisolierung wie oben beschrieben (Fig. 2D) beschrieben, verwendet. Repräsentative Mikrofotografien von einer mit dem beschriebenen Zellisolierungsverfahren aus einer Scheidewand Probe erhaltene Zellsuspension wird in den 3A und 3B dargestellt ist; vergrößerte Bilder von einzelnen ventrikulären ca.rdiomyocytes sind in den Fig. 3C-3F dargestellt. Kardiomyozyten aus HCM Proben wurden zur gleichzeitigen Messungen von Aktionspotentialen und die intrazelluläre Ca 2 +-Variationen, wie in dem Protokoll beschrieben verwendet. Repräsentative Spuren gleichzeitige Darstellung Membranspannung (oben) und intrazelluläre Ca 2 + (unten) während der Stimulation bei 3 verschiedenen Frequenzen sind in Fig. 4 gezeigt: Diese Bahnen wurden aus einer Kardiomyozyten aus einer Probe isoliert HCM aufgezeichnet.
Ergebnisse der Patch-Clamp-Studien zeigten, dass die Aktionspotentialdauer (APD) bei verschiedenen Frequenzen der Stimulation aufgezeichnet wurde deutlich in Herzmuskelzellen von Patienten mit HCM (HCM Kardiomyozyten) verlängert im Vergleich zu den Kontrollen (Fig. 5A und 5B). Die Aufrechterhaltung der physiologischen Antworten in isolierten Myocyten zu ermitteln, untersuchten wir die Wirkung von Isoproterenol, 10 verwendet - 7 M (Fig. 5C): β-adrenergic Stimulation erzeugt die erwartete Verkürzung AP in Steuermuskelzellen. Seit längerer APD führt zu einem erhöhten Risiko von früh nach Depolarisationen (EADS) 23, das Auftreten von EADS, erkannt als spontane Depolarisationen während der Plateauphase des AP, wurde gemessen. In HCM Kardiomyozyten waren EADs signifikant häufiger im Vergleich zu Kontrollen (5D). Repräsentative Spur zeigt mehrere EADS ist in 5E gezeigt
Um zu testen, ob mehr APD und Ionenstrom-Anomalien können Erregung und Kontraktion Kopplungsmechanismen in HCM Kardiomyozyten beeinflussen, wurden die Eigenschaften der intrazellulären Ca 2 +-Varianten während der Stimulation bewertet. Die Amplitude von Ca 2 +-Transienten in Strom-Clamp-Bedingungen hervorgerufen waren im Vergleich zu ähnlichen HCM Kardiomyozyten (6A) zu steuern. Umgekehrt wird die Kinetik der Ca 2 +-Transienten, signifikant länger im HCM (Abbildung6B). Zusätzlich war intrazellulären diastolischen Ca2 +-Konzentration deutlich höher im Vergleich zu Kardiomyozyten HCM (6C) zu steuern und um mehr prominent auf Erhöhung der Stimulationsfrequenz.
Insbesondere Kardiomyozyten mit diesem Verfahren aus menschlichen Ventrikel-Proben isoliert wurden auch erfolgreich für andere Anwendungen, einschließlich der Voltage-Clamp-Aufnahmen von spezifischen Transmembranströme (Figur 7A) verwendet werden, die intrazelluläre Ca 2 + und / oder die Zellverkürzung Aufnahmen während der elektrischen Feldstimulation (Abbildung 7B) und die Beurteilung der Feinstruktur der Sarkolemma mittels konfokaler Mikroskopie und membrangebundenen Fluoreszenzmarkierungen (7C).
Abbildung 1. Flussdiagramm der Zellisolationsverfahren.
Abbildung 2. Verarbeitung von ventrikulären Proben zur Zellisolierung. (A) Repräsentatives Bild, das eine Probe von ventrikulären Herzmuskel eines Patienten mit HCM, die Septum-Operation unterzog Myektomie. Kalibrierung bar = 5 mm. (B) Chunks von ventrikulären Gewebe geschnitten aus einer ventrikulären Gewebeprobe, um zur Zellisolierung verwendet werden. Kalibrierung bar = 5 mm. (C) Bilder von der Aufschlussgerät. Die Vorrichtung umfasst eine Digestionskammer mit zwei Silicium Bürsten: die überlegene Bürste ist in der Lage, sich zu drehen, wenn sie durch einen Motor bewegt (D) Bild, das die Verdauung Vorrichtung in der thermostatisierten Bad bei der enzymatischen Verdauung des ventrikulären Gewebes.. p>
Abbildung 3. Isolierten menschlichen Kardiomyozyten. (AB) Das Panel zeigt Mikroaufnahmen von zwei Mikroskopfelder (10x Objektiv), die Vertreter Kardiomyozyten Suspensionen. Zu beachten ist, etwa 30% der Zellen sind stäbchenförmig und zeigen deutliche Schlieren. Kalibrierung bar = 100 um. (CE) Repräsentative Bilder der drei menschlichen Kardiomyozyten aus einer Probe eines Patienten HCM (40x) isoliert. Kalibrierung bar = 20 um. (F) Bild zeigt einen menschlichen Kardiomyozyten von der Spitze der Patch-Pipette für Aufnahmen berührt. Kalibrierung bar = 20 um.
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4. Gleichzeitige Aufnahme von Membranpotential-und intrazellulären Calcium. Repräsentative Spur zeigt das Membranpotential (oben) und intrazellulären Calcium (unten) von einer einzigen Myozyten von einer Probe isoliert HCM aufgezeichnet. Die Myozyten wird über die Patch-Pipette mit 0,2 Hz, 0,5 Hz und 1 Hz stimuliert.
Abbildung 5. Änderungen von Aktionspotentialen in Kardiomyozyten aus HCM-Proben. (A) Vertreter überlagert Aktionspotentiale ausgelöst bei 0,2 Hz, 0,5 Hz und 1 Hz von einem Steuer Myozyten (links, graue Spuren) und HCM Myozyten (rechts, schwarz Spuren ) (B) Durchschnittsaktionsdauer. Potential bei 90% Repolarisation (APD90%) in HCM (n = 81) undSteuer Kardiomyozyten (n = 29) an den drei Stimulationsfrequenzen getestet. (C) Das Auftreten von EADS Kardiomyozyten aus HCM-Patienten und Kontrollproben. (D) überlagert, Aktionspotentiale bei 0,5 Hz von einem Steuer Myozyten in Abwesenheit (durchgezogene Kurve) und in Gegenwart von 10 -7 M Isoproterenol. (E) Vertreter Spur zeigt Membranpotential eines Kardiomyozyten aus einer HCM Patienten der mehrere spontane Depolarisationen während der Plateauphase (früh nach Depolarisationen, EADS) auftreten, die durch Pfeile gekennzeichnet. Stimuli werden durch kurze Zeilen unterhalb der Spur markiert. ** = P <0,01 ungepaarten t-Test. Alle Panels sind in der Abbildung mit Genehmigung von Coppini et al 2012 21 modifiziert..
Abbildung6. Änderungen der Kalzium-Transienten in Kardiomyozyten aus HCM-Proben. (A) Vertreter überlagerten Calcium-Transienten hervorgerufen während der Stimulation mit 0,2 Hz über die Patch-Pipette in einem Steuer Myozyten (grau) und ein HCM-Zelle (schwarz). Insbesondere ist die Amplitude von Ca 2 +-Transienten nicht zwischen den beiden Zellen unterscheiden (B) Kinetik der Ca 2 +-Transienten in HCM (n = 42) Kontrolle (n = 24) Kardiomyozyten:. Zeit von Stimulus transiente (TP Spitzen ), die Zeit von der Spitze zu 50% Zerfall (T50%) und die Zeit von Gipfel zu 90% Zerfall der transienten (T90%) gezeigt. (C) Vertreter lange Spuren, die intrazelluläre Ca2 + während der Stimulation an 3 verschiedenen Frequenzen in HCM und Steuermuskelzellen, Hervorhebung der erhöhten diastolischen Ca 2 + bei hohen Stimulationsfrequenzen in der HCM myocyte. (D) Durchschnittliche diastolischen Ca 2 + in HCM (n = 42) und Kontrolle (n = 24) Kardiomyozyten in 3 verschiedenen Stimulations rates. ** = P <0,01 ungepaarten t-Test. Alle Panels sind in der Abbildung mit Genehmigung von Coppini et al 2012 21 modifiziert..
.. Abbildung 7 Zusätzliche experimentelle Anwendungen unter Verwendung von humanen Kardiomyozyten (A) Links: Vertreter lagert Spuren, L-Typ-Ca 2 +-Strom unter Spannungsklemme aufgenommen bei verschiedenen Membranspannungen mit einem bestimmten Protokoll (siehe 21 für Details). Rechts: durchschnittliche L-Typ-Ca 2 +-Strom Spitzendichte von 18 Zellen aus HCM-Proben isoliert auf verschiedenen Membran. Spannungen. (B) intrazelluläre Ca 2 + aus einem Ventrikelmyocyten während der elektrischen Feldstimulation bei 1 Hz aufgezeichnet zu verfolgen. (C) konfokale Bild einer ventrikulären cardiomyocyte aus einer HCM Probe mit einem Fluoreszenzfarbstoff Membran gebunden (Di-3-ANEPPDHQ) gefärbt. Zu beachten ist, ist die Dichte der ttubules niedrig, was darauf hindeutet, morphologische Membranumbau im HCM.
Abbildung 8. Die Aufschlussgerät. (AB) Komponenten des Aufschlussgerät. Ein variabler Geschwindigkeit drehenden Motor mit einem ersten Kunststoff Arm, der mit einem zweiten verbunden ist. Das zweite Kunststoffarmes entfernbar und an die obere Bürste verbunden. Pinsel werden mit Silikon-Elastomer. Ein PTFE-Negativform, mit 100 Bohrungen im Abstand von ~ 1,5 mm wurde verwendet, um die Bürsten aus Flüssig-Silikon gegossen. Der Innenraum der Gießform 1,9 cm Durchmesser und 6 mm dick, wodurch Bürsten mit der gleichen Größe. Die auf einer Seite der Form angeordnet sind, um Löcher zu 8 mm langen Borsten herzustellen gemacht, wenn die Bürstengegossen und aus der Form entfernt. Nachdem die flüssige Silikon in die Form gebracht werden mindestens 48 h zur vollständigen Härtung benötigt. Bürsten werden in einem Glasrohr befestigt (innerer Durchmesser = 2 cm, Dicke 2 mm) und die zylindrische Kammer durch die zwei Bürsten und den Glaswänden gebildet ist hermetisch durch zwei Gummi-O-Ringen abgedichtet. Bürsten müssen gedrückt werden, um eine dem anderen; der Boden eine auf einer Kunststoffbasis verklebt, während die obere mit der Kunststoffseite des Motors Arm geklebt und somit in der Lage, sich zu drehen. (C) vergrßerte Ansichten der oberen Bürste. Zu beachten ist, muss die Bürste bis zum Ende des Kraftarmes, damit es sich zu drehen (D) Die Komponenten der Kammer in ihrer endgültigen Position dargestellt verklebt werden. Der Raum zwischen den beiden Bürsten (die eigentliche Kammer) ist ca. 2 cm breit und 7-8 mm hoch; dieser Raum passt problemlos 3-4 ml Puffer, andere als bis zu 1 g der myokardialen Gewebe.
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Discussion
Wir haben beschrieben und validiert, eine Methode, um praktikable Muskelzellen von chirurgischen Proben menschlichen Myokard zu isolieren. Ausgehend vom zuvor beschriebenen Protokolle, die erfolgreich an isolierten Zellen von Vorhof chirurgischen Proben, die Technik benutzt hatte, um eine Trennung von einzelnen tragfähige Muskelzellen von erkrankten Myokard entwickelt und fein abgestimmt. Frühe Berichte zeigten, dass Isolierung einzelner Kardiomyozyten aus Brocken von atriale und ventrikuläre Gewebe selektiv beeinträchtigt repolarisierender Kaliumströme, was zu veränderten elektrophysiologischen Eigenschaften und Reaktionen auf physiologische Reize 8,24, während die Lieferung der enzymhaltigen Puffer über koronare Perfusion nicht verzögerten Gleichrichter beeinträchtigen Ströme in Zellen zu isolieren 25. Leider Isolierung von humanen Kardiomyozyten aus chirurgischen Proben von ventrikulären Herzmuskel kann nicht durch koronare Perfusion, da die Integrität der koronaren Filialen durchgeführt werdenverloren ist, im Widerspruch zu explantiert Herzen. Kardiomyozyten aus myokardialen Brocken mit unserem Verfahren isoliert zeigen eine klare Anpassung der Aktionspotentialdauer in Reaktion auf Änderungen von Schrittmacherfrequenz oder β-adrenergen Stimulation. Um solche Reaktionen auftreten, wird die Integrität des verzögerten Gleichrichter-Kaliumkanäle benötigt 26-28, was die Gesamtintegrität dieser Kanäle wird durch unsere Isolierungsverfahren beeinträchtigt. Zusätzlich Zellen mit unseren Methoden isoliert zeigen nicht nur regelmäßige elektrophysiologischen Reaktionen (Abbildungen 3 und 4), aber auch anzeigen Calciumtransienten der erwarteten Form und Dauer (3 und 5) und regelmäßige sarcomeric Organisation (Abbildung 2) und die Verkürzung der Eigenschaften (nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass die gesamte strukturelle Integrität dieser Zellen wird durch diese Isolierungsverfahren erhalten. Der Haupt Weiterentwicklung dieses Verfahrens gegenüber früherenTechniken wird durch die neu gestaltete Aufschlussgerät, das sanfte mechanische Rühren von Gewebestücke liefert, so dass einzelne Zelle Trennung ohne übermäßige Schäden zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus erlaubt die Verwendung des Aufschlussgerät uns, eine niedrigere Konzentration von Enzymen bei der Zellisolierungspuffer einzusetzen; insbesondere sind wir mit eine viel geringere Konzentration von nicht selektiven Protease im Vergleich zu früher berichteten Methoden 24. Das Gerät ist speziell in unserem Labor: Gebäudepläne sind in Abbildung 8 dargestellt.
Der einfache Aufbau und Struktur macht es sehr einfach, für einen erfolgreichen Abschluss des Protokolls zu replizieren. Die Legende zu Abbildung 8 beschreibt auch die für die Herstellung der Silikonpinsel und den Aufbau der erforderlichen Verfahren Schaben Kammer. Aufgrund der Vorteile der Aufschlusseinrichtung kann eine relativ hohe Anzahl von lebensfähigen Zellen, die aus einer relativ geringen Menge des ventrikulären Gewebes (so niedrig wie 100 mg) erhalten werden.Ein zuvor publizierten Methode 19 wurde gezeigt, dass eine Kalzium-tolerant Muskelzellen von kleinen Biopsien (auch <20 mg). Allerdings ist die Ausbeute berichtet myocyte war sehr niedrig und die Autoren nicht zeigen, ob Zellen, die mit diesem Verfahren isoliert wurden zur Charakterisierung der intrazellulären Calcium-Rad-und Kontraktionsfunktion möglich. Diese Technik ist potentiell für viele chirurgische Patienten, da kleine Abschnitte der Scheidewand sind häufig während Klappenersatzverfahren (z. B. Ersatz der Aortenklappe.) Ausgeschnitten. , Ist der entscheidende Punkt, um eine erfolgreiche Isolierung erhalten jedoch eine schnelle Einleitung des Verfahrens nach der Probenahme aus dem Operationssaal. Daher ist es für die Zelle Labor erforderlich, um in der Nähe der Herzchirurgie der Klinik sein, um für diese Technik, fruchtbar zu sein. Zusätzlich ist eine richtige Enzymaktivität auch extrem wichtig für eine erfolgreiche Isolation. Da die unselektive Proteaseaktivität of jede Charge Kollagenase ist in der Regel nicht vollständig getestet ist jede Menge wahrscheinlich während der Zellisolierung anders durchzuführen. Es ist daher wesentlich für die Feineinstellung der endgültigen Konzentration von Kollagenase, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Wir schlagen vor, beobachten Zellsuspension unter dem Mikroskop bei jedem Zyklus, um sicher zu sein, dass lebensfähige Zellen beginnen bei Zyklus 3 erscheinen Frühe Darstellung von Zellen deutet darauf hin, übermäßige Enzymaktivität und fordert zur Reduzierung der Enzymkonzentration. Aussehen der Zellen nach Zyklus 3 legt nahe, unzureichende Enzymaktivität. Nach unserer Erfahrung ist dies die effektivste Indikator für die richtige Enzymkonzentration.
Wir haben erfolgreich diese Methode verwendet, um einzelne Herzmuskelzellen aus der Zwischenkammerscheidewand von HCM-Patienten mit linksventrikulärer Ausflusstraktobstruktion einer chirurgischen Septum Myektomie, als auch von Nicht-Versagen nicht-chirurgischen Patienten hypertrophe 21 zu erhalten. Die Ergebnisse aus diesem Papierzeigen, dass mit dieser Methode Muskelzellen isoliert kann für die komplette elektrophysiologische Bewertung mit Patch-Clamp-Techniken verwendet werden, während gleichzeitig die Beurteilung EC-Kopplung-Anomalien, durch Aufzeichnung intrazellulären Calcium-Dynamik mit Fluoreszenzfarbstoffen. Die hier beschriebene Aufzeichnungsverfahren erlaubt uns, verschiedene physiologische Zellparameter mit einem einzigen Aufzeichnungs von jeder Zelle zu sammeln, wodurch eine große Menge von Daten mit einer begrenzten Anzahl von Zellen und Proben. Dank dieser Vorteile hat dieses Verfahren erfolgreich verwendet worden, um die spezifischen funktionellen Abnormalitäten Kardiomyozyten aus HCM-Patienten zu charakterisieren, verglichen mit nicht hypertrophe Patienten 21. Anomalien der Ionenströme und Aktionspotentialdauer sowie kinetische Anomalien od intrazellulären Ca 2 + Radfahren eindeutig Verwendung dieser Technik mit hoher Reproduzierbarkeit gekennzeichnet. Darüber hinaus haben wir, dass die Behandlung mit einem selektiven Inhibitor des Na + spät gezeigten vs. Placebo bei Patienten mit HCM 29, die derzeit im Gange.
Menschliche Herz Probe Verfügbarkeit ist relativ bescheiden, auch in spezialisierten Zentren, und dies kann eine breite Anwendbarkeit dieser Technik zu begrenzen. Dennoch ist die Qualität der Informationen, die direkt aus Patientenproben auf krankheitsbedingte Veränderungen der Herzmuskelfunktion erhalten werden kann, vergleichbar mit dem erzielbaren aus Tiermodellen von HCM und anderen Herzerkrankungen. Angesichts der umfangreichen Unterschiede zwischen denPhysiologie des Menschen und der Maus Herzmuskelzellen können Daten von funktionalen Bewertung des menschlichen Muskelzellen äußerst wertvoll sein. Als Abschluss, glauben wir, dass zukünftige Anwendungen dieser Technik können wesentlich zum Wissen über Herzerkrankungen beitragen, da unser Protokoll bietet die Möglichkeit, eine komplette Reihe von Funktionsprüfungen direkt auf die Zellen aus Patientenproben durchzuführen, mit sofortiger Translationswert.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der EU (STREP Projekt 241577 "BIG HEART" 7. Europäischen Forschungsrahmenprogramm, CP), Menarini International Operations Luxemburg (AM), Telethon GGP07133 (CP) und Gilead Sciences (AM) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4*7H2O) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Sigma-Aldrich | 237205 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Sodium hydroxide(NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate | Sigma-Aldrich | 49601 | |
| Pyruvic acid | Sigma-Aldrich | 107360 | |
| 3-Hydroxybutyric acid | Sigma-Aldrich | 166898 | |
| Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| Succinic Acid | Sigma-Aldrich | S3674 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E0396 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A0281 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V | Sigma-Aldrich | C9263 | |
| Proteinase, Bacterial, Type XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | |
| Calcium chloride solution, ~1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | |
| Calcium chloride 0.1 M solution | Sigma-Aldrich | 53704 | |
| Potassium methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 83000 | |
| FluoForte Reagent | Enzo Life Sciences | ENZ-52015 | |
| Powerload concentrate, 100X | Life Technologies | P10020 | |
| Perfusion Fast-Step System | Warner Instruments | VC-77SP | |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528 | |
| Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | ||
| Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
| pClamp10.0 | Molecular Devices | ||
| Digestion Device | CUSTOM | CUSTOM | The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Figure 1C-1D and in Figure7. We can provide further details if requested. |
| Silicone elastomer for the digestion device's brushes | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Variable speed rotating motor for the digestion device | Crouzet | Crouzet 178-4765 | |
| Mold for brushes casting | N.A. | N.A. | The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods. |
References
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