Metoden förklarar hur att bygga och driva en kontinuerlig 13 C och 15 N isotopmärkning kammare för enhetlig eller differentiell växtvävnad märkning. Representativa resultat från metaboliska och strukturell märkning av Andropogon gerardii diskuteras.
Spåra sällsynta stabila isotoper från växtmaterial genom ekosystemet ger den mest känsliga informationen om ekosystemprocesser, från CO 2-flöden och organiskt material i marken bildas till småskalig stabil-isotop biomarkör sondering. Koppling flera stabila isotoper, såsom 13C med 15 N, 18 O eller 2 H har potential att avslöja ännu mer om komplexa stökiometriska förhållanden under biogeokemiska transformationer. Isotop märkt växtmaterial har använts i olika studier av kullen nedbrytning och markens organiska material bildas 1-4. Från dessa och andra studier har det dock visat sig att strukturella komponenter i växtmaterial beter sig annorlunda än metabola komponenter (dvs.. Lakbara lågmolekylära föreningar) i form av mikrobiell användning och långsiktig lagring av koldioxid 5-7. Möjligheten att studera strukturella och metabola komponenterför sig ger ett kraftfullt nytt verktyg för att främja spetsen för ekosystem biogeokemiska studier. Här beskriver vi en metod för framställning av 13 C och 15 N märkt växtmaterial som är antingen likformigt märkt hela växten eller differentiellt märkta i strukturella och metaboliska växtkomponenter.
Här presenterar vi byggande och drift av en kontinuerlig 13 C och 15 N märkning kammare som kan ändras för att möta olika forskningsbehov. Enhetligt märkt växtmaterial är producerad av kontinuerlig märkning från planta till skörd, medan differentiell märkning uppnås genom att ta bort de växande plantor från kammar veckor före skörd. Representativa resultat från växande Andropogon gerardii Kaw demonstrera systemets förmåga att effektivt etikett växtmaterial på de riktade nivåer. Genom denna metod har vi producerat växtmaterialet med en 4,4 atom-% 13 C och 6,7 atom-% 15 </ Sup> N enhetlig växt etikett eller material som differentiellt är märkt med upp till 1,29 atom% 13 C och 0,56 atom% 15 N i sin metabola och strukturella komponenter (varmvatten extraherbara och varmvatten rest komponenter, respektive). Utmaningarna ligger i att upprätthålla rätt temperatur, fuktighet, CO2-koncentrationen, och ljusnivåer i en lufttät 13 C-CO 2 atmosfär för framgångsrik växtodling. Denna kammare beskrivning utgör ett användbart forskningsverktyg för att effektivt producera jämnt eller differentiellt multiisotopmärkt växtmaterial för att användas i försök på ekosystemet biogeokemiska cykling.
Att förstå dynamiken i växt-mark-atmosfär processer är avgörande för exakt förutspå hur den globala kol (C) och kväve (N) cykler fungerar under nuvarande och framtida miljöförhållanden. Stabila isotoper är kraftfulla verktyg i kvantitativa studier av växt-jord-atmosfären C och N cykling. Spåra sällsynta stabila isotoper från växtmaterial genom ekosystemet tillhandahåller känslig information i studier av biogeokemiska cykler, från CO 2-flöden och organiskt material i marken bildas till småskaliga stabil-isotop biomarkör sondering t.ex. 4,8,9. Kombinera 13 C märkning med 15 N märkning, eller andra stabila isotoper såsom 2 H eller 18 O i växtvävnad ger en hög upptäckt, spårbart, men ändå komplext substrat för användning i kopplade studier av växt-och jord biokemi. Förmågan att enhetligt eller differentiellt märka strukturella och metabola växtmaterial annonsds ytterligare förmåga att ta upp komplexa frågor om C och N cykling genom ekosystem. Fördelen med användning av isotopmärkt växtmaterial i kvantitativa studier av C och N redovisning, beror emellertid på förmågan att producera 13 C och 15 N märkt material som är antingen likformigt eller differentiellt märkta.
Isotop märkningen har använts i studier som tar upp växt C och N assimilering 10, fördelning 11 och rhizodeposition 12. Enhetligt 13 C och 15 N märkt växtmaterial ger en komplex märkt substrat för studier av strö nedbrytning 1,4, organiskt material i marken bildning 2,6, mark CO 2-utsläpp 4, jordnäringsväven Studier 13, samt studier av mark C tider bosättning 2,14. Studier som använder 13 C märkt biochar från märkt växtmaterial börjar också avslöja ny information om tidigare förbiseddjord röding pooler 15. Medan 15 N, 2 H, och 18 O märkning är relativt lätt att uppnå genom vatten och gödnings behandling existerar utmaningen i att producera likformigt 13 C-märkt växtmaterial genom 13 C-CO 2 fixering.
Kontinuerlig isotopmärkning från planta till mognad i en förseglad kammare producerar enhetlig isotopmärkning i hela anläggningen. Andra metoder, såsom upprepad pulsmärkning 16 och bladapplicering eller wicking 17,18 producerar inte likformigt isotop märkt växtmaterial eller tydlig avvikelsen märkning av särskilda C-föreningar (t.ex. metabolisk kontra strukturell) 19. En viktig fråga vid isotopmärkning märkning effektivitet, på grund av den höga kostnaden för sällsynta isotop anrikade föreningar som används i märkningen. Även om kontinuerlig 13 C märkning har använts i det förflutna 2-4,20, det finns inte så vitt vi veten publicerad detaljerad teknisk beskrivning av en kontinuerlig märkning kammare med tecken på hög märkningseffektivitet och noggrann kontroll av mängden och enhetlighet isotopmärkning.
I spetsen för kullen nedbrytning och markens organiska material bildas forskning är konceptet att metabola växtmaterial (dvs. lakbara, labila, lågmolekylära föreningar) och struktur växtmaterial (dvs.. Lignin, cellulosa, hemicellulosa) behandlas olika vad gäller mikrobiell Använd effektivitet, markens organiska material bildning, och på lång sikt mark C förvaring 5-7. Växtmaterial som differentiellt är märkt i sina strukturella och metabola komponenter, alltså, är ett användbart verktyg för att föra strö nedbrytning och markens organiska material bildas forskning. Differential märkning med dubbla isotoper möjliggör spårning av strukturella och metabola komponenter separat genom ekosystemet med en gren pool isotop technique 21.
Kontinuerlig isotopmärkning med 13 C och andra isotoper i en förseglad kammare kräver noggrann uppmärksamhet för att plantera fysiologiska betingelser för att maximera anläggningens produktivitet och isotopmärkningseffektiviteten. Dagtid temperaturtoppar måste kontrolleras för att förhindra växtskador när växer i en lufttät kammare. Ett optimalt utbud av fukt och temperatur krävs för att bibehålla öppna växt klyvöppningar och CO2 upptag 22. Hög luftfuktighet orsaka imma på kammarens väggar, vilket minimerar ljus tillgänglighet och kan skada kammarstrukturen. Noggrant övervägande och isotop effektivitetsmärkning genom att eliminera naturliga överflöd isotoper från kammaren (till exempel kommer från ingjutning med organiskt material i marken) och förhindra exponering för extern luft är viktigt när man arbetar med dyra tung-isotopmärkta föreningar.
Här presenterar vi en metod för att bygga och driva enkontinuerlig dubbel 13 C och 15 N isotopmärkning kammare för produktion av växtmaterial som är antingen jämnt märkta eller har sina strukturella och metabola komponenter märkta på olika nivåer. 13 C märkning styrs på kammarnivå, medan gödsling och 15 N märkningen är kontrolleras på individ potten nivå. Representativa resultat visas för att demonstrera förmågan hos denna metod för att styra temperatur, fuktighet, och CO2-koncentrationen under hela växtsäsongen. Resultat från växande Andropogon gerardii, Kaw visar också denna metod förmåga att producera jämnt eller differentiellt märkta växtmaterial. Den specifika kammar utformning och drift system beskrivs kan modifieras för att odla olika växtarter, samt att rymma 2 H eller 18 O-märkning.
Denna design för en kontinuerlig isotopmärkning kammare användes för att producera likformigt och differentiellt 13 C och 15 N märkt A. gerardii för efterföljande fält-och laboratorieexperiment. Under tre växtsäsonger i drift, har kammaren lyckats fortsätta temperatur, luftfuktighet och CO 2-koncentrationer inom de inställda parametrarna (Figur 2). Tillförlitligheten i temperatursystemet är kritisk under toppen av sommaren när höga solstrålning kan leda till överhettning i lufttäta kammare. Eliminera överflödig fukt som orsakas av transpiration från de växande plantorna ser till att anläggningen klyvöppningar förbli öppen för foto upptag 22 och att kondens inte hämmar ljuspenetrering eller skada strukturen i kammaren.
Den nära kontinuerlig övervakning av CO 2-koncentration av irgA mjukvaran underhålls kontinuerligt13 C-märkning av plantorna medan de växte i kammaren. På grund av den höga fotosyntetisk aktivitet hos A. gerardii växer i denna kammare, har CO2 in i systemet ofta i dagsljus i toppen växtsäsongen när fotosyntetiska aktiviteten drog CO 2 koncentrationer ner till 360 ppm, ungefär var 15-20 min. Doseringen av den berikade och naturliga överflödet 13 C-CO 2-tankar som tillåts för en kontrollerad 4,4 atom-% 13 C atmosfären genom växtsäsongen för jämn växtvävnad märkning. 13 C-CO 2 produktion kan också uppnås genom att blanda 13 C-natrium bikarbonat eller 13 C-natriumkarbonat och saltsyra, men denna typ av system är mer komplicerat och kräver mer övervakning och underhåll, så vi rekommenderar användning av 13 C-CO 2-gas. En viktig faktor för att övervaka CO2 concentrations använder en irgA är att IR-analysatorer förlora två tredjedelar av deras känslighet vid mätning 13 C-CO2. Denna underskattning av ca 2,9% ppm för våra 4,4% 13 C-CO2 blandning var inte ett stort bekymmer för oss, men kan bli en viktigare fråga när märkning på högre 13 C-nivå 27.
A. gerardii är en varm säsong perenna Tallgrass Prairie graminoid arter. Utformningen av denna kammare var optimerad för A. gerardii produktion (Figur 1). Storleken och höjden på kammaren valdes som ersättning för den maximala höjden produktivitet A. gerardii på fältet, liksom för den önskade produktionsanläggning biomassa för framtida experiment. A. gerardii är känt för att vara ljus begränsas inom området 24,25. PAR i ett växthus kan minskas med 30-47% jämfört med yttre nivå 26. Eftersom vår anläggnings odlades i ett akrylglas kammare inne i ett växthus, PAR begränsning var ett bekymmer. När den är på de lysrör ökade PAR i kammaren med 9,5%, vilket kan ha bidragit till att öka produktiviteten i denna ljuskänsliga arter. När du använder denna kammare design för att odla andra typer av växter specifika fysiologiska behov som storlek, belysning, näringskrav, temperaturkänslighet, och markfuktighet bör noga anpassade för att upprätthålla optimala odlingsförhållanden för växterna.
När man arbetar med dyra isotopiskt märkta föreningar, såsom 10 atom-% 13 C-CO 2 och 98 atom-% 15 N-KNO3, effektivitet med märkningen är en viktig faktor. Denna kammare konstruktion optimerar 13C märkning genom att göra alla ansträngningar för att försegla kammaren och minimera luftläckage in i och ut ur kammaren. Om denna kammare aldrig öppnas under växtsäsongen, då ingen av de 13 C-etiketted CO 2 från kammaren är läckt ut till atmosfären. Den CO2 bygga upp under natten andning verkar inte skada växande växter och snabbt tas upp efter soluppgången (Figur 2). Under differentiell märkning, var kammaren kort öppnas för att ta bort de differentiellt märkta krukor men det verkade inte späda den riktade 4,4 atom% 13 C märkning av de kontinuerligt märkta plantor (Tabell 1). 13 C märkning också optimerats genom att skura ut initial atmosfärisk luft i kammaren vid tätning. Under förberedande prov på kammaren utan en initial skrubba av atmosfärisk CO2, var plantor uppmättes ha en utspädd 13 C-nivå i de första bladen som produceras än i de senare bladen produceras. Den initiala skrubba av atmosfärisk CO2 vid kammar nedläggning är att eliminera detta problem genom att tillåta kontinuerlig 13C märkning frånplanta till förfall. Att upprätthålla ett jordfritt ingjutning blandning av sand, vermikulit, och lera också eliminerar naturligt överflöd CO2 föroreningar från markandningen. Elimineringen av jord från systemet kräver noggranna befruktning och ympning överväganden, som kan vara unika för olika växtarter. 15 N märkning genom den riktade 7 atom% 15 N Hoegland lösning produceras mycket märkt växtmaterial på 6,7 atom% 15 N (tabell 1). En viss utspädning från den riktade 15 N etikett kan orsakas av några naturliga överflöd N i ingjutning mix eller från den befintliga jorden ympning.
Under biosyntesen av föreningar, naturliga diskriminering av 13 C (eller 15 N) sker som ett resultat av kinetisk fraktionering och nonstatistical isotopfördelning i de syntetiserade föreningarna. Således, i fallet med C, sekundära produkter (t.ex. lipider, fenolföreningar) är i allmänhet utarmat på 13 C i jämförelse med primärprodukter (kolhydrater). Denna naturliga diskriminering 13 C tycks kvarstå även när växter odlas i en berikad 13C atmosfär, som kan ses i den lilla skillnaden i atom% 13 C i varmvattenextrakt och rester varmvatten för enhetligt märkta plantor (Tabell 1 ). Denna naturliga kinetiska fraktionering är mycket liten jämfört med anrikningen och inte äventyrar enhetligheten i märkningen.
Differential märkning av strukturella och metaboliska växtvävnader är en ny teknik med potential för avancerade studier i kull nedbrytning, mikrobiell ekologi och markens organiska material bildas. Skillnaden i 13 C och 15 N på varmvattnet extrakt och varmvattenrester tyder på en betydande utspädning av 13 C och 15 N i urlakningsbart, lågmolekylvikt föreningar (varmvatten extrakt) från konstruktions växtmaterial (varmvatten rester) efter 7, 14, och 22 dagar för differentiell märkning (P <0,005). Denna differentiella märkningen av växtvävnader kan användas för att spåra vad som händer med de strukturella och metaboliska komponenter separat genom ett ekosystem. Den 13 C differential märkning var mer extrem än 15 N differentiell märkning. Detta kan bero på omedelbarhet 13C utspädning när du tar bort växterna från 13 C-CO2 märkt atmosfär, medan 15 N märkningen är fortfarande i planteringsjord mix under en tid och 15 N utspädning sker långsammare. För mer drastiska differentiell märkning av 15 N, kan man överväga att spola krukorna med vatten före naturligt överflöd gödsling under de sista veckorna av tillväxten utanför kammaren.
Utformningen och driften av denna kontinuerliga 13 </ Sup> C och 15 N märkningssystem för uniform eller differential, metabola och strukturella, växtvävnad märkningen ger en ny metod för att framställa isotopmärkt växtmaterial för avancerad forskning. Den utformning och operativa detaljer i denna kammare har valts för 4,4 atom% 13 C och 7 atom% 15 N märkning av A. gerardii, men kan anpassas till andra typer av vegetabiliska och isotopmärkningsnivåer. De odlingsförhållanden som beskrivs här bör skräddarsys för att passa den storlek, temperatur, luftfuktighet, ljus, vatten och näringsämnen krav på speciella växtarter av intresse. Märkning med 18 O eller 2 H kan också uppnås genom att märka det vatten som används i bevattningssystem. Det system som beskrivs här tar upp många av de utmaningar som en enhetlig och differential 13C märkning av växtmaterial. Denna grundläggande kammar design kan användas av andra forskargrupper för att producera mycket märkt växtmaterial för advlad studier i ekosystemet biogeokemi.
The authors have nothing to disclose.
Särskilt tack till växt ökad tillväxt och EcoCore analytisk anläggning vid Colorado State University och till de många elever och lärare som hjälpt till med detta projekt. Detta arbete finansieras av NSF DEB bidraget # 0918482, USDA National Needs Fellowship, och Cotrufo-Hoppess fond för markekologi forskning.
40 in Remote Tower Fan | Living Accents | FS10-S3R-A | |
42 in Electric Tower Fan with remote control | LASKO | 2559 | |
Mr. Slim Split-type air conditioner | Mitsubishi Electric | R410A | |
Electronic 24 hr time switches | Intermatic | ET100C | Operates Fluorescent Light System |
iSeries Humidity and Temp Controller | Omega | CHiTH-i8DV33-5-El | |
Solid State Relay | Omega | SSRL240 | |
CKR Series Solid State Relay | Crydon | ||
Solenoid Coils | Dayton | 6X543 | |
GasHound CO2 Analyzer | LI-COR | LI-800 | |
Dehumidifier | Dayton | 1DGX4 | |
Specialty gas regulator | Airgas | CGA 580 | |
T5 Hight Output Commercial Fluorescent Light System | Hydro Farm | FLT48 | |
Air pump | Thermo Scientific | 420-1901 | |
Masterflex Cartridge Pump HeadSystem | Cole Parmer | 7553-70 | |
1900 Series Network Switch | Catalyst | ||
Profile Porus Ceramic Top Dressing | Greens Grade | ||
Industrial Quartz 40 mesh | Unimin | 4095 | |
Mycorrhizae Professional Growing Medium | ProMix | ||
Vermiculite and Perlite | Thermo-Ran | C633 | |
Potassium Nitrate- 15N 98 atom % | Sigma-Aldrich | 335134 | |
Carbon-13C Dioxide 10 atom % | Sigma-Aldrich | 600180 | |
Medical grade CO2 | Airgas | ||
Regulator | Airgas | CGA 350 | |
4 in box fans | Grainger | ||
Masterflex PharMed BPT Tubing | Cole Parmer | HV-06508-24 |