Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Isolering och funktionell karakterisering av Human Ventrikulär Cardiomyocytes från Fresh Kirurgiska prover

Published: April 21, 2014 doi: 10.3791/51116
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1, 1, 2, 1
1Department NeuroFarBa, Division of Pharmacology, University of Florence, 2Department of Clinical and Experimental Medicine, Division of Physiology, University of Florence

Summary

Aktuell kunskap om den cellulära grunden för hjärtsjukdomar förlitar sig främst på studier av djurmodeller. Här beskriver vi och validera en ny metod för att erhålla enstaka livskraftiga hjärtmuskelceller från små kirurgiska prover av mänsklig ventrikulär hjärtmuskeln. Mänskliga ventrikulära myocyter kan användas för elektrofysiologiska studier och drogtestning.

Abstract

Cardiomyocytes från sjuka hjärtan utsätts för komplexa remodeling processer som innefattar förändringar i cellstrukturen, excitation kontraktion koppling och membran jonströmmar. Dessa förändringar kommer sannolikt att vara ansvarig för den ökade arytmogena risk och de kontraktila förändringar som leder till systolisk och diastolisk dysfunktion hos hjärtpatienter. Emellertid har mest information om de förändringar av myocyt funktion i hjärtsjukdomar kommer från djurmodeller.

Här beskriver vi och validera ett protokoll för att isolera livskraftiga myocyter från små kirurgiska prover av ventrikulär hjärtmuskeln från patienter som genomgår hjärtkirurgi verksamheten. Protokollet beskrivs i detalj. Elektrofysiologiska och intracellulära mätningar kalcium rapporteras att demonstrera genomförbarheten av ett antal encelliga mätningar i humana ventrikulära hjärtmuskelceller som erhålls med denna metod.

Protokollet rapporterade hanre kan vara till nytta för framtida undersökningar av den cellulära och molekylära grunden för funktionella förändringar av det mänskliga hjärtat i närvaro av olika hjärtsjukdomar. Vidare kan denna metod användas för att identifiera nya terapeutiska mål på cellnivå och för att testa effektiviteten av nya föreningar för mänskliga hjärtmuskelceller, med direkt translationell värde.

Introduction

Dissektion av de elektrofysiologiska egenskaperna hos hjärtmuskeln har utvecklats markant efter att utveckla tekniker för enkel hjärt myocyte isolering. Nya framsteg i förståelsen av hjärt-excitation Sammandragning Koppling (EG-Coupling) har också gjorts möjligt genom förmågan att isolera livskraftiga enstaka hjärtmuskelceller som har kvar alla de fysiologiska egenskaperna hos den intakta vävnaden. Patch-clamp-förfaranden är rutinmässigt används för att studera funktionen och farmakologisk modulering av kardiell sarcolemmal jonströmmar. Inspelningar av intracellulära kalciumdynamik med Ca 2 +-känsliga färgämnen också regelbundet utförs på enskilda hjärtmyocyter från en mängd olika friska och sjuka modeller, som ger viktiga data om fysiologi EG-koppling samt på de patologiska förändringar av intracellulär Ca2 + homeostas leder till mekanisk försämring och ökad arytmogena börda i hjärtsjukdomar. Information från dessa studier är kritisk för att förstå de elektrofysiologiska och mekaniska effekter av läkemedel i klinisk miljö. Men det finns artspecifika skillnader i trans strömmarna och i EG-Coupling proteiner som står för särdrag hjärtats aktionspotential och hjärt mekanik. Medan studier av myocyter isolerade från icke-humana däggdjur har klargjort biofysikaliska egenskaper och fysiologiska roller specifika trans jonkanaler och EG-Coupling proteiner, de inte nödvändigtvis relevanta modeller för mänskliga hjärtmuskelceller. Isolering av livskraftiga myocyter från mänskliga hjärtmuskeln är därför viktigt att till fullo förstå patofysiologin av hjärtsjukdomar och validera nya terapeutiska metoder.

Human förmaksvävnad är lätt tillgänglig som förmaks bihang ofta kastas under kirurgiska ingrepp. Initiala kvantitativa studier av vuxna humana hjärtaktionspotentialer och joniska currents anställd enzymatiskt isolerade förmaks celler 1-4. Inspelningar av aktionspotentialer eller strömmar från isolerade vuxna humana kammarceller har därefter rapporterats 3,5-10. De flesta av dessa studier har använt celler från explanterade hjärtan och utnyttjade antingen kollagenas perfusion av ett kranskärl segment eller exponering av relativt stora mängder utskuren vävnad att kollagenas för att erhålla isolerade celler. Dessa studier får en detaljerad beskrivning av ett antal trans jonströmmar från humana ventrikulära hjärtmuskelceller från friska hjärtan och från patienter med terminal hjärtsvikt. Inspelningar av L-typ Ca2 + ström (I Ca-L) 5-7, övergående utåt kalium Ström (jag) 8, aktiv likriktare kaliumström (I κ1) 8, de olika komponenterna i fördröjd likriktare kaliumström (I κ ) 9 har rapporterats. Förskott och förädling avisoleringsförfarandet 10, får en tydlig karakterisering av den joniska grunden för ökad arytmogena potentialen i terminal hjärtsvikt, som består av aktionspotential förlängning 11, försenas efter depolarisationer 12 och ökad rolig ström 13 som leder till diastolisk depolarisering och prematura beats.

Vuxen hjärtmyocyter normalt isoleras från smådjur genom retrograd perfusion av hela hjärtat med olika enzymblandningar, en teknik som ger höga utbyten av Ca 2 +-toleranta celler 14. Isolering av hjärtmuskelceller från fragment av vävnad sin natur är mindre framgångsrik förmodligen på grund av den begränsade tillgången av enzymer till enskilda myocyter jämfört med den som uppnås genom perfusion av kranskärlen. På grund av den mycket begränsade tillgången på oanvända donor hjärtan, är det enda praktiska sättet att få normala mänskliga ventricular celler regelbundet genom enzymatisk digestion av de ofta mycket små vävnadsfragment utskurna vid elektiva kirurgiska ingrepp. Den enda modellen mänsklig sjukdom som har blivit grundligt karakteriseras på cellnivå är terminal hjärtsvikt på grund av tillgängligheten till transplanterade hjärtan. Dock förekommer terminal hjärtsvikt hos en minoritet av patienterna och innebär en gemensam väg för svår ombyggnad av hjärtmuskelceller, som är relativt oberoende av den bakomliggande orsaken 15 ofta. Förmågan att bedöma funktion av enstaka hjärtmuskelceller från patienter i ett tidigare icke misslyckas stadium av sjukdomen är avgörande för att förstå den specifika patofysiologi av olika ärftliga eller förvärvade förhållanden. Hypertrofisk kardiomyopati (HCM) är ett talande exempel. HCM är en vanlig (1/500 personer) ärftliga hjärt tillstånd som kännetecknas av hjärthypertrofi, ökat arytmogena förändringar risk-och sammandragande på grund av utflöde obstruktion och diastolisk dysfunktion 16. Cardiomyocytes från HCM hjärtan undergo en komplex remodeling processer med förändringar i cellstruktur (hypertrofi, myofibrillar oordning) och EG-Koppling 17. Emellertid har mest information om myocyt dysfunktion i HCM kommer från transgena djurmodeller. Eftersom endast en minoritet av HCM patienter utvecklas mot terminal hjärtsvikt och kräver hjärttransplantation, HCM hjärtan är mycket sällan tillgängliga för cellisolering med standardmetoder. Men minst 30% av HCM patienterna utvecklar obstruktiva symtom på grund av massiva septal hypertrofi förändra utflöde blodflödet under systole (HCM) 18. Den mest effektiva tillgängliga behandlingsalternativ för att lindra obstruktion i HCM är kirurgiskt septal myectomy: Under detta kirurgiska ingrepp, är en variabel storlek del av övre septum bort av trans aortic tillvägagångssätt. Denna del av hypertrophied septum är därför tillgänglig för cell isolering från den friska vävnaden.

Förfarande för isolering av humant ventricular myocyter från enstaka, små transvenösa endomyokardbiopsi exemplar har tidigare utvecklat och publicerat 19. Vi genomförde en metod för att isolera enstaka septal myocyter från ventrikulära hjärtmuskeln prover från patienter som genomgår hjärtkirurgi, inklusive patienter med HCM genomgår septal myectomy och patienter som genomgår ventilersättningsförfaranden. Förutom en detaljerad beskrivning av isoleringsprotokoll, representativ elektrofysiologiska och Ca 2 + fluorescens Måtten visas, påvisa bärkraften av de isolerade humana ventrikulära myocyter och genomförbarheten av patch clamp och intracellulära Ca2 +-studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De experimentella protokoll om mänsklig vävnad godkändes av den etiska kommittén för Careggi University-sjukhuset (2006 / 0.024.713, förnyade maj 2009). Varje patient gav skriftligt informerat samtycke.

1. Lösningar och utrustning Förberedelse

Lösningar beskrivs i Tabell 1. Ett förenklat flödesschema för cellisolering förfarande återfinnes i fig 1.

Lösning CP DB KB TB PS EB1 EB2
Reagens (mM) KH 2 PO 4 50
MgSO 4 8 1,2 5 1,2 1,2
HEPES 10 10 10
adenosin 5
glukos 140 10 20 10 10 10
mannitol 100
taurin 10 20 5 20 20
NaCl 113 136 113 113
KCl 4,7 85 5,4 25 4,7 4,7
MgCl2 </ Td> 1,2 5
KH 2 PO 4 0,6 30 0,6 0,6
Na 2 HPO 4 0,6 0,6 0,6
NaHCO 3 12 12 12
KHCO3 10 10 10
Na-pyruvat 4 4 4
BDM 10 10 10
BHBA 5 </ Td>
bärnstensyra 5
EGTA 0,5
K 2-ATP 2
pyrodruvsyra 5
kreatin 5
KMES 115
Enzymer (U / ml) Kollagenas typ V 250 </ Td> 250
Protease Type XXIV 4
pH 7,4 KOH 7,3 NaOH 7,1 KOH 7,35 NaOH 7,2 KOH 7,3 NaOH 7,3 NaOH

. Tabell 1 Lösningar som används för provtagning, cellisolering och funktionell karakterisering av myocyter CP = kardioplegiska lösning.; DB = dissociation buffert; KB = Kraft-Bruhe lösning; TB = Tyrode buffert; PS = pipett lösning; EB1 = enzymbuffert 1; EB2 = enzymbuffert 2.

  1. Förbered kardioplegisk (CP)-lösning. CP lösning kan förvaras vid 4 ° C i upp till en vecka.
  2. Förbered Ca2 +-fri dissociationsbuffert (DB). Denna lösning skall användas under dagen.
  3. Förbered Kraft-Bruhe (KB) lösning. KB lösningen kan lagras vid 4 ° C i upp till en week.
  4. Förbered Ca2 +-fri Tyrodes buffert (TB). Denna lösning skall användas under dagen.
  5. Filtrera alla lösningar med hjälp av sprutfilter före användning.
  6. Förbered uppslutningsanordning (figur 2), ett skrapande behållare gjord av två mot varandra vända borstar av silikonelastomer, ett av vilka roteras av en elektrisk motor. Rötnings enheten är skräddarsydd. Detaljer på uppslutningsanordningen är i fig 8; bilder av anordningen i fig. 2 C och 2D. Tvätta vävnaden kammare med 70% etanol och vatten.

2. Insamling och behandling av myocardial Prover

  1. Häll 40 ml cardiplegic (CP) lösning i en 50 ml tub och förvara den i is för provet transport från operationsrummet till cellisolering labbet.
  2. Samla de ventrikulära hjärt provet från den operativa rum omedelbart efter excision, tvätta den med iskallCP-lösning och förvara den i röret. Använd endokardiella prover utskurna från den övre interventrikulära septum under öppen hjärtkirurgi, viktning> 100 mg.
  3. Snabbt överföra provet till labbet området; börja provbehandling inom 10 min från provet excision.
  4. Samtidigt som förlagan i iskall CP buffert, försiktigt bort endokardiala fibrotisk lagret med fina sax under ett stereomikroskop; efteråt, skär hjärtmuskelvävnaden till små bitar (2-3 mm lång). Beroende på vävnadsprov storlek, skär ett totalt belopp av ventrikulär hjärtmuskeln mellan 100 mg och 1 g för varje isolering.
  5. Efter avslutad vävnads malning, överföra myocardial bitar i rötningsanordningen, med ren iskall CP-lösning. Undvik att fylla hela volymen mellan de två kisel borstar (3-4 ml) med hjärt bitar, med hjälp av mer än 1 g totalt vävnad.

3. Tvättning och matsmältning av Myocardial bitar

  1. After de bitar överförs till skrapkammaren i matsmältningen enhet ändrar CP buffert i kammaren med kallt Ca2 +-fri dissociation buffert (DB).
  2. Placera digestion anordning i ett termostatiskt bad, för att i kammaren för att vara i kontakt med det uppvärmda vattnet i badet (Figur 1). Ställ badet till 37,5 ° C och slår på den, för att långsamt höja temperaturen hos den vävnad kammaren. Sätt på motorn hos sönderdelningsanordning, inställning av rotationshastigheten till ett varv / sekund.
  3. Utför 3 tvättcykler med DB, ändra lösningen i kammaren med ren DB var 8 min. DB värms (37 ° C) och syre mättat före komma i kontakt med hjärt bitar.
  4. Förbered enzymbuffert 1 (EB1) genom tillsats av 250 U / ml kollagenas typ V och 4 U / ml Protease Type XXIV till DB-lösning. Förbered enzymbuffert 2 (EB2) genom att lägga till 250 U / ml kollagenas typ V till DB-lösning. Värm upp (37 ° C) och oxygenate EB1 och EB2.
  5. Utför två 12 min cykler av digestion i den roterande sönderdelningsanordning med 100% syresatt EB1 (vid 37 ° C). Vid varje cykel, använd ~ 3 ml EB1. Ta av lösningen med pipett aspiration och kasta den efter varje cykel.
  6. Förbered sex 15 ml rör för uppsamling cell och ~ 80 ml kall (4 ° C) KB lösning för eluering av de buffertar.
  7. Utför en första 15 min digestion cykel med 3 ml 100% syresatt EB2 vid 37 ° C. Efter rötning cykeln, samla lösningen innehållande de första dissocierade myocyterna i ett 15 ml rör och späd cellsuspensionen med 12 ml kall KB lösning. Förvara röret platt vid rumstemperatur.
  8. Späd den återstående EB2 lösningen med en lika stor mängd av BF, för att halvera koncentrationen av kollagenas V för följande uppslutnings cykler.
  9. Utför andra 5 12 min uppslutnings cykler med 3 ml EB2 vid 37 ° C; efter varje av dem samlar på myocyt innehåller buffert i ett 15 ml koniskt rör ochspäda ut det med 12 ml KB lösning. Lagra de sex cell innehållande rör vid rumstemperatur under 30 min.

4. Cell resuspension och Ca 2 + Omställning

  1. Lägg 1 mg / ml bovint serumalbumin (BSA) till 20 ml av Ca2 +-fri Tyrodes buffert (TB). Filtrera lösningen.
  2. Centrifugera sex myocyt innehållande koniska rör vid 100 x g under 5 min för att tvinga myocyter sedimentera. Avlägsna supernatanten och suspendera cellerna i varje rör med en varierande mängd (1-3 ml, beroende på avkastningen) BSA innehåller TB vid RT.
  3. Öka gradvis Ca2 +-koncentrationen i cellen innehållande buffert genom tillsats av små alikvoter av 100 mmol / l CaCl2-lösning. I de första och andra stegen Ca2 +-koncentrationen höjes upp till 50 | j, mol / l och 100 | amol / l, respektive. Följande Ca 2 + tillsatssteg utförs varje 5 min och koncentrationen höjs med 100 mikromol / L vid varje steg to en slutlig koncentration av 0,9 mmol / L.
  4. Bedöm utbytet av isoleringsförfarandet. Överför 0,5 ml av myocyt lösningen på glaset botten kammare av ett mikroskop. Utvärdera 15 fält mikroskop vid 10x objektivförstoring och beräkna andelen friska myocyter (t.ex. stavformade celler med tydliga strimmor och inga betydande inneslutningar, figur 2). Den förväntade avkastningen är cirka 20%.

5. Funktionell utvärdering av isolerat Cardiomyocytes.

Följande protokoll är ett exempel på mänsklig cardiomyocyte funktionell bedömning inklusive samtidiga inspelningar av aktionspotentialer och intracellulära Ca2 +-flöden.

  1. Förbered pipett lösning (PS) för patch clamp experiment i perforerad lapp konfiguration. Lösningen kan lagras vid -20 ° C i upp till 3 månader.
  2. Lägg till 1,8 mmol / l CaCl2 till Ca2 +-fri Tyrodes buffert (TB). Use denna lösning för superfusion av hjärtmuskelceller under patch clamp / fluorescensexperiment.
  3. Överför 1 ml av cellsuspension till ett 1,5 ml rör och tillsätt 10 | amol / l Fluoforte och 10 | il kraftdrivladdning Concentrate. Inkubera under 30 min vid rumstemperatur. Efteråt satt röret i vertikalt läge och lämna cellen sedimentera under 5 min; suspendera cellerna i Ca2 + innehåller TB.
  4. Överför 0,25 ml cellsuspension till en liten (0,5 ml), monterad temperaturstyrd mikroskop inspelning kammaren superfuseras genom gravitation med en uppvärmd microperfusor systemet vid en flödeshastighet av 0,3 ml / min (temperatur: 37 ± 0,5 ° C).
  5. Med användning av en mikropipett avdragare, förbereda patch clamp-pipetter med en spetsdiameter av 3-5 | im och en resistans av 3-4,5 M när den är fylld med PS.
  6. Lägg amfotericin B till en sats av PS (250 | ig / ml) och använda det för att fylla på elektroderna.
  7. Välj en stavformad cell med tydliga strimmor, saknar inneslutningar, form giga tätning och vänta 5-10 minuter, tills åtkomst motstånd sjunker under 20 Mohm.
  8. Framkalla aktionspotentialer i strömtång läge med korta pulser (<3 ms) vid olika frekvenser av stimulering (0.2 Hz, 0,5 Hz och 1 Hz, 1 min på varje frekvens). Under inspelningsfasen, slå på ljusa fält belysning vid 492 ± 3 nm och upptäcka Fluoforte fluorescens vid 505-520 nm. Förvärva fluorescens och membranpotential signaler med hjälp Digidata 1440A och pCLAMP 10,0 programvara. Upprepa inspelningen sekvensen flera gånger om det behövs; dock hålla den totala inspelningstiden under 15 min för varje cell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den ovan beskrivna metoden användes för att karaktärisera de funktionella abnormaliteter hos kardiomyocyter isolerade från kammarskiljeväggen av patienter med hypertrofisk kardiomyopati (HCM), som genomgick myectomy drift, jämfört med icke sönderfallande icke hypertrofiska kirurgiska patienter 21. Resultaten i detta avsnitt härrör från detta arbete 21 och visas här som ett exempel på hur denna teknik kan användas för att karakterisera förändringar i hjärtmuskelcellernas funktion i hjärt sjukdomstillstånd.

Ett representativt kirurgiska prov från en patient med HCM visas i figur 2A. Kirurgiska prover var mycket varierande när det gäller storlek och tjocklek endokardiala fibrösa ränder. Mängden av hjärtmuskelvävnad som vi använde för varje isoleringsförfarande från HCM prover var omkring 1g. Istället mängden vävnad som används för kontrollprover var mindre (100-500 mg.), Till följd av Lower vävnad tillgänglighet. Utbytet var signifikant högre när kontrollproven bearbetades med avseende på HCM, förmodligen eftersom den relativa mängden viabla myokardiala celler i vävnaden är reducerad i HCM myokardiet och endomyokardiell fibros ökas 22. Från dessa observationer drog vi slutsatsen att den önskade mängden vävnad för att erhålla viabla celler kan vara variabel beroende på frånvaron eller närvaron av myokardiell sjukdom.

Prover skars i små bitar såsom visas i figur 2B. Efteråt gjordes bitarna överförs in i kammaren av rötningsanordning (figur 2C) och användes för enkelcellisolering såsom beskrivits ovan (figur 2D). Representativa mikrofotografier av en cellsuspension som erhållits med användning av den beskrivna cellisoleringsförfarande från en skiljeväggen mellan kamrarna prov visas i fig. 3A och 3B; förstorade bilder av enstaka kammar cardiomyocytes avbildas i figurerna 3C-3F. Cardiomyocytes från HCM prover användes för samtidiga inspelningar av aktionspotentialer och intracellulära Ca2 +-varianter som beskrivs i protokollet avsnittet. Representativa samtidiga spår som visar membranspänning (ovan) och intracellulär Ca 2 + (nedan) under stimulering vid tre olika frekvenser visas i figur 4: dessa spår registrerades från en enda cardiomyocyte isolerats från ett HCM prov.

Resultat av patch clamp studier visade att aktionspotentialens duration (APD) som noterats vid olika frekvenser av stimulering var märkbart förlängd hos hjärtmuskelceller från patienter med HCM (HCM cardiomyocytes) jämfört med kontroller (Figur 5A och 5B). För att säkerställa underhållet av fysiologiska reaktioner i isolerade myocyter, vi testade effekterna av isoproterenol, som används vid 10 - 7 M (Figur 5C): β-adrenergiska stimulering producerade den förväntade AP förkortning i kontroll muskelceller. Eftersom långvarig APD leder till ökad risk för tidigt efter depolarisations (EADS) 23, förekomsten av europeiska bedömningsdokument, detekteras som spontana depolarisations under platåfasen av AP, uppmättes. I HCM cardiomyocytes, bedömningsdokument var signifikant vanligare jämfört med kontroller (Figur 5D). Representativa spår visar flera bedömningsdokument visas i fig. 5E

För att testa om längre APD och jon aktuella avvikelser kan påverka excitation-kontraktion kopplingsmekanismer i HCM kardiomyocyter, var egenskaperna hos intracellulära Ca2 + variationer utvärderas under stimulering. Amplituden för Ca 2 + transienter evoked i ström-clamp förhållandena liknade i HCM jämfört med kontroll kardiomyocyter (figur 6A). Omvänt kinetiken av Ca2 + övergående, var signifikant längre i HCM (Figur6B). Dessutom intracellulär diastoliskt Ca2 +-koncentrationen var markant högre i HCM jämfört med kontroll kardiomyocyter (figur 6C) och ökade mer framträdande vid ökning av stimuleringsfrekvensen.

Noterbart kardiomyocyter isolerade med denna metod från humana kammarprov har också med framgång använts för andra program, inklusive spänning-clamp inspelningar av specifika trans strömmar (Figur 7A), intracellulär Ca2 + och / eller cell förkorta inspelningar under elfältstimulering (Figur 7B) och bedömning av den fina strukturen av sarcolemma hjälp av konfokalmikroskopi och membranbundna fluorescerande markörer (figur 7C).

Figur 1 Figur 1. Flödesschema för cellisolering förfarandet.

Figur 2
Figur 2. Bearbetning av ventrikulära prover för cellisolering. (A) representant bild som visar ett prov av ventrikulär hjärtmuskeln från en patient med HCM, som genomgick septal myectomy drift. Kalibrerings bar = 5mm. (B) Bitar av ventrikulär vävnad skära från en kammar kirurgiska exemplar, som skall användas för cellisolering. Kalibrerings bar = 5mm. (C) Bilder av rötningsanordningen. Anordningen innefattar en rötkammare med två kisel borstar: den överlägsna borsten kan rotera när den förflyttas av en motor (D) Bild som visar sönderdelningsanordning i den termostatreglerade badet under enzymatisk nedbrytning av ventrikulär vävnad.. p>

Figur 3
Figur 3. Isolerade mänskliga ventricular cardiomyocytes. (AB) Panelen visar mikrofotografier av två mikroskopfält (10x objektiv) visar representativa cardiomyocyte suspensioner. Notera, om 30% av cellerna är stavformad och uppvisar tydliga strimmor. Kalibrerings bar = 100 ìm. (CE) Representativa bilder av 3 mänskliga hjärtmuskelceller som isolerats från ett prov av en HCM patient (40x mål). Kalibrerings bar = 20 mikroM. (F) Bild som visar en mänsklig ventricular cardiomyocytes berörda vid spetsen av plåstret pipetten för inspelningar. Kalibrerings bar = 20 pm.

es.jpg "src =" / files/ftp_upload/51116/51116fig4.jpg "/>
Figur 4. Samtidig inspelning av membranpotentialen och intracellulärt kalcium. Representativa spår som visar membranpotential (ovan) och intracellulärt kalcium (nedan) som tagits från en enda myocyt isoleras från en HCM provet. Den myocyt stimuleras via plåstret pipetten vid 0,2 Hz, 0,5 Hz och 1 Hz.

Figur 5
Figur 5. Ändringar av aktionspotentialer i ventrikulära hjärtmuskelceller från HCM prover. (A) representant lagrade aktionspotentialer framkallade vid 0,2 Hz, 0,5 Hz och 1 Hz från en kontroll myocyt (vänster, grå spår) och HCM myocyt (höger, svarta spår ). (B) Genomsnittlig durationen av aktionspotentialen på 90% repolarisering (APD90%) i HCM (n = 81) ochkontroll kardiomyocyter (n = 29) vid de tre stimuleringsfrekvenser som testades. (C) Förekomst av bedömningsdokument i kardiomyocyter från HCM-patienter och kontrollprov. (D) Inspeglad aktionspotentialer vid 0,5 Hz från en styr myocyt i frånvaro (kontinuerlig linje) och i närvaro av 10 -7 M isoproterenol. (E) Representant spår som visar membranpotential av en cardiomyocyte från en HCM patienten uppvisar flera spontana depolarisationer inträffar under platåfasen (tidigt efter depolarisationer, bedömningsdokument), som är markerade med pilar. Stimuli är markerade med nedan spår korta rader. ** = P <0,01 oparat t-test. Alla paneler i figuren är modifierade med tillstånd från Coppini et al. 2012 21.

Figur 6
Figur6. Förändringar av kalcium transienter i ventrikulära hjärtmuskelceller från HCM prover. (A) representant lagrade kalcium transienter framkallade under stimulering vid 0,2 Hz via plåstret pipetten i en kontroll myocyt (grå) och en HCM-cell (svart). Särskilt inte amplituden av Ca 2 + transienter inte skiljer sig mellan de två celler (B) kinetik Ca 2 + transienter i HCM (n = 42) och kontroll (n = 24) cardiomyocytes:. Tid från stimulans till topp gående (TP ), tid från topp till 50% förfall (T50%) och tid från topp till 90% förfall av övergående (T90%) visas. (C) Representativa långa spår som visar intracellulär Ca2 + under stimulering vid 3 olika frekvenser i HCM och kontroll myocyter, belyser den ökade diastoliska Ca2 + vid höga stimuleringsfrekvenser i HCM myocyt. (D) Genomsnittlig diastoliskt Ca2 + i HCM (n = 42) och kontroll (n = 24) cardiomyocytes på 3 olika stimulerings rates. ** = P <0,01 oparat t-test. Alla paneler i figuren är modifierade med tillstånd från Coppini et al. 2012 21.

Figur 7
.. Figur 7 Ytterligare experimentella applikationer som använder humana ventrikulära myocyter (A) Vänster: representant lagrade spår som visar L-typ Ca2 + ström registreras under spänning klämma på olika membranspänningar med ett särskilt protokoll (se 21 för detaljer). Höger: genomsnittlig L-typ Ca2 + strömtopp tätheten från 18 celler som isolerats från HCM prover på olika membran. Spänningar. (B) intracellulära Ca2 + spåra inspelad från en kammar myocyt under elfältstimulering vid 1 Hz. (C) Confocal bild av en kammar cardiomyocyte från ett HCM prov färgades med en fluorescerande membranbundet färgämne (di-3-ANEPPDHQ). Att notera, är tätheten av ttubules låg, vilket tyder på morfologisk membran ombyggnad i HCM.

Figur 8
Figur 8. Rötnings enhet. (AB) Komponenter för matsmältningen anordningen. En variabel hastighet roterande motor är ansluten till en första plast arm, vilken är ansluten till en andra. Det andra plastarmen är avtagbart och ansluten till den övre borsten. Borstar görs med silikon elastomer. En PTFE negativ form, med 100 hål placerade ~ 1,5 mm användes för att gjuta borstarna från flytande silikon. Det inre utrymmet hos formen har 1,9 cm i diameter och är 6 mm tjock, som producerar borstar av samma storlek. Hålen är belägna på en sida av formen görs för att producera 8 mm långa borst när borstarnagjuts och avlägsnas från formen. Efter det att flytande silikon sätts in i formen, är åtminstone 48 h krävs för fullständig härdning. Borstar är monterade inuti ett glasrör (innerdiameter = 2 cm, tjocklek 2 mm) och den cylindriska kammaren som bildas av de två borstar och glasväggarna är hermetiskt tillsluten med hjälp av två O-ringar. Borstar måste skjutas ett till den andra; botten ett är limmad på en plastbas, medan den övre en limmas plast änden av motorarmen och sålunda är i stånd att rotera. (C) Förstorad vyer av den övre borsten. Notera, måste borsten som skall limmas på änden av motorarmen för att det för att rotera (D) Komponenterna i kammaren visas i sitt slutliga läge. Utrymmet mellan de två borstar (själva kammaren) är ~ 2 cm bred och 7-8 mm hög; detta utrymme passar lätt 3-4 ml buffert, andra än upp till 1 g av myocardial vävnad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har beskrivit och validerat en metod för att isolera viabla myocyter från kirurgiska prover av humant ventrikulärt myokardium. Med utgångspunkt från tidigare beskrivna protokoll som framgångsrikt hade använts till isolerade celler från förmaks kirurgiska prover, tekniken för att möjliggöra separation av enskilda livskraftiga myocyter från sjuka ventrikulär hjärtmuskeln utvecklades och finjusteras. Tidiga rapporter visade att isolering av enstaka hjärtmuskelceller från bitar av förmaks-och kammarvävnad selektivt nedsatt repolarizing kaliumströmmar, vilket resulterar i förändrade elektrofysiologiska egenskaper och reaktioner på fysiologiska stimuli 8,24, medan leverans av enzymet som innehåller buffert via koronarperfusionstrycket inte försämra fördröjd likriktare strömmar i isolera celler 25. Olyckligtvis kan isolering av humana ventrikulära myocyter från kirurgiska preparat av ventrikulär hjärtmuskeln inte utföras av koronarperfusionstrycket eftersom integriteten av koronara grenarförloras, i strid med explanterade hjärtan. Cardiomyocytes isolerade från hjärt bitar med hjälp av vår metod att visa en tydlig anpassning av durationen av aktionspotentialen som svar på förändringar i stimuleringsfrekvens eller β adrenerg stimulering. För att sådana svar att uppstå, är integriteten fördröjda likriktarkaliumkanaler krävs 26-28, tyder den allmänna integriteten hos dessa kanaler inte försämras genom vår isoleringsmetoden. Dessutom celler som isolerats med våra metoder visar inte bara vanliga elektrofysiologiska reaktioner (figur 3 och 4), men också visa kalcium transienter i den förväntade formen och längd (figur 3 och 5) och regelbundna sarkomeriskt organisation (figur 2) och förkorta egenskaper (inte visade), vilket antyder att den övergripande strukturella integriteten av de celler bevaras genom detta isoleringsförfarande. Den viktigaste utvecklingen av denna metod än tidigaretekniker ges av nykonstruerade sönderdelningsanordning, som levererar försiktig mekanisk omrörning av vävnadsstycken, så att enkelcellseparation utan alltför stor skada. Dessutom är användningen av uppslutningsanordningen tillät oss att använda en lägre koncentration av enzymer i cellisoleringsbuffert; särskilt vi använder en mycket lägre koncentration av icke-selektiv proteas i jämförelse med tidigare rapporterade metoder 24. Enheten är skräddarsydd i vårt laboratorium: byggnads scheman presenteras i Figur 8.

Den enkla konstruktionen och struktur gör det mycket enkelt att replikera för ett framgångsrikt resultat av detta protokoll. Legenden till Figur 8 beskriver också de förfaranden som krävs för att producera silikon penslar och bygga skrapkammaren. På grund av de fördelar med sönderdelningsanordning kan ett relativt stort antal viabla celler erhållas från en relativt liten mängd av ventrikulär vävnad (så lite som 100 mg).En tidigare publicerad metod 19 visades för att ge en kalcium toleranta myocyter från små biopsier (även <20 mg). Men den redovisade myocyt avkastningen var mycket låg och författarna inte visa om celler som isolerats med den metoden var möjligt för karakterisering av intracellulär kalcium cykling och kontraktila funktion. Denna teknik är potentiellt tillämplig på många kirurgiska patienter, eftersom små delar av kammarskiljeväggen ofta skärs under ventilersättningsförfaranden (t ex. Aortaklaffen ersättning). Men den avgörande punkten för att få en lyckad isolering en snabb inledandet av förfarandet efter provtagning från operationssalen. Därför krävs det för cellen laboratorium att vara i omedelbar närhet till hjärtkirurgi klinik, för att denna teknik för att vara givande. Dessutom är en riktig enzymaktivitet också oerhört viktigt för en lyckad isolering. Eftersom den icke-selektiv proteasaktivitet of varje kollagenas parti är oftast inte helt testad, kommer sannolikt att göra annorlunda under cellisolering varje parti. Det är därför viktigt att finjustera den slutliga koncentrationen av kollagenas för att uppnå bästa resultat. Vi föreslår att observera cellsuspension under mikroskop vid varje cykel, för att vara säker på att levande celler börjar visas på cykel 3 Tidig utseende celler tyder driven enzymaktivitet och uppmanar till minskad enzymkoncentration.; uppkomsten av celler efter cykel 3 föreslår otillräckliga enzymaktivitet. Enligt vår erfarenhet är detta det mest effektiva indikator på den korrekta enzymkoncentrationen.

Vi har framgångsrikt använt denna metod för att få enskilda hjärtmuskelceller från den interventrikulära septum av HCM patienter med vänsterkammarutflödet obstruktion genomgår kirurgisk septal myectomy, såväl som från icke-misslyckas icke-hypertrofiska kirurgiska patienter 21. Resultat från det pappervisar att myocyter isolerade med denna metod kan användas för fullständig elektro utvärdering med patch clamp teknik samtidigt utvärdera EG-Coupling avvikelser, genom att spela in intracellulära kalcium dynamik med fluorescerande färger. Inspelningsförfarandet beskrivs här tillät oss att samla flera fysiologiska cellparametrar med en enda inspelning från varje cell, vilket ger en stor mängd data med ett begränsat antal celler och prover. Tack vare dessa fördelar, denna metod har med framgång använts för att karakterisera de specifika funktionella avvikelser i ventrikulära hjärtmuskelceller från HCM patienter, jämfört med icke-hypertrofiska patienter 21. Avvikelser i jonströmmar och durationen av aktionspotentialen samt kinetiska anomalier od intracellulär Ca2 + cykling tydligt identifierade med hjälp av denna teknik, med hög reproducerbarhet. Dessutom har vi visat att behandling med en selektiv hämmare av sent Na * vs. placebo hos patienter med HCM 29, som för närvarande pågår.

Human hjärt exemplar tillgången är relativt blygsam, även i specialiserade centrum, och detta kan begränsa en bred tillämpning av denna teknik. Ändå är kvaliteten på den information som kan erhållas direkt från patientprover på sjukdomsrelaterade förändringar i cardiomyocyte funktion som är jämförbar med den som kan uppnås från djurmodeller av HCM och andra hjärtsjukdomar. Givet de omfattande skillnaderna mellanfysiologi av humana och murina hjärtmyocyter, kan data från funktionell utvärdering av mänskliga myocyter vara mycket värdefullt. Som Sammanfattningsvis tror vi att framtida tillämpningar av denna teknik väsentligt kan bidra till kunskapen om hjärtsjukdomar, eftersom våra protokoll ger möjlighet att göra en fullständig uppsättning av funktionella bedömningar direkt på celler från patientprover med omedelbar translationell värde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av EU (STREP Project 241.577 "STORT HJÄRTA," 7: e europeiska ramprogrammet, CP), Menarini International Operations Luxembourg (AM), Telethon GGP07133 (CP) och Gilead Sciences (AM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791
Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4*7H2O) Sigma-Aldrich M1880
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Adenosine Sigma-Aldrich A9251
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270
Mannitol Sigma-Aldrich M4125
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Potassium hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich P5958
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S7907
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S6297
Potassium bicarbonate (KHCO3) Sigma-Aldrich 237205
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256
2,3-Butanedione monoxime Sigma-Aldrich B0753
Sodium hydroxide(NaOH) Sigma-Aldrich S8045
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate Sigma-Aldrich 49601
Pyruvic acid Sigma-Aldrich 107360
3-Hydroxybutyric acid Sigma-Aldrich 166898
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP) Sigma-Aldrich A8937
Creatine Sigma-Aldrich C0780
Succinic Acid Sigma-Aldrich S3674
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E0396
Albumin from bovine serum Sigma-Aldrich A0281
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V Sigma-Aldrich C9263
Proteinase, Bacterial, Type XXIV Sigma-Aldrich P8038
Calcium chloride solution, ~1 M in H2O Sigma-Aldrich 21115
Calcium chloride 0.1 M solution Sigma-Aldrich 53704
Potassium methanesulfonate Sigma-Aldrich 83000
FluoForte Reagent Enzo Life Sciences ENZ-52015
Powerload concentrate, 100X Life Technologies P10020
Perfusion Fast-Step System Warner Instruments VC-77SP
Amphotericin B solubilized Sigma-Aldrich A9528
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier Molecular Devices
Digidata 1440A Molecular Devices
pClamp10.0  Molecular Devices
Digestion Device CUSTOM CUSTOM The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Figure 1C-1D and in Figure7. We can provide further details if requested.
Silicone elastomer for the digestion device's brushes Dow Corning SYLGARD® 184
Variable speed rotating motor for the digestion device Crouzet Crouzet 178-4765
Mold for brushes casting N.A. N.A. The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. I. Preparation of adult myocytes and their homology with the intact tissue. Cardiovascular Research. 15, 483-514 (1981).
  2. Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. II. Functional aspects of mature cells. Cardiovascular Research. 15, 549-579 (1981).
  3. Harding, S. E., et al. Species dependence of contraction velocity in single isolated cardiac myocytes. Cardioscience. 1, 49-53 (1990).
  4. Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart. Canadian Medical Association Journal. 126, 791-793 (1982).
  5. Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Characteristics of calcium-current in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 23, 929-937 (1991).
  6. Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
  7. Cohen, N. M., Lederer, W. J. Calcium current in single human cardiac myocytes. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 4, 422-437 (1993).
  8. Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Alterations of K+ currents in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation Research. 73, 379-385 (1993).
  9. Virag, L., et al. The slow component of the delayed rectifier potassium current in undiseased human ventricular myocytes. Cardiovascular Research. 49, 790-797 (2001).
  10. Nanasi, P. P., Varro, A., Lathrop, D. A. Isolation of human ventricular and atrial cardiomyocytes: technical note. Cardioscience. 4, 111-116 (1993).
  11. Benitah, J. P., et al. Slow inward current in single cells isolated from adult human ventricles. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 421, 176-187 (1992).
  12. Verkerk, A. O., et al. Ionic mechanism of delayed afterdepolarizations in ventricular cells isolated from human end-stage failing hearts. Circulation. 104, 2728-2733 (2001).
  13. Cerbai, E., et al. Characterization of the hyperpolarization-activated current, I(f), in ventricular myocytes from human failing heart. Circulation. 95, 568-571 (1997).
  14. Kohncke, C., et al. Isolation and kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).
  15. Tomaselli, G. F., Marban, E. Electrophysiological remodeling in hypertrophy and heart failure. Cardiovascular Research. 42, 270-283 (1999).
  16. Maron, B. J. Hypertrophic cardiomyopathy: a systematic review. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 287, 1308-1320 (2002).
  17. Olivotto, I., et al. The many faces of hypertrophic cardiomyopathy: from developmental biology to clinical practice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 349-367 (2009).
  18. Maron, M. S., et al. Hypertrophic cardiomyopathy is predominantly a disease of left ventricular outflow tract obstruction. Circulation. 114, 2232-2239 (2006).
  19. Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
  20. Lippiat, J. D. Whole-cell recording using the perforated patch clamp technique. Methods Mol Biol. 491, 141-149 (2008).
  21. Coppini, R., et al. Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 127, 575-584 (2013).
  22. Kuusisto, J., et al. Low-grade inflammation and the phenotypic expression of myocardial fibrosis in hypertrophic cardiomyopathy. Heart. 98, 1007-1013 (2012).
  23. Yan, G. X., et al. Phase 2 early afterdepolarization as a trigger of polymorphic ventricular tachycardia in acquired long-QT syndrome : direct evidence from intracellular recordings in the intact left ventricular wall. Circulation. 103, 2851-2856 (2001).
  24. Yue, L., Feng, J., Li, G. R., Nattel, S. Transient outward and delayed rectifier currents in canine atrium: properties and role of isolation methods. The American Journal of Physiology. 270, 2157-2168 (1996).
  25. Li, G. R., Feng, J., Yue, L., Carrier, M., Nattel, S. Evidence for two components of delayed rectifier K+ current in human ventricular myocytes. Circulation research. 78, 689-696 (1996).
  26. Viswanathan, P. C., Shaw, R. M., Rudy, Y. Effects of IKr and IKs heterogeneity on action potential duration and its rate dependence: a simulation study. Circulation. 99, 2466-2474 (1999).
  27. Volders, P. G., et al. Probing the contribution of IKs to canine ventricular repolarization: key role for beta-adrenergic receptor stimulation. Circulation. 107, 2753-2760 (2003).
  28. Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K., Scott, A., Siegl, P. K. Isoproterenol antagonizes prolongation of refractory period by the class III antiarrhythmic agent E-4031 in guinea pig myocytes. Mechanism of action. Circulation Research. 68, 77-84 (1991).
  29. Coppini, R., et al. A translational approach to treatment of hypertrophic cardiomyopathy: pre-clinical rationale and design of a prospective randomized pilot trial with ranolazine. Circulation. 125, 1 (2012).

Tags

Medicin kardiologi hjärt-celler elektrofysiologi excitation-kontraktion koppling aktionspotential kalcium hjärtmuskeln hypertrofisk kardiomyopati hjärtpatienter hjärtsjukdomar
Isolering och funktionell karakterisering av Human Ventrikulär Cardiomyocytes från Fresh Kirurgiska prover
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Coppini, R., Ferrantini, C., Aiazzi, … More

Coppini, R., Ferrantini, C., Aiazzi, A., Mazzoni, L., Sartiani, L., Mugelli, A., Poggesi, C., Cerbai, E. Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples. J. Vis. Exp. (86), e51116, doi:10.3791/51116 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter