Summary
Este método se explica cómo construir y operar un 13 C continua y 15 N isótopo cámara de etiquetado para el uniforme o el etiquetado de tejidos vegetales diferencial. Se discuten los resultados representativos de metabólicas y etiquetado estructural de gerardii Andropogon.
Abstract
Rastreando los isótopos estables raras a partir de material vegetal a través del ecosistema proporciona la información más sensible acerca de los procesos del ecosistema, desde flujos de CO 2 y la formación de materia orgánica del suelo a pequeña escala de biomarcadores de isótopos estables de sondeo. El acoplamiento de múltiples isótopos estables tales como 13 C con 15 N, 18 O o 2 H tiene el potencial para revelar aún más información acerca de las relaciones estequiométricas complejos durante las transformaciones biogeoquímicos. Isótopos etiquetada material vegetal ha sido utilizado en varios estudios de descomposición de la hojarasca y la formación de materia orgánica del suelo 1.4. A partir de estos y otros estudios, sin embargo, se ha hecho evidente que los componentes estructurales de material vegetal comportan de forma diferente que los componentes metabólicos (es decir, compuestos de peso. Lixiviables de bajo peso molecular) en términos de utilización microbiana y almacenamiento de carbono a largo plazo 5-7. La capacidad para estudiar los componentes estructurales y metabólicaspor separado se incluye una nueva y poderosa herramienta para avanzar en la vanguardia de los estudios biogeoquímicos de los ecosistemas. Aquí se describe un método para producir 13 C y 15 N material vegetal marcado que está marcado ya sea de manera uniforme en toda la planta o marcados de forma diferencial en componentes estructurales y metabólicos vegetales.
A continuación, presentamos la construcción y operación de un 13 C y 15 N continuo cámara etiquetado que se puede modificar para satisfacer diversas necesidades de investigación. Material vegetal uniformemente marcada se produjo por medio del etiquetado continuo desde la germinación hasta la cosecha, mientras que el marcado diferencial se logra mediante la eliminación de las plantas que crecen de las semanas de la cámara antes de la cosecha. Los resultados representativos de crecimiento Andropogon gerardii Kaw demostrar la capacidad del sistema de manera eficiente el material vegetal etiqueta en los niveles previstos. A través de este método que hemos producido material vegetal con un átomo de 4,4% 13 C y 6,7% de átomos 15 </ Sup> etiqueta de la planta N uniforme, o material que es diferencialmente marcado hasta en un 1,29% de átomos de 13 C y 0,56% de átomos 15N en su metabolismo y componentes estructurales (componentes residuales de agua caliente de agua extraíble y caliente, respectivamente). Desafíos mienten para mantener la temperatura adecuada, humedad, concentración de CO 2, y los niveles de luz en un recipiente hermético 13 C-atmósfera de CO2 para la producción vegetal éxito. Esta descripción de cámara representa una herramienta útil de investigación para producir efectivamente de manera uniforme o diferencial multi-isótopo material vegetal etiquetado para su uso en experimentos en los ciclos biogeoquímicos de los ecosistemas.
Introduction
Comprender la dinámica de los procesos de la planta-suelo-atmósfera es fundamental para predecir con precisión cómo el global del carbono (C) y nitrógeno (N) Ciclos de funcionamiento en condiciones ambientales actuales y futuros. Los isótopos estables son herramientas poderosas en los estudios cuantitativos de la planta-suelo-atmósfera N ciclismo C y. Rastreando los isótopos estables raras a partir de material vegetal a través del ecosistema proporciona información sensible en los estudios de los ciclos biogeoquímicos, de flujos de CO 2 y el suelo la formación de materia orgánica a pequeña escala de biomarcadores de isótopos estables de sondeo por ejemplo 4,8,9. Combinando C etiquetado 13 con 15 N etiquetado, u otros isótopos estables, tales como 2 H o 18 O en el tejido vegetal proporciona una alta detección, trazable sustrato y complejo para su uso en estudios de acoplados de la planta y la bioquímica del suelo. La capacidad para etiquetar de manera uniforme o diferencialmente anuncio material vegetal estructural y metabólicads aún más la capacidad para hacer frente a cuestiones complejas sobre C y N en bicicleta por los ecosistemas. El beneficio del uso de marcado con isótopos material vegetal en los estudios cuantitativos de la contabilidad de C y N, sin embargo, depende de la capacidad para producir 13 C y 15 N material marcado que es ya sea de manera uniforme o marcados de forma diferencial.
El etiquetado de isótopos se ha utilizado en estudios relacionados con la planta C y la asimilación de N 10, la asignación de 11 y rhizodeposition 12. Material vegetal marcado uniformemente 13 C y 15 N proporciona un complejo sustrato marcado para los estudios de descomposición de la hojarasca 1,4, formación de materia orgánica del suelo 2,6, CO 2 emisiones 4, Estudios Alimentarios web del suelo 13, y estudios de suelo C los tiempos de residencia del suelo 2,14. Los estudios que utilizan 13 biochar C marcada del material vegetal etiquetado también están comenzando a revelar nueva información sobre antiguamente por altopiscinas carac suelo 15. Mientras que 15 N, 2 H, y 18 O etiquetado son relativamente fáciles de lograr a través de tratamiento de agua y fertilizantes, existe el reto en la producción de material vegetal uniformemente 13 C etiquetados a través de 13 C-fijación de CO 2.
El etiquetado de isótopos continua desde plántulas hasta la madurez en una cámara sellada produce el etiquetado de isótopos uniforme en toda la planta. Otros métodos, como el etiquetado repetida de pulsos 16 y la aplicación foliar o mecha 17,18 no producen material vegetal isótopo marcado uniformemente, ni claro etiquetado diferencial de C-compuestos específicos (por ejemplo metabólico vs estructural) 19. Una consideración importante en el etiquetado de isótopos está etiquetado de la eficiencia, debido al alto costo de los compuestos enriquecidos de isótopos raros utilizados en el etiquetado. Aunque el etiquetado 13 C en continuo se ha utilizado en el pasado 2-4,20, no hay a nuestro conocimientouna publicación descripción técnica detallada de una cámara de etiquetado continuo con la evidencia de la eficacia alta el etiquetado y el control preciso de la cantidad y uniformidad de etiquetado de isótopos.
En la vanguardia de la descomposición de la hojarasca y el suelo de investigación formación de materia orgánica es el concepto de que el material vegetal metabólica (es decir lixiviables, compuestos de peso molecular lábiles, bajos) y material vegetal estructural (es decir. Lignina, celulosa, hemicelulosa) se procesan de forma diferente en términos de microbios eficiencia en el uso, la formación de materia orgánica del suelo, como a largo plazo del carbono del suelo de almacenamiento 5-7. El material vegetal que está marcado diferencialmente en sus componentes estructurales y metabólicas, por lo tanto, es una herramienta útil en la promoción de descomposición de la hojarasca y el suelo investigación formación de materia orgánica. Etiquetado diferencial con isótopos duales permite el seguimiento de los componentes estructurales y metabólicas por separado a través del ecosistema utilizando un isótopo techniqu múltiples piscinae 21.
El etiquetado de isótopos continua con 13 C y otros isótopos en una cámara sellada requiere una cuidadosa atención a plantar condiciones fisiológicas para maximizar la productividad de la planta y la eficiencia etiquetado de isótopos. Picos de temperatura durante el día deben ser controlados para evitar daños a las plantas cuando crecen en una cámara hermética. Se requiere un rango óptimo de humedad y de temperatura para mantener estomas de la planta abierta y absorción de CO 2 22. Los altos niveles de humedad causa el empañamiento de las paredes de la cámara, lo que minimiza la disponibilidad de luz y puede dañar la estructura de la cámara. La consideración cuidadosa y el isótopo etiquetado de eficiencia mediante la eliminación de los isótopos naturales de abundancia de la cámara (por ejemplo, procedentes de plantación en macetas con la materia orgánica del suelo) y la prevención de la exposición al aire exterior es importante cuando se trabaja con un isótopo pesado compuestos marcados caros.
A continuación, presentamos un método para la construcción y operación de unadual continuo 13 C y 15 N isótopo cámara de etiquetado para la producción de material vegetal que está marcado ya sea de manera uniforme o tiene sus componentes estructurales y metabólicos marcados en niveles distintos. C etiquetado 13 se controla en el nivel de la cámara, mientras que la fertilización y 15 N etiquetado es vigilada en el plano bote individual. Los resultados representativos se muestran para demostrar la capacidad de este método para controlar la temperatura, humedad, y concentración de CO 2 a lo largo de la temporada de crecimiento. Los resultados de crecimiento gerardii Andropogon, Kaw también demuestran la capacidad de este método para producir material vegetal de manera uniforme o diferencialmente etiquetados. El esquema específico diseño de la cámara y la operación descrita se puede modificar para crecer diferentes especies de plantas, así como para acomodar 2 o H 18 O etiquetado.
Protocol
1. Cámara de la Construcción
- Construir la cámara de etiquetado en un invernadero para permitir el máximo potencial de la luz natural para el crecimiento vegetal. Asegúrese de que la fuente de alimentación adecuada está disponible para alimentar todos los componentes de la cámara.
- Construir la cámara de etiquetado mediante el montaje de 3.175 mm paredes de acrílico transparente de policarbonato de espesor (también sería adecuado) y unos 6,35 mm de espesor de techo de acrílico transparente en un marco de aluminio con un piso de acero pintado de blanco para maximizar la reflexión solar. Las dimensiones de la cámara se pueden adaptar a las necesidades individuales de investigación.
- Monte la cámara en ¾ in (19 mm) de madera contrachapada en bloques de cemento.
- Haga agujeros en el cristal de acrílico, marco de aluminio y piso de acero y use los tornillos para sujetar todos los componentes juntos.
- Selle todas las juntas con masilla de silicona para asegurar un sello hermético.
- Construir una puerta montando una sección del revestimiento acrílico sobre tornillos largos, que puede enroscarse hacia abajo usando remopalomillas vable.
- Selle la puerta con burletes para evitar fugas de aire.
- Seleccione un área directamente adyacente a la cámara como centro de control para montar toda la temperatura, humedad, CO 2 controles, y los equipos de vigilancia.
- Cuidadosamente taladre agujeros pequeños en la pared de la cámara adyacente al centro de control para todos los cables eléctricos y los tubos de gas. Utilice masilla de silicona para sellar los agujeros alrededor de los cables y los tubos para evitar fugas de aire.
- Prueba de la cámara para el escape de aire llenándolo con un alto nivel de CO 2 (por ejemplo, 800 ppm) y dejar reposar toda la noche. Si la concentración de CO 2 en la cámara se mantiene a su nivel original, entonces es hermético. Si la concentración de gotas de la noche y después todas las costuras se deben examinar y volver a sellar con masilla de silicona hasta que se logra un sellado hermético.
- Para algunas plantas adaptadas a las altas condiciones de luz, añadir luces conectadas a un temporizador en el exterior inmediato de la Chamber para aumentar la penetración de la luz y la productividad de la planta.
2. Los controles de temperatura y humedad
- Regular la temperatura de la cámara mediante la instalación de un comercial de tipo split de aire acondicionado con la refrigeración (evaporador) bobinas situadas en el interior de la cámara y las bobinas del compresor y del condensador ubicados fuera del invernadero para disipar el calor. Ajuste el acondicionador de aire para mantener la temperatura deseada.
- Use una pequeña sala de deshumidificador para controlar la humedad en la cámara.
- Perforar un agujero de drenaje a través del suelo de la cámara adyacente al deshumidificador.
- Retire el colector de condensado desde el deshumidificador, y conectar un tubo de drenaje desde el deshumidificador a través del agujero de drenaje en el suelo de la cámara.
- Debajo de la cámara, coloque un tarro abierto lleno de agua para que el deshumidificador para drenar directamente en. Esto crea un sello hermético sino también permitir el equilibrio de presión.
- Conecte el controlador al sistema de deshumidificación con un relé de estado sólido y ajuste el regulador de humedad con una alarma alta y el swing para mantener las condiciones óptimas de crecimiento en la cámara. Las condiciones óptimas de temperatura y humedad serán diferentes para diferentes especies de plantas.
3. CO 2 Controles
- El 13 C-CO 2 de enriquecimiento se consigue mediante dos 2 tanques de gas puro CO, una de 10% de átomos de 13 C-CO 2 o superior y una de 1,1% de átomos de 13 C-CO 2 (abundancia natural).
- Monitorear la concentración de CO 2 por tener una bomba de diafragma dibujar continuamente aire de la cámara a través de un Analizador de Gas de infrarrojos (IRGA) y luego la bomba de aire de nuevo en la cámara, manteniendo así un sistema cerrado (Figura 1).
- Seta de alarma baja y la banda muerta en el software IRGA para mantener concentraciones de CO 2 en un intervalo deseado. Aquí, nosotros usamos una alarma baja de 360 ppm con una banda muerta de 40 ppm para mantener concentraciones de CO 2 entre 360-400 ppm.
- Conectar una válvula de dosificación para cada tanque y cuidadosamente ajustarlos para lograr el nivel de enriquecimiento de C de destino 13. Ajuste los reguladores del tanque a 20 psi.
- Inserte una válvula de solenoide entre la válvula dosificadora y el regulador de cada tanque. Únete a las salidas de las dos válvulas de medición juntos y tubo de ellos en el centro de la cámara. Conecte un relé de estado sólido a la salida IRGA para controlar las válvulas de solenoide (Figura 1).
4. Sistema de Monitoreo Remoto basado en la Web
- Vigilar concentraciones de CO 2 procedentes del software IRGA accediendo a un archivo local una vez cada 30 segundos.
- Cree una utilidad personalizada (por ejemplo en perl o en otro lenguaje de programación) para recogerentradas desde el archivo de registro de CO 2 locales, junto con la fecha y hora del ordenador portátil actual, y subirlos a una aplicación web de back-end.
- Configure la aplicación web para consultar la temperatura y los datos del sensor de humedad.
- Utilizar un sistema de seguimiento para comprobar el estado de la temperatura en la cámara de cada cinco minutos para evitar posibles picos de temperatura que destruirían las plantas si el sistema de aire acondicionado falló.
- Monitorear los datos CO 2, temperatura y humedad en cualquier navegador web estándar, por lo que cualquier pico de temperatura inesperados o CO 2 gotas se pueden inmediatamente atendidas.
5. Sistema de Riego
- Perforar un pequeño agujero en la pared de la cámara de vidrio acrílico por maceta.
- Utilizar tubos de irrigación para crear un anillo de riego por goteo por maceta y alimentar el tubo de irrigación a través de la pared de la cámara hacia el exterior.
- Sellar los agujeros alrededor de los tubos de riego con masilla de siliconapara evitar fugas de aire.
- En el exterior de la cámara, conecte el tubo de irrigación a la tubería para una bomba peristáltica.
- Use una pequeña abrazadera de la manguera para cerrar todas las tuberías de riego para evitar fugas de aire entre riegos.
6. Las plantas para macetas
- Seleccione un tamaño de la maceta adecuada para las plantas que se cultivan. Aquí, el 40, se utilizan 15 ollas L.
- Crear una mezcla de tierra-suelo libre mezclando arena, vermiculita, y el perfil de cerámica porosa.
- Prueba de la capacidad de retención de agua de la mezcla para macetas pesando una olla seca llena, empapando la olla con agua y dejar que se drene por completo, y un peso de la olla húmeda. Utilice esta máxima capacidad de retención de agua para asegurarse de que el exceso de fertilizante marcado y el agua no se escape de las macetas durante el riego.
- Germinar semillas en tierra para macetas antes de sembrar en las macetas. Esto asegura que las semillas germinadas con éxito sólo se inician en la cámara de etiquetado.
- Inocular t que las plántulas con lodo fresco suelo de introducir microbios beneficiosos.
- Una vez que las semillas han germinado, trasplantar cuidadosamente las plántulas de las macetas en el número deseado.
- Una vez plantados, mover las ollas en la cámara y montar cada maceta con una manguera de riego individual.
7. Sellado de la Cámara
- Cuando el sellado de la primera puerta a la cámara de una gran masa de aire exterior llena el espacio de la cámara. Frote este CO 2 externo mediante la conexión de un lavador de sosa y cal para la bomba de aire para fregar la concentración de CO 2 hasta por lo menos 200 a 250 ppm antes de llenar la cámara de nuevo hasta 400 ppm, utilizando la mezcla de 13 C-CO 2 tanque.
- Trate de mantener la cámara cerrada a través de la duración de la temporada de cultivo para minimizar la abundancia natural de CO 2 la contaminación.
- Monitorear crecimiento de las plantas visualmente y ajustar la fertilización y riego de acuerdo con la demanda.
- Utilice una solución de fertilizante, tal como una solución de un Hoagland modificada 23, para fertilizar las plantas a través del sistema de riego.
- Etiquetar el fertilizante con 15 N utilizando un 15 N-KNO3 subsolución en el apuntado átomo% 15N nivel mediante la mezcla de 98% de átomos de 15 N-KNO3 con abundancia natural 15 N-KNO 3 (0,37% atómico 15 N).
- Mezclar lo suficiente de la solución de fertilizante en cada caso la fertilización para toda la cámara, sobre la base de la capacidad de retención de agua de la mezcla para macetas. Coloque la cantidad adecuada de fertilizante para una maceta en un frasco de vidrio, y prepararse como muchos tarros hay ollas.
- Desembridar las mangueras de riego y colocar cada uno de ellos en un frasco con la solución de fertilizante, y luego conectarlos a la bomba peristáltica.
- Plantas de agua por bombeo de agua a través de la bomba peristáltica a través del riego por goteo individuomangueras gación regularmente ya que las plantas necesitan.
- La fertilización con solución de Hoagland debe seguir la demanda de la planta o el diseño experimental, con una demanda cada vez mayor de nutrientes a medida que aumenta la productividad de plantas para maximizar la productividad.
- En primer lugar, la bomba de solución de la Hoagland a través de la manguera de riego, a continuación, bombear agua a través de un enjuague para minimizar el crecimiento de algas y bacterias en los tubos.
- Reclamp todas las mangueras después de la fertilización y el riego para eliminar las fugas de aire de cámara.
9. Uniforme y diferenciado Etiquetado
- Para el marcaje diferencial de los componentes estructurales y metabólicas, retire las plantas de la cámara etiquetado 1-3 semanas antes de la cosecha. Las plantas que son para ser etiquetados de manera uniforme pueden permanecer en la cámara de sellado etiquetado continuamente hasta la cosecha y se riegan con solución 15 N de-Hoagland.
- Mantenga las plantas retiradas en el invernadero durante este tiempo para que puedan recibir la luz adecuaday CO2 en abundancia natural 13 C.
- Para diferencial etiquetado 15 N, continúe para fertilizar y regar las plantas, como de costumbre, pero el uso de la abundancia natural de 15 N-KNO3 en solución fertilizante del Hoagland.
10. Cosecha
- Deje de plantas 1 semana antes de la cosecha de riego para que las plantas empiezan a senescencia y medio de la maceta se seque.
- Abra la cámara y mover las ollas a cabo para el recorte inmediato y la cosecha de la biomasa aérea
- Vierta la mezcla de tierra y las raíces a través de una malla gruesa.
- Utilice la pantalla para separar las raíces de la mezcla de tierra y agitar las raíces libres de la mezcla para macetas.
- Coloque las raíces en un tamiz de 2 mm y enjuague con agua para eliminar cualquier material de relleno restante. Utilice pinzas para quitar cualquier vermiculita que pueden aferrarse a las raíces.
- Permitir raíces se sequen al aire en la preparación para futuros experimentos.
- Pesar el material vegetal seco al aire para determinar la biomasa cámara etiquetado.
- Moler una submuestra para análisis químico.
- Colocar 2,0 g de horno de secado (60 ° C) de arena en un ácido 125 ml frasco lava y se añaden 50 ml de agua desionizada.
- Colocar la muestra en un plato agitador precalentado (60 º C) y coloque una barra agitadora en el matraz. Establezca la agitación durante 200 rpm y dejar que la muestra se caliente durante 30 min.
- Después de 30 minutos, se filtra la solución a través de una camada micras 20 malla de nylon en un sistema de filtración al vacío.
- Transferir el extracto a un tubo de lavado ácido pesado previamente y congelar.
- Transferir el residuo basura sólida a un recipiente de aluminio previamente pesado y se seca a 60 ° C. Pesar la cacerola y la basura después de secar para determinar la masa de residuos de agua caliente.
- Congele secar el extracto en agua caliente y se pesa para determinar la masa de extracto de agua caliente.
- Analizar secada en horno (60 ° C) de arena, agua caliente liofilizadoextraer y residuos de agua caliente secada al horno en un Analizador Elemental - relación isotópica Espectrómetro de Masas (EA-IRMS).
Representative Results
Nuestra cámara de etiquetado es de 1,2 mx 2,4 mx 3,6 m en tamaño y tiene 40,15 L ollas (Figura 1). El sistema de control computarizado IRGA mantiene concentraciones de CO 2 entre los valores establecidos de 360 y 400 ppm durante el periodo de actividad fotosintética del día (Figura 2a). La función de alarma de CO 2 bajo en el IRGA activa las electroválvulas para permitir que el CO 2 de la 13 C enriquecida y tanques de abundancia natural en la cámara cuando la concentración se redujo por debajo del umbral mínimo (por ejemplo, 360 ppm). La característica de la banda muerta se detuvo el flujo cuando la concentración alcanza el punto de ajuste superior (por ejemplo, 400 ppm). La temperatura iSeries y sistema de monitoreo de humedad conectado al aparato de aire acondicionado y un deshumidificador celebrada condiciones climáticas dentro de los parámetros establecidos a lo largo de la temporada de crecimiento (Figura 2b). Se utilizó una de una tonelada (3,5 kW) unidad de aire acondicionado para keEP el fresco de cámara.
El sistema de control remoto permite que los datos registrados pueden ver en cualquier momento mediante un navegador web estándar. Los valores 2 concentraciones, temperatura y humedad CO fueron abajo muestreados por la aplicación web para mostrar gráficos en la última 24-240 horas, en incrementos de 24 hr. Esto creó una visual rápida para confirmar que las fluctuaciones diarias estaban dentro de los límites esperados. Visualización de la interfaz web también muestra el estado actual de la cámara, así como proporcionadas alertas a posibles problemas, como no recibir datos recientes. En cualquier momento el conjunto completo de datos también puede ser descargado desde la interfaz web.
Se midió la radiación fotosintéticamente activa (PAR) en el interior y exterior de la cámara en cuatro puntos con y sin las luces encendidas en medio del verano y la mitad del día, utilizando un sensor cuántico inmediata. El PAR en la cámara fue 31.5% menor que el exterior cuando las luces de la cámara were off y un 22% más bajo que el exterior cuando las luces estaban encendidas. Por lo tanto, las luces de la cámara ayudan a aumentar de manera significativa la penetración de PAR dentro de la cámara por el 9,5% (P <0,05).
Nuestro sistema de etiquetado continuo fue capaz de producir 2,759 g de A. biomasa gerardii, el 37% de los cuales era la biomasa aérea y el 63% de los cuales era la biomasa subterránea. Logramos una etiqueta de la planta 4,4% de átomos de 13 C todo en nuestro material vegetal uniforme mediante el establecimiento de las válvulas de solenoide en los dos tanques de CO 2 en consecuencia (Figura 1, Tabla 1). Hemos conseguido un N etiqueta de la planta entera 6,7% atómico 15 en nuestro material vegetal uniforme mezclando 98 átomo% 15 N-KNO 3 con 0,37% atómico 15 N-KNO 3 en el KNO 3 subsolución de la solución de un Hoagland modificada 23 (Tabla 1) . Nosotros regamos la A. semanal gerardii con 750 ml de líquido total (del agua, más la solución de Hoagland) a lo largo del mar en crecimientohijo. Nos fertilizado con 200 a 500 ml de 15 N etiquetado solución de Hoagland por semana dependiendo de la productividad de la planta.
Hemos utilizado el método de extracción de agua caliente para determinar si había diferencias isotópicas entre el uniforme y material vegetal diferencialmente marcado. Para las plantas marcadas diferencialmente, después de la cosecha quitamos las hojas que estaban completamente muertos y manejan estos por separado, ya que probablemente no fueron etiquetados diferencialmente. Al mirar el contenido de C 13, todos los cuatro días de incorporación fueron significativamente diferentes entre sí para toda la planta y el extracto en agua caliente, pero para el día residuo de agua caliente 14 y 22 no fueron significativamente diferentes entre sí (Tabla 1). Al comparar las fracciones tejido de la planta dentro de cada día, el extracto de agua caliente y residuo fueron significativamente diferentes entre sí para todos los cuatro días y por día 22 toda la planta, extracto, residuo y eran todos signinificativamente diferentes unos de otros (Tabla 1). Para el N incorporación en 15 componentes de la planta, no había diferencias entre los días de fracciones de constitución y de tejidos vegetales. Para el extracto de agua caliente todos los cuatro de los días de incorporación fueron significativamente diferentes entre sí para 15 N, y para toda la planta y el agua caliente de residuos los días más cortos de incorporación fueron significativamente diferentes de los días más largos de incorporación (Tabla 1). Las fracciones tejido de la planta en las plantas uniformes no fueron significativamente diferentes entre sí en 15 N, pero el extracto de agua caliente y residuo fueron significativamente diferentes entre sí en 15 N para la camada diferencialmente marcado.
Todos los valores isotópicos se registran utilizando los por ciento en átomos (% en átomos) notación (Ecuación 1), que es una notación más precisa que% para utilizar en altos niveles de pesadaenriquecimiento del isótopo 21. Por ejemplo:
(1)
Para este estudio, nos encontramos con los análisis estadísticos con SAS versión 9.2. Pusimos a prueba las diferencias entre los niveles de luz de la cámara interior y exterior usando una prueba t pareada. Pusimos a prueba las diferencias entre 13 C y 15 N etiquetado de los extractos de agua caliente y los residuos de agua caliente utilizando análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) en PROC ANOVA. Se utilizó la prueba de rangos múltiples de Duncan para el análisis de comparaciones múltiples. Importancia fue aceptada a un nivel de p de 0,05. Se utilizó una prueba de Wilcoxon rango suma de probar que los datos cumplen los supuestos del análisis.
Figura 1. Schematdiagrama ic del 40 Capacidad olla continua cámara multi-etiquetado de isótopos a vista de pájaro. Las líneas de puntos representan el cableado eléctrico, mientras que las líneas continuas representan gas o tubería de agua. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
. Figura 2 A) Promedio de concentración de CO2 (ppm) (+ / -. SE) durante un periodo de veinticuatro horas por un período de crecimiento entera B) Temperatura media (º C), círculos abiertos, y la humedad (%), círculos cerrados . (+ / - SE) durante un periodo de veinticuatro horas por un período de crecimiento de toda clic aquí para ampliar imedad.
| Uniforme (0) | Diferencial (7) | Diferencial (14) | Diferencial (22) | ||
| Toda la Basura | 13 átomo de C% | 4,46 ± 0,02 Aab | 3,93 ± 0,05 Ba | 3,64 ± 0,03 Ca | 3,35 ± 0,06 Db |
| 15 átomo de N% | 6,69 ± 0,07 Aa | 6,72 ± 0,01 Aa | 6,33 ± 0,06 Ba | 6,41 ± 0,07 Ba | |
| 13 átomo de C% | 4,59 ± 0,04 Aa | 3,35 ± 0,06 Bb | 2,79 ± 0,06 Cb | 2,37 ± 0,03 Dc | |
| 15 átomo de N% | 6,69 ± 0,03 Aa | 6,43 ± 0,01 Bb | 5,89 ± 0,07 Db | 6,16 ± 0,05 Cb | |
| Residuo Agua Caliente | 13 átomo de C% | 4,37 ± 0,06 Ab | 4,1 ± 0,03 Ba | 3,79 ± 0,10 Ca | 3,66 ± 0,05 Ca |
| 15 átomo de N% | 6,57 ± 0,04 Ba | 6,71 ± 0,02 Aa | 6,45 ± 0,02 Ca | 6,44 ± 0,03 Ca |
Tabla 1.
Discussion
Este diseño para una cámara de etiquetado de isótopos continua se utilizó para producir de manera uniforme y diferencialmente 13 C y 15 N etiquetada A. gerardii para su posterior campo y experimentos de laboratorio. Durante tres temporadas de crecimiento de la operación, la cámara se ha mantenido con éxito la temperatura, la humedad y concentraciones de CO 2 dentro de los parámetros establecidos (Figura 2). La fiabilidad del sistema de control de la temperatura es fundamental durante el pico de verano, cuando la alta radiación solar puede causar un sobrecalentamiento en la cámara hermética. Eliminar el exceso de humedad causada por la transpiración de las plantas en crecimiento asegura que los estomas de la planta permanezca abierta para la absorción fotosintética 22 y que la condensación de agua no inhibe la penetración de la luz o de dañar la estructura de la cámara.
El monitoreo continuo en la zona de concentración de CO 2 por el software IRGA mantiene continua13 C etiquetado de las plantas durante su crecimiento en la cámara. Debido a la alta actividad fotosintética de A. gerardii creciente en esta cámara, el CO2 se inyecta en el sistema con frecuencia durante las horas del día de la temporada alta de crecimiento cuando la actividad fotosintética dibujó concentraciones de CO 2 a 360 ppm, aproximadamente cada 15 a 20 min. La medición de la abundancia natural enriquecido y 13 C-CO 2 tanques permitidos para un átomo de 4,4% ambiente 13 C controlado a través de la estación de crecimiento para el etiquetado del tejido de la planta uniforme. 13 C-producción de CO 2 también se puede lograr mediante la mezcla de 13-C de sodio bicarbonato o carbonato de 13 C-sodio y ácido clorhídrico, sin embargo, este tipo de sistema es más complicado y requiere más vigilancia y el mantenimiento, por lo que recomendamos el uso de 13 C-CO 2 gas. Una consideración importante para el control de CO 2 concentrations utilizando un IRGA es que los analizadores infrarrojos pierden dos tercios de su sensibilidad en la medición de 13 C-CO 2. Esta subestimación de aproximadamente 2,9% ppm para nuestra mezcla de 4,4% de 13 C-CO 2 no era de gran preocupación para nosotros, pero podría convertirse en un problema más significativo al etiquetar a mayores niveles de 13 C 27.
A. gerardii es una estación cálida tallgrass perennes pradera especies graminoides. El diseño de esta cámara se optimiza para A. producción gerardii (Figura 1). El tamaño y la altura de la cámara se eligieron teniendo en cuenta para la productividad máxima altura de A. gerardii en el campo, así como para la producción de biomasa de la planta deseada para futuros experimentos. A. gerardii es conocida por ser la luz limitada en el campo de 24,25. PAR dentro de un invernadero puede ser disminuida por 30-47% en comparación con los niveles exteriores 26. Desde nuestra plantas se cultivaron en una cámara de vidrio acrílico dentro de un invernadero, la limitación PAR era una preocupación. Cuando se enciende, las luces fluorescentes aumentaron PAR dentro de la cámara de un 9,5%, lo que puede haber contribuido a aumentar la productividad de esta especie sensibles a la luz. Al utilizar este diseño de la cámara de crecer otro tipo de plantas de las necesidades fisiológicas específicas, tales como el tamaño, la iluminación, la demanda de nutrientes, sensibilidad a la temperatura y la humedad del suelo debe ser realizado a medida cuidadosamente para mantener las condiciones óptimas de crecimiento para las plantas.
Cuando se trabaja con compuestos marcados isotópicamente caros, tales como 10% átomo de 13 C-CO 2 y 98% atómico 15 N-KNO 3, la eficiencia de etiquetado es una consideración importante. Este diseño de la cámara optimiza C etiquetado 13, haciendo todos los esfuerzos para sellar la cámara y minimizar las fugas de aire dentro y fuera de la cámara. Si esta cámara no se abre durante la temporada de crecimiento, entonces ninguno de la etiqueta 13 Ced CO 2 de la cámara se filtró a la atmósfera. El CO 2 se acumule durante la respiración durante la noche no parece dañar las plantas que crecen y se absorbe rápidamente después de la salida del sol (Figura 2). Durante el etiquetado diferencial, la cámara se abre brevemente para quitar las macetas marcadas diferencialmente, pero esto no parece para diluir el objetivo átomo de 4,4% 13 C etiquetado de las plantas etiquetadas de forma continua (Tabla 1). C etiquetado 13 también se optimizó por la depuración a cabo la aire atmosférico inicial atrapado en la cámara de sellado al. Durante las pruebas preliminares sobre la cámara sin una limpieza inicial de CO 2 en la atmósfera, se midieron las plantas para tener un nivel de 13 C diluida en las primeras hojas producidas que en las hojas posteriores producidos. El matorral inicial de CO 2 en la atmósfera cuando se cierra la cámara parece eliminar este problema al permitir que para el etiquetado 13 C continua desdela germinación hasta la madurez. El mantenimiento de una mezcla para macetas, suelo libre de arena, vermiculita, arcilla y también elimina la abundancia natural de CO 2 la contaminación de la respiración del suelo. La eliminación del suelo desde el sistema no requiere consideraciones de fertilización e inoculación cuidadosas, que puede ser única para diferentes especies de plantas. 15 N etiquetado a través del 7% en átomos solución de N Hoegland 15 dirigida producido material vegetal altamente marcado en 6,7% en átomos de 15 N (Tabla 1). Una ligera dilución de la etiqueta 15 N dirigido puede ser causada por algunos abundancia natural N en la mezcla de tierra o de la inoculación suelo nativo.
Durante la biosíntesis de compuestos, la discriminación natural de 13 C (o 15 N) se produce como resultado de fraccionamiento cinética y la distribución de isótopos no estadística en los compuestos sintetizados. Por lo tanto, en el caso de C, los productos secundarios (por ejemplo, lípidos, compuestos de fenol) generalmente se agotan en 13 C, en comparación con los productos primarios (hidratos de carbono). Esta discriminación natural de 13 C parece persistir también cuando las plantas se cultivan en un ambiente enriquecido 13 C, como se puede ver en la ligera diferencia en átomo de C 13% de los extractos de agua caliente y los residuos de agua caliente de las plantas etiquetadas de manera uniforme (Tabla 1 ). Este fraccionamiento cinética natural es muy pequeño en comparación con el enriquecimiento y no compromete la uniformidad del etiquetado.
Etiquetado diferencial de los tejidos vegetales estructurales y metabólicas es una novedosa técnica con posibilidades de estudios superiores de descomposición de la hojarasca, la ecología microbiana y la formación de materia orgánica del suelo. La diferencia de 13 C y 15 N de los extractos de agua caliente y los residuos de agua caliente indica una dilución significativa de 13 C y 15 N en el lixiviables, bajocompuestos de peso molecular (extractos de agua caliente) del material de la planta estructural (residuos de agua caliente) después de 7, 14, y 22 días de etiquetado diferencial (P <0,005). Este etiquetado diferencial de tejidos de la planta se puede utilizar para rastrear el destino de los componentes estructurales y metabólicas separado a través de un ecosistema. El etiquetado diferencial 13 C fue más extremo que 15 N etiquetado diferencial. Esto puede ser debido a la inmediatez de 13 C de dilución cuando la eliminación de las plantas de la atmósfera marcado 13 C-CO 2, mientras que la etiqueta 15 N todavía permanece en la mezcla para macetas durante algún tiempo y 15 N dilución se produce más lentamente. Para obtener más etiquetado diferencial drástica de 15 N, se puede considerar el lavado de las ollas con agua antes de la fertilización abundancia natural durante las últimas semanas de crecimiento fuera de la cámara.
El diseño y el funcionamiento de este continuo 13 </ Sup> C y 15 N sistema de etiquetado para uniforme o diferencial, metabólica y, etiquetado estructural tejido de la planta proporciona un nuevo método para la producción de material vegetal marcado isotópicamente para la investigación avanzada. El diseño y los detalles operativos de esta cámara han sido elegidos por 4,4% de átomos de 13 C y 7% atómico 15 N etiquetado de A. gerardii, pero se pueden adaptar a otros tipos de plantas y los niveles de etiquetado de isótopos. Las condiciones de cultivo descritas aquí deben adaptarse en función del tamaño, temperatura, humedad, luz, agua y nutrientes exigencias de las especies vegetales de interés en particular. Etiquetado con 18 O o 2 H también se puede lograr mediante el etiquetado del agua utilizada en el sistema de riego. El sistema descrito aquí resuelve muchos de los retos de uniforme y diferenciado 13 C etiquetado de material vegetal. Este diseño básico de cámara puede ser utilizado por otros grupos de investigación para producir material vegetal altamente etiquetado para advestudios en la biogeoquímica del ecosistema balanceado.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Un agradecimiento especial para el Fondo para el crecimiento de las plantas y las instalaciones analítica EcoCore en la Universidad Estatal de Colorado y a los muchos estudiantes y maestros que ayudaron en este proyecto. Este trabajo está financiado por la NSF DEB subvención # 0918482, Necesidades USDA Nacional de Becas, y el fondo Cotrufo-Hoppess para la investigación ecología del suelo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40 in Remote Tower Fan | Living Accents | FS10-S3R-A | |
| 42 in Electric Tower Fan with remote control | LASKO | 2559 | |
| Mr. Slim Split-type air conditioner | Mitsubishi Electric | R410A | |
| Electronic 24 hr time switches | Intermatic | ET100C | Operates Fluorescent Light System |
| iSeries Humidity and Temp Controller | Omega | CHiTH-i8DV33-5-El | |
| Solid State Relay | Omega | SSRL240 | |
| CKR Series Solid State Relay | Crydon | ||
| Solenoid Coils | Dayton | 6X543 | |
| GasHound CO2 Analyzer | LI-COR | LI-800 | |
| Dehumidifier | Dayton | 1DGX4 | |
| Specialty gas regulator | Airgas | CGA 580 | |
| T5 Hight Output Commercial Fluorescent Light System | Hydro Farm | FLT48 | |
| Air pump | Thermo Scientific | 420-1901 | |
| Masterflex Cartridge Pump HeadSystem | Cole Parmer | 7553-70 | |
| 1900 Series Network Switch | Catalyst | ||
| Profile Porus Ceramic Top Dressing | Greens Grade | ||
| Industrial Quartz 40 mesh | Unimin | 4095 | |
| Mycorrhizae Professional Growing Medium | ProMix | ||
| Vermiculite and Perlite | Thermo-Ran | C633 | |
| Potassium Nitrate- 15N 98 atom % | Sigma-Aldrich | 335134 | |
| Carbon-13C Dioxide 10 atom % | Sigma-Aldrich | 600180 | |
| Medical grade CO2 | Airgas | ||
| Regulator | Airgas | CGA 350 | |
| 4 in box fans | Grainger | ||
| Masterflex PharMed BPT Tubing | Cole Parmer | HV-06508-24 |
References
- Bird, J. A., Torn, M. S. Fine roots vs. Needles: A comparison of (13)C and (15)N dynamics in a ponderosa pine forest soil. Biogeochemistry. 79, 361-382 (2006).
- Bird, J. A., van Kessel, C., Horwath, W. R. Stabilization of C-13-carbon and immobilization of N-15-nitrogen from rice straw in humic fractions. Soil Sci. Soc. Am. J. 67, 806-816 (2003).
- Denef, K., Six, J. Contributions of incorporated residue and living roots to aggregate-associated and microbial carbon in two soils with different clay mineralogy. Eur. J. Soil Sci. 57, 774-786 (2006).
- Rubino, M. Carbon input belowground is the major C flux contributing to leaf litter mass loss: Evidences from a C-13 labelled-leaf litter experiment. Soil Biol. Biochem. 42, 1009-1016 (2010).
- Cotrufo, M. F., Wallenstein, M. D., Boot, C. M., Denef, K., Paul, E. The Microbial Efficiency-Matrix Stabilization (MEMS) framework integrates plant litter decomposition with soil organic matter stabilization: do labile plant inputs form stable soil organic matter. Glob. Change Biol. 19, 988-995 (2013).
- Mambelli, S., Bird, J. A., Gleixner, G., Dawson, T. E., Torn, M. S. Relative contribution of foliar and fine root pine litter to the molecular composition of soil organic matter after in situ degradation. Org. Geochem. 42, 1099-1108 (2011).
- Prescott, C. E. Litter decomposition: what controls it and how can we alter it to sequester more carbon in forest soils. Biogeochemistry. 101, 133-149 (2010).
- Denef, K., Roobroeck, D., Wadu, M., Lootens, P., Boeckx, P. Microbial community composition and rhizodeposit-carbon assimilation in differently managed temperate grassland soils. Soil Biol. Biochem. 41, 144-153 (2009).
- Bird, J. A., Kleber, M., Torn, M. S. C-13 and N-15 stabilization dynamics in soil organic matter fractions during needle and fine root decomposition. Org. Geochem. 39, 465-477 (2008).
- Andresen, L. C., Jonasson, S., Strom, L., Michelsen, A. Uptake of pulse injected nitrogen by soil microbes and mycorrhizal and non-mycorrhizal plants in a species-diverse subarctic heath ecosystem. Plant Soil. 313, 283-295 (2008).
- Horwath, W. R., Pregitzer, K. S., Paul, E. A. C-14 Allocation in tree soil systems. Tree Physiol. 14, 1163-1176 (1994).
- Denef, K. Community shifts and carbon translocation within metabolically-active rhizosphere microorganisms in grasslands under elevated CO2. Biogeosciences. 4, 769-779 (2007).
- Pollierer, M. M., Langel, R., Korner, C., Maraun, M., Scheu, S. The underestimated importance of belowground carbon input for forest soil animal food webs. Ecol. Lett. 10, 729-736 (2007).
- Stewart, D. P. C., Metherell, A. K. Carbon (C-13) uptake and allocation in pasture plants following field pulse-labelling. Plant Soil. 210, 61-73 (1999).
- Santos, F., Torn, M. S., Bird, J. A. Biological degradation of pyrogenic organic matter in temperate forest soils. Soil Biol. Biochem. 51, 115-124 (2012).
- Bromand, S., Whalen, J. K., Janzen, H. H., Schjoerring, J. K., Ellert, B. H. A pulse-labelling method to generate 13C- enriched plant materials. Plant Soil. 235, 253-257 (2001).
- Putz, B. A simple method for in situ-labelling with 15N and 13C of grassland plant species by foliar brushing. Methods Ecol. Evol. 2, 326-332 (2011).
- Wichern, F., Mayer, J., Joergensen, R., Müller, T. Evaluation of the wick method for in situ <sup>13</sup>C and <sup>15</sup>N labelling of annual plants using sugar-urea mixtures. Plant Soil. 329, 105-115 (2010).
- Fahey, T. J. Transport of Carbon and Nitrogen Between Litter and Soil Organic Matter in a Northern Hardwood Forest. Ecosystems. 14, 326-340 (2011).
- Stewart, C. E., Paustian, K., Conant, R. T., Plante, A. F., Six, J. Soil carbon saturation: Evaluation and corroboration by long-term incubations. Soil Biol. Biochem. 40, 1741-1750 (2008).
- Fry, B. Stable Isotope Ecology. , Springer. (2006).
- Nippert, J. B., Fay, P. A., Carlisle, J. D., Knapp, A. K., Smith, M. D. Ecophysiological responses of two dominant grasses to altered temperature and precipitation regimes. Acta Oecol. Int. J. Ecol. 35, 400-408 (2009).
- Hoagland, D. R. aA., I, D. The Water-Culture Method for Growing Plants without Soil. , The College of Agriculture, University of California, Berkeley. Berkeley, CA. (1950).
- Lett, M. S., Knapp, A. K. Consequences of shrub expansion in mesic grassland: Resource alterations and graminoid responses. J. Veg. Sci. 14, 487-496 (2003).
- Knapp, A. K., Seastedt, T. R. Detritus Aaccumulation limits productivity of tallgrass prairie. Bioscience. 36, 662-668 (1986).
- Ting, K. C., Giacomelli, G. A. Solar photosynthetically active radiation transmission through greenhouse glazings. Energy Agric. 6, 121-132 (1987).
- McDermitt, D. K., Welles, J. M., Eckles, R. D. Effects of Temperature, Pressure and Water Vapor on Gas Phase Infrared Absorption by CO2. , Li-Cor, Inc.. Lincoln, NE. Forthcoming.
