Summary
I denne studien, vil bruk av en in situ lademekanisme kombinert med mikro-røntgen-computertomografi for fibrøse felles biomechanics bli diskutert. Eksperimentelle leselig identifiserbare med en samlet endring i felles biomekanikk vil inneholde: 1) reaksjonær kraft vs fortrengning, dvs. tann forskyvning innenfor kjeve kontakten og sin reaksjonære respons til lasting, 2) tredimensjonale (3D) romlig konfigurasjon og morphometrics, dvs. geometrisk Forholdet av tannen med den alveolar-kontakten, og 3) forandringer i avlesninger 1 og 2 på grunn av en endring i lastende akse, dvs. konsentriske eller eksentriske belastninger.
Abstract
Denne studien viser en roman biomekanikk testprotokoll. Fordelen med denne protokollen inkluderer bruk av en in situ lademekanisme er koplet til en høy oppløsning røntgenmikroskop, og muliggjør visualisering av interne strukturelle elementer under simulerte fysiologiske belastninger og våte betingelser. Eksperimentelle prøver vil omfatte intakt bein-periodontal ligament (PDL)-tann fibrøse ledd. Resultater vil illustrere tre viktige funksjoner i protokollen som de kan brukes til organnivå biomekanikk: 1) reaksjonær kraft vs forskyvning: tann forskyvning innenfor kjeve kontakten og sin reaksjonære respons til lasting, 2) tredimensjonale (3D) romlig konfigurasjon og morphometrics: geometriske forhold av tannen med alveolar socket, og 3) endringer i avlesninger 1 og 2 på grunn av en endring i laste aksen, dvs. fra konsentrisk til eksentriske belastninger. Effekten av den foreslåtte protokollen vil bli evaluert ved kobling mekanisk tebrodd leselig til 3D morphometrics og generelle biomekanikk i leddet. I tillegg vil denne teknikken legge vekt på behovet for å stabilisere eksperimentelle forhold, spesielt reaksjonære laster før anskaffe tomografi av fiberskjøter. Det bør bemerkes at den foreslåtte protokoll er begrenset til testing av prøvene i henhold til ex vivo betingelser, og at bruk av kontrastmidler for å visualisere bløtvev mekanisk respons kan føre til feilaktige konklusjoner om vev-og organ-nivå biomechanics.
Introduction
Flere eksperimentelle metoder fortsette å bli brukt til å undersøke biomekanikk av diarthrodial og fibrøse ledd. Metoder som er spesifikke for tann orgel biomekanikk inkluderer bruk av strekklapper 1-3, photoelasticity metoder 4, 5, moiré interferometri 6, 7, elektronisk prikkmønsteret interferometri 8, og digital bilde korrelasjon (DIC) 9-14. I denne studien, omfatter nyskapende tilnærming ikke-invasiv avbildning ved hjelp av røntgenstråler for å eksponere de indre strukturer av en fibrøs skjøt (mineralisert vev og deres grenseflater som består av mykere soner, og interfacing vev som ligamenter) ved belastning tilsvarende in vivo-betingelser. En in situ-lastinnretning koblet til en mikro-røntgenmikroskop vil bli brukt. Lasten-tid og lastforskyvning kurver vil bli samlet som molar av interesse innenfor en nyhøstet rotte hemi-kjeven er lastet. Den main mål av tilnærmingen presentert i denne studien er å understreke effekten av tredimensjonale morfologi av tann-bein ved å sammenligne forholdene på: 1) uten belastning og når lastet, og når to) konsentrisk og eksentrisk lastet. Eliminerer behovet for kutt prøver, og å utføre eksperimenter på hele intakte organer på våt veibane vil gi maksimal bevaring av 3D stresset tilstand. Dette åpner et nytt område av etterforskning i å forstå dynamiske prosesser av komplekset under ulike laste scenarier.
I denne studien, metodene for testing PDL biomekanikk innenfor en intakt fibrøs felles av en Sprague Dawley rotte, et joint ansett som en optimal bioteknologi modellsystem vil være detaljert. Eksperimenter vil inkludere simulering av tygging laster henhold hydrerte forhold for å fremheve tre viktige funksjoner i felles som de forholder seg til organnivå biomekanikk. De tre punktene vil inneholde: 1) reaksjonær kraft vs forskyvning:tann forskyvning innenfor den alveolar-kontakten og den reaksjonære respons til lasting, 2) tre-dimensjonal (3D) romlig konfigurasjon og morphometrics: geometriske forhold av tannen med den alveolar-kontakten, og 3) forandringer i avlesninger 1 og 2 på grunn av en endring i lasting aksen, dvs. fra konsentrisk til eksentriske belastninger. De tre grunnleggende avlesninger av den foreslåtte teknikk kan brukes for å undersøke den adaptive arten av leddene i virveldyr enten på grunn av endringer i funksjonelle kravene, og / eller karsykdommer. Endringer i de nevnte lettleselig, spesielt sammenhengen mellom reaksjonære laster med forskyvning, og resulterer reaksjonære load-time og last-forskyvning kurver på ulike lasterater kan brukes til å fremheve generelle endringer i felles biomekanikk. Effekten av den foreslåtte protokollen vil bli evaluert ved å koble mekaniske testleselig til 3D morphometrics og generelle biomekanikk i leddet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal bolig og aktiv dødshjelp: Alle dyr som brukes i denne demonstrasjonen ble plassert under patogen frie forhold i henhold til retningslinjene i Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) og National Institute of Health (NIH).
Gi dyrene med standard hard pellet rotte chow og vann ad lib. Avlive dyr via en to-stegs metode for karbondioksidasfyksiering, bilateral Thoracotomi i henhold til standard protokoll for UCSF som godkjent av IACUC. Utfør biomekanisk testing innen 24 timer etter dyreofringer å unngå vev degradering.
En. Utarbeidelse og Dissection av en Rat Mandible eller Maxilla
- Fjern rotte kjever ved forsiktig kuttet hinnevevet og muskelvev vedlegg samtidig bevare hele kjeven, inkludert coronoid prosessen og condylar prosessen (figur 1) 15.
- Separate hemimandibles med bilefully kutte bindevev av kjeve symfysen med en skalpell blad.
Merk: De koronar og condylar prosesser, og ramus av kjeven (Figur 1) bør fjernes hvis de fysisk hindrer biomekanisk testing av 2. molar. - Skjær fortenner uten å utsette pulpa ikke å hindre lasting av molar.
2. Prøve preparering for in situ Trykk Loading (figur 2)
- Immobilisere prøven på et stålstussen ved hjelp av et materiale som er vesentlig stivere enn den eksperimentelle prøven før den belastes i en in situ lademekanisme (figur 2A).
Merk: Polymethylmethacrylat (PMMA) ble benyttet for å immobilisere prøven i denne studien og overflødig, hvis noen, ble fjernet ved hjelp av en tannoppdagelses. - Juster okklusal overflate molar (r) av interesse parallelt med AFM metallprøveplaten ved hjelp av en rett kant på beggefly (dvs. mesial-distal og buccal-lingual).
- Lag et trau med en stump gjenstand rundt jekslene.
Merk: Denne plassen bør tjene som en "vollgrav" å inneholde overflødig væske og opprettholde vev hydrering under in situ lasting. - Forbered tannoverflaten til å bygge seg opp for konsentrisk (figur 2B) eller eksentrisk (figur 2C) lasting ved hjelp av en tann kompositt. Etse overflaten av tannen av interesse med 35% fosforsyre gel på okklusal overflate for 15 sek.
- Skyll etsemidlet grundig med deionisert vann og tørking av overflaten ved hjelp av en luft / vann-sprøyte eller en trykkluft-beholder. Med en oppdagelsesreisende, spre en dråpe av bindemiddel inn åpne cuspene i et tynt lag. Kurere kompositt med en dental herding lys.
Merk: Alle trinn som involverer kompositter bør utføres uten at direkte lys fra en lampe. Slike forhold ville uønsket akselerere polymerisasjons-prosessen, og could hindre riktig plassering av kompositt. Rombelysning er akseptabelt. - Fjern overflødig bindemiddel fra tilstøtende tennene med en fin skalpell eller barberblad.
- Plasser strømbare dental sammensatt på overflaten som følge av fremstillingen av overflaten og spre den inn i sporene til den molare (r) av interesse ved hjelp av en tannoppdagelses.
- Eksponere kompositten for dental herdelys i 30 sek.
- Mold en okklusal opphoping av omtrent 3-4 mm ved hjelp av en dental-harpiks sammensatt, fra den okklusale planet til molar (r) av interesse og lysherd i 30 sek.
- Reduser toppen av komposittoppbygning til en flat overflate parallell for å muliggjøre en jevn last ordningen i alle prøvene ved hjelp av en rett kant og en høyhastighets håndstykket.
Merk: Under biomekanisk testing, bør andre prøver lagres i tris-fosfat-bufret oppløsning (TBS) med 50 mg / ml penicillin, streptomycin og 15.
Tre. Laster Device Drift ogStivhet, Materiell eiendom Skille Capability, in situ Lasting av fibrøse Joint
- Sikre prøven med komposittoppbygning på ambolten av lastetrinn, og test for jevn belastning, som vist i figur 2B.
- Plasser en bevegelig papir på overflaten av komposittmaterialet, etterfulgt ved å laste prøven til en endelig belastning for å se etter konsentrisk eller eksentrisk belastning (figurene 2B og 2C).
- Plasser TBS-gjennomvåt Kimwipe rundt prøven for å sikre prøven hydrering. Gjør et trau rundt prøven og fyll den med TBS å holde orgelet hydrert under bildebehandling.
- Inngangstopplast og fortrengningshastighet inn i Deben programvare for å komprimere den molare til et ønsket topplast ved en fortrengningshastighet etter immobilisering av hemimandible.
Merk: Typiske avlesninger bør inneholde en reaksjonær belastningen som materialet er komprimert over tid (last svinger følsomhet = 0,1N). Fra last tid og fortrengning-tid, bør en lastforskyvningskurven for den komprimerte materiale fås 16-18. Ved hjelp av data samlet inn fra lastesykluser, kan ulike egenskaper til felles også bestemmes. Stivheten av skjøten bør beregnes ved å ta skråningen av den lineære del (omtrent de siste 30% av dataene) av lastefasen av lasten g. fortrengningskurve 19..
4. Farging av Soft Tissue, PDL, med Fosfovolframsyre (PTA)
Merk: For å forbedre X-ray demping kontrast, bør PDL bli farget med 5% PTA løsning 20.
- Tilbakefylling PTA flekker løsning i en ren 1,8 ml glass carpule og plassere lastet carpule inn sprøyte.
- Sprøyt løsningen langsomt (5 minutter / carpule) inn i PDL-rommet av tilstøtende tenner for å forhindre strukturell skade på periodontale vev rundt molar av interesse.
Merk: Punktene ovenfor bør be gjentas inntil ca 5 fulle carpules (9 ml) av oppløsningen som injiseres, og tillates å strømme inn i det omkringliggende vevet. De preparerte prøvene kan også bli gjennomvåt overnatting i den gjenværende PTA løsning (8 timer).
5. Anbefalt μ-XCT Skanneinnstillinger
Utfør m-XCT med følgende innstillinger for skanning:
| Mål Forstørrelse | 4X, 10X |
| 1800 bilder | |
| Røntgenrør spenning | 75 kVp (50 kVp for PTA farget prøvene) |
| 8 W | |
| Eksponeringstid | ~ 8-25 sek * |
| ~ 4 mikrometer (4X objektiv), ~ 2 mikrometer (10X objektiv) ** |
* Eksponeringstiden kan variere basert på geometrien og den optiske densitet av prøven og røntgenrør voltage.
** Faktiske pikslers oppløsning vil være noe forskjellig basert på konfigurasjonen av kilden, prøven, og detektoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Estimering av lademekanisme "backlash", "pushback", stivhet, og systemet drift under en konstant belastning
Tilbakeslag: Mellom laste-og losse partier av syklusen, eksisterer det en pause på 3 sekunder i løpet av hvilken tannhjul omvendt i motoren før sann lossing begynner, dvs. som prøven trekker bort fra den øvre kjeven (figur 3). Denne perioden blir referert til som et tilbakeslag i systemet, noe som representerer et segment av tid når systemet forsøker å bytte fra lukking til åpning av kjevene. Det bør bemerkes at alle lastvekslinger vil inneholde en tilsvarende klaring respons uavhengig av prøven eller belastningsforhold (figur 4). En normal belastning mot tid-kurven oppnådd ved bruk av et stivt legeme er vist i figurene 3A og 3B synliggjøre lasting, lossing, og tilbakeslag regioner på to forskjellige lOADs av 6 N og 16 N. En normal belastning g. fortrengningskurve fremheve de tilsvarende tre segmenter er vist i figur 3C.
Pushback: Mens alle tilbakeslag perioder forekommer innenfor samme 3 sek tidsrom, den reaksjonære respons og som et resultat av formen på tilbakeslag regionen kan endres avhengig av prøven. Ved testing av systemet ved hjelp av et stivt legeme (figur 3), ble den bratteste og høyeste fall i reaksjonære belastning observert i forhold til ben-PDL-tann kompleks og polydimethlysiloxane (PDMS). Men den fiber felles illustrert en betydelig nedgang i reaksjonær belastningen under tilbakeslag fase i forhold til PDMS. PDMS (figur 4) prøver viste seg å ha den minste dråpe (ingen forskjell mellom 01:05 og 01:25 tverrbindingstettheter - Figur 4A).
Stivhet: Stivhet av lasteenheten når testet against stiv kropp var betydelig høyere enn for de komplekse og PDMS prøver. Disse dataene validere effektiviteten av lademekanisme for å markere endringer i biomekanikk av bein-PDL-tann kompleks og mykere materialer (Figur 4B).
Visualisering av myke og harde vev strukturer innenfor intakt bein-PDL-tann kompleks hjelp μ-XCT: I et uplettet, men hydrert fibrøs felles, var demping av harde vev funksjoner, inkludert kjevebenet, sement, emalje og dentin markert (figur 5A og 5B). Men områder som inneholdt hovedsakelig mykere organiske stoffer var gjennomsiktig for røntgenstråler, forlater PDL-plass relativt "tom" (svart). Prøvene som ble behandlet med PTA viste økt kontrast i PDL-plass, og dermed fremhever funksjoner representant for PDL og gingival vev (Tall 5C-F). Skanning ved en høyere magnificasjon avslørt PDL som en fibernett mellom tann og bein.
Reaksjonær kraft vs forskyvning: biomekanisk respons av fibrøs leddet under in situ lasting: Sammenlignet med konsentriske lasting, eksentrisk belastning mønster på en lignende prøven viste økt forskyvning av tannen i leddet for en gitt reaksjonær belastning (Figur 6A). Imidlertid, for fibrøse skjøter behandlet med PTA ingen signifikante forskjeller i den samlede biomechanics ble observert uavhengig av lastetilstand (figur 6B). I den ubehandlede, men eksentrisk belastet system, kan den økte forskyvning av roten inn i alveolar-kontakten være korrelert til lavere stivhet som sett i den lastforskyvningskurver (figur 6C). Mens det kan være en naturlig variasjon som fører til en rekke biomekaniske responser hos fibrøse leddene høstes i kontrollgruppene, PTA-behandlede fibrøseskjøter oppviste økt stivhet og fortrenges mindre innen kontakten sammenlignet med ubehandlede motparter i en gitt reaksjonære toppbelastning. Imidlertid var det ingen påvisbar endring i form, eller varigheten av dødgang fase av lastsyklus mellom ubehandlede og PTA behandlede prøver.
Tredimensjonal romlig konfigurasjon og morphometrics: Kartlegging av bein-tann konfigurasjonen under belastede forhold ved hjelp av μ-XCT: Virtual skiver tatt fra tomografi ble sammenlignet for å illustrere en) tann bevegelse i kontakten, 2) tann-bone foreningen både i 2D og 3D , 3) den grad av bevegelse som følge av eksentrisk i forhold til konsentrisk lasting. Tann bevegelse ble fremhevet av superimposition av lignende virtuelle skiver ved tomgang og ved belastning og genererer gif-filmer. Mens både laste ordninger forårsaket tannen å fortrenge vertikalt i leddet, en eksentrisk lasting konfigurasjon (Tall 7B og 7C) caused en ytterligere rotasjonseffekten av tannen med røttene roterende distalt som resulterer i redusert PDL mellomrom langs den distale siden av rottene sammenlignet med konsentriske laste undersøkelse (figur 7 og 8). Selv om PTA-farget PDL var mer lyddempning (figur 5), bevegelsen av tannen i alveolar-kontakten i PTA behandlet leddene var mindre uttalt og korrelert med de biomekaniske data (figurene 6B og 6C).
Figur 1. En tilpasset 15 illustrasjon av sentrale steder ved utarbeidelsen av hemimandible for biomekaniske testing. Vises innenfor innfelt er et hemimandible.
Figur 2. Konfigurasjon av en in situ lasteenhet og μ-XCT system. (A) Et bilde av en in situ lademekanisme på en tilpasset holderen innen mikro-X-ray computertomografi (μ-XCT) enhet. Konsentrisk (B) og eksentrisk (c) belastningsforhold bestemmes av typen kontakt mellom ambolten og den sammensatte flate, er illustrert i form av skjematisk, og de tilsvarende forsøksoppsett (region tilsvarer den som er markert ved hvis boks (A ) hhv. Marks fra bevegelig papir bekrefte første kontakt området mellom ambolten og dental kompositt. Klikk her for å se større bilde. </ A>
Figur 3. Representant load-tid kurve illustrerer system "backlash". Load vs tid ved hjelp av en stiv kropp illustrerer tilbakeslag periode som en hendelse mellom lukking og åpning av ambolter. Den grønne region angir lasteperiode der amboltene nærmer (grønn region) for å laste et stivt legeme for å 15 N (A) og 5 N (B, innfelt). Den blå område indikerer en losse periode hvor ambolter er å trekke tilbake fra hverandre. Men på grunn av mangel på momentan motorisk respons på grunn av tiden det tar med mekanisk reversering, der ligger et lash iden periode ~ 3 sek. I løpet av denne tiden belastningen reduseres omtrent ved to N før sann lossing oppstår. Lasting og lossing hendelsene kan være relatert til å laste vs forskyvning grafs (C) som viser minimal forskyvning i løpet av tilbakeslag periode. Klikk her for å se større bilde.
Figur 4. Representative lastforskyvning kurver og «forskyvnings"-effekt ved hjelp av PDMS Bunn kurver:. Load-tidsforhold mellom PDMS med synkende monomer til tverrbindingsforhold indikerer muligheten for in situ lasteenhet for å detektere forskjeller i materialegenskaper. Topp kurver, venstre og høyre illustrerer endringen i tilbakeslag av systemet på grunn av materialgjenvinning. Den venstre og høyre side sammenlignet illustrerer den samme effekt, noe som indikerer at utvinningen forskjellen 01:25-01:05 PDMS er minimal eller ikke er innenfordeteksjonsgrenser i lademekanisme. B) Load-fortrengnings kurver for varierende materialer, inkludert stiv kropp aluminium, eksperimentelle prøven, og de tre PDMS prøver. Det er hellingen på 30% lineære delen av lastekurve som ble brukt til å beregne stivhet av materialet. Klikk her for å se større bilde.
Figur 5. X-ray virtuelle deler av kjeve andre jekslene farget for PDL struktur ekstrautstyr. (A, B) Grå skalaverdier innenfor ubehandlede jekslene indikerer X-ray demping av ulike vev, inkludert de mykere områder innenfor komplekset. Imidlertid ble nonmineralized vev som PDL ikke fremhevet på grunn av sin minimal dempende egenskapene til X-ray energi på 75 kVp. (CF) Ved å følge PTA farging av dempning og egenskapene til den mykere PDL ble forbedret og detaljer innenfor PDL ble visualisert ved hjelp av en røntgen-mikroskopi. Dermed 2D virtuelle sagittal (C-4X forstørrelse, E-10x forstørrelse) og tverrgående (D-4X forstørrelse, F-10X forstørrelse) seksjoner avslørte PDL fiber orientering (gule piler). Lumen av blodårene i endosteal mellomrom (oransje piler) og PDL (hvite piler) vises som mørke sirkulære strukturer, mens pulpal plass forblir unstained. Gjenstander som ble opprettet under farging prosedyren er også bemerket (D, rød stjerne). Klikk her for å se større bilde.
fo: src = "/ files/ftp_upload/51147/51147fig6highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51147/51147fig6.jpg" />
Figur 6. Konsentrisk og eksentrisk lastet prøver. Top (A) og bunnplater (B) illustrerer quick time filmer av tann-bone forhold ved tomgang og når lastet til 15 N, konsentrisk og eksentrisk hhv. Topp-og bunnpaneler illustrere bein-tann foreningen når ubehandlede (A) og farget (B) forhold. Midtre panelet (C) illustrerer ulike lastforskyvning atferd mellom eksentrisk og konsentrisk (venstre kurver) lastet komplekser, og farget og ufargede (høyre kurver) komplekser. Klikk her for å se større bilde.
147/51147fig7highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51147/51147fig7.jpg "/>
Figur 7. Sagittal delen av 2. molar illustrerer foreningen av tannen med kjeve kontakten når lastet konsentrisk (A) og eksentrisk (B). Flertallet av kompresjon ble sett innen interradicular (piler) og apikale (piler) regioner. Når sammenlignet med virtuelle deler av tannen i eksentrisk belastning (B), den ekstra roterende delen av tannfilm årsaker økt kompresjon til den distale side av mesial rot. Kledde tverrgående seksjoner avslørte distal oversettelse og klokken roterende bevegelse av tannen (grønne røtter) i forhold til en konsentrisk lastet tann (grå). Klikk her for å se større bilde.
Figur 8. Reconstructed 3D-filmer viser en redusert PDL-plass innenfor den distale siden av roten ved eksentrisk belastet (E) sammenlignet med en konsentrisk lastet kompleks (D). Klikk her for å vise den eksentriske lasting og klikk her for å se konsentriske lasting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det første trinnet i å etablere denne protokollen involvert evaluere stivhet av lasterammen ved å bruke en stiv kropp. Basert på resultatene, stivheten betydelig høyere muliggjør bruk av lasteanordning for videre testing av prøver med betydelig lavere stivhetsverdier. Det andre trinnet markert evne til instrumentet for å skille ulike stivhetsverdier ved hjelp av to faser av last-lossing kurve generert ved hjelp av et stivt legeme, PDMS materialer av forskjellige fornettede tettheter, og fibrøse ledd. Stivheten fra lastefasen og tilbakeforskyvnings under dødgang fasen ble anvendt for å identifisere motstanden i materialet til lasting og gjenvinning av materialet etter lossing (figurene 3 og 4). Den tredje og fjerde trinn av protokollen var til å korrelere endringer i lastfortrengningskurver oppnådd fra lastenheten til in situ avbildning utført med than bruker av røntgenstråler (figur 5). Dette innebar lasting leddene og skaffe tomografi uten last og belastning under konsentriske og eksentriske forhold hhv. Protokollen viste at ved å endre lasteakse forskjeller i nivåer av PDL-komprimering kan bli markert (figur 6 og 7). I denne diskusjonen vil vi først merke instrument funksjoner og utfordringer som bør være tilstrekkelig forstått og møtt før biomekanisk testing av bein-PDL-tann kompleks.
Utfordringer av eksperimentelle oppsettet
Composite buildup: Mens protokollen i seg selv er relativt enkelt, er det flere tiltak som må gjøres med stor forsiktighet. En av de største utfordringene var å sikre at overflødig komposittmateriale gjorde ikke overløp til nabotenner, som da ville mekanisk koble flere tenner og uriktige opplysninger om felles mekaniskics av en enkelt tann. Siden betydelig manuell fingerferdighet og kjennskap til dentalverktøy vist seg å være nyttig for denne fremgangsmåten, ble fremstillingen av prøver for lasting primært utført av tann studenter og tannleger ved hjelp av optisk forstørrelse.
Konsekvent lasting ordningen: En annen viktig detalj for biomekanisk testing var å sikre en konsekvent lasteplan. Kontaktflaten mellom kjeve av in situ lademekanisme og motstående flate av komposittmaterialet vist seg å være svært avgjørende for eksperimentet. Dette skyldes at mekanikken i det fibrøse felles kan endre seg som følge av kontaktområdet, som ble simulert i denne studien ved bruk av konsentriske og eksentriske (ubalansert) last. Scenariet presentert i denne studien etterligner mulige endringer i okklusjon av pattedyr tennene, noe som kan resultere i en endring i tann bevegelse innenfor kjeve kontakten (figur 5). Mens det er forstått that den foreslåtte testing mekanismen ikke etterligne fysiologiske tygging syklus, det presenterer seg selv som en standard testmetode. Ved å skape et komposittoppbygning med en flate som er parallell til kjeven av lastetrinn, var vi i stand til å skape en enhetlig last mønster. Denne standarden testing metoden kan brukes til å identifisere endringer i biomekanikk av bein-PDL-tann komplekser fra ulike forsøksgrupper.
Sensitivitet av in situ lademekanisme: Den eksperimentelle protokoll beskriver fremgangsmåter for å validere deteksjonsgrenser for det in situ lademekanisme ved hjelp av tre forskjellige prøver, hvorav to kan betraktes som standardmaterialer. Stivheten for lasterammen når de ble testet med aluminium var signifikant høyere med ubetydelig bidrag til den observerte mekaniske oppførselen til ulike PDMS prøver, og den biomekaniske respons av en fibrøs felles. Mens alle de prøvene som ble testet hadde et tilbakeslag periode~ 3 sek, i form av tilbakeslag parti svakt varieres (figur 4A) med typen av prøvestykket. Stive prøvene viste en kraftig nedgang i reaksjonær belastning (Tall 3A og 4A) mens mykere prøvene ikke viser en brå nedgang (Figur 4A). Det kan hevdes at forskjellen i tilbakeslag atferd er knyttet til muligheten av prøven å presse tilbake på girene under giret reversering. Den push back effekt på girene kunne manifestere i en lavere nedgang i toppen reaksjonært svar av materialet som kjeven begynner å bevege seg bort fra prøven. Således kan tilbakeslag segment kan utnyttes til å få innsikt i materialegenskap. Stivhets verdier av PDMS beregnet fra lastforskyvningskurver var i samsvar med litteraturen verdier 22, og utvalget av stivhet for krysskoblet PDMS var innenfor rekkevidden av bein-PDL-tann kompleks. Derfor er den in situ laste device er egnet for måling av forskyvning, og reaksjonære respons på tannen som det er sammenpresset til den alveolar-kontakten. Den reaksjonære svar kan være fra mykere og / eller hardere bestanddeler. Dominans av mykere bestanddel over hardere kan identifiseres ved å laste trinnvis og bildebehandling, etterfulgt av digitalt samkjøre det ingen belastning til belastede forhold til å identifisere stammedominerte områdene innenfor den bein PDL-tann kompleks 13.
Hovedbestanddelen av tygging er i aksial retning: På samme måte som mennesker, tygge syklus av rotter involverer den frie bevegelse av kjeven for å tygge maten 23, 24. Mens denne bevegelsen har blitt kartlagt til å omfatte mange forskjellige retninger som for eksempel sideveis bevegelser, er hovedbestanddelen av belastningen antatt å være i den aksiale retning 23.. Derfor ble det simulert in situ belastninger i aksial retning plasseres enten konsentriskely eller eksentrisk (figur 2).
Eksperimentelle faktorer som kan påvirke resultatene knyttet til organnivå biomekanikk: Fordelen med kobling X-ray mikroskopi med in situ lasting er at lastforskyvning kurve kan være korrelert til den romlige sammenslutning av tannen med alveolar socket, form av roten og alveolar overflate, og innsnevring og utvidelse av PDL-plass under belastning. Korrelasjonen og utfyllende evaluering gir en helhetlig tilnærming for å fastslå organ biomekanikk. I det siste, var det bare postulert at mekanikken i et organ og / eller vev kan be lastforskyvning atferd. Denne protokollen illustrert at foreningen av de bevegelige medlemmer under belastning kan også være et særtrekk ved observerte stivhet. Eventuelle endringer observert i løpet av de første 5-8 N antas å være bidratt av kvaliteten på PDL en første konformasjonsforandringer innenforkollagen og interstitiell fluid utveksling med et minimum av motstand mot belastning og denne region er blitt referert til som "uncrimping" region 26.. Laster høyere enn 7 N kunne bidratt med tann, bein, strekk-herdende effekter av periodontal ligament, og grensesnittene feste vev. Når PDL-plass er minimert og som PDL gjennomgår belastning herding, hårdvev interaksjoner mellom tannen og beinete socket oppstår ved interradicular regionen som resulterer i en brattere belastning for fortrengnings skråningen. I tillegg til materialgjenvinning, kan tilbakeslag av lasteenhet utnyttes for å undersøke den viskoelastiske natur av PDL uten å endre den felles slik det ble gjort i andre studier 16, 25.
De generelle regioner innenfor laste fortrengning kurver relateres til noen hendelser i joint. De ovennevnte hendelser er fellesnevnere mellom de to laste ordninger. Forskjellenemellom konsentriske og eksentriske last-forskyvning profiler og tilsvarende tomografi uthevet påvirkning av lastretningen på den samlede orgel biomekanikk. Den viktigste kilden til disse forskjellene var innføringen av en tann rotasjon som den fortrenger i leddet, slik at komprimeringen av PDL mellomrom på bestemte områder. Det skal forstås at normale fysiologiske belastninger påføres på tannen i flere retninger, inkludert de som innfører rotasjonstannbevegelse. Imidlertid anbefales det at en konsentrisk laste ordningen benyttes som en standard lasteordning på grunn av vanskeligheten av å anvende en "standard" eksentrisk belastning på tvers av alle prøver. Som sådan er denne eksperimentelle protokollen kan brukes for å skille biomekaniske forskjeller mellom tilpasset og nonadapted systemer.
En av ulempene ved bruk av høyere energi røntgenstråler, er at de er minimalt absorberes av mykere vev og produsert utilstrekkelig kontrast. PDL er transpnt for røntgenstråler, og som et resultat nødvendiggjør bruk av kontrastmidler. PTA forbedrer kontraster av bløtvev ved direkte farging 27-29 og åpner for visualisering ved hjelp av røntgenstråler. Derfor, ved bruk av kontrastmidler, synlig deformasjon innenfor farget bløtvev regionene mellom lastet og losset tomographies ble observert, men høyere forstørrelse (minst 10X) er anbefalt for analyse (data ikke vist). En begrensning av flekker protokollen inkluderte bruk av etanol, en mild fiksativ 29 som kunne ha endret stivhet av PDL og generelle leddmekanismene som fører til feilaktige konklusjoner.
KONKLUSJONER
Denne studien belyser en roman testprotokoll å analysere biomekaniske respons av en intakt bein-PDL-tann fibrøs felles, men under ex vivo forhold. Den beskrevne forsøksmetode inkludert post analyser av data kan anvendes til å måle virkningene av experimental variabler (dvs. sykdom, vekstfaktorer, alder og terapeutiske molekyler) på mekanikken i beinet-PDL-tann fibrøs felles. I tillegg vil resultatene fra disse forsøkene fungere som baseline for hvilke relasjoner mellom variasjoner på macroscale organ nivå kan være relatert til konkrete endringer ved vevs-og cellenivå. Begrensninger av protokollen innbefatter avbildning i henhold til ex vivo betingelser, bruk av kontrastmidler, og tap i romlig nøyaktighet mellom flatene på tannen og alveolar-kontakten på grunn av vev avslapning under lengre innhentingstider som er nødvendige for tomogram generasjon.
EKSTRA MATERIALE
Protokoll for Biomechanical testing av jekslene innenfor maxillae:
En. Hvis maxillae skulle testes, fjerner kjeve fra hver rotte skallen med den ventrale del (taket i munnen) vendt oppover. Sever muskler og ligament bindevev fralateral aspekt av hodeskallen ved å skjære gjennom vestibylen (lomme mellom tannkjøtt og kinn).
2. Palpere og brudd zygomatic prosessen av overkjevens bein i skallen og skille de kinnbuen fra overkjevens bein.
Tre. Skjær skallen rett ned med et par av bulk disseksjon saks gjennom hjernen starter fra den bløte ganen. Isoler fremre del av hodeskallen og skrelle skalp bort fra rygg aspektet (øverst) av skallen.
4. Med et par av fine disseksjon saks, skiller den høyre og venstre hemimaxillae ved å gjøre et snitt som følger en rett linje gjennom sentrum av den harde ganen og til den interproksimale området mellom fortenner. Sørg for at dybden på kuttet er grunt - bare dypt nok til å punktere den harde ganen.
5. Isoler hemimaxillae ved å lage vinkelrett (til den lange aksen av skallen) snitteneanteriort for det første molar og posterior til den tredje molar. 1) Ikke kutt altfor tett til de første og tredje jekslene for dette kan forstyrre rot struktur, 2) Ikke rive bort tannkjøttvevet rundt alle tre jeksler. Separer hemimaxillae fra hodeskallen ved å kutte tynne overkjevens bein overlegen til hver hemimaxilla. Fjern overflødig vev og benete spicules.
Validering av mekanisk testing enhet:
For å bestemme stivheten av lasterammen og drift av belastning / fortrengnings transdusere, bruker et fast legeme, for eksempel av aluminium med en elastisitetsmodul ved langt høyere enn for de eksperimentelle prøven.
For å finne ut om instrumentet er i stand til å skille ulike stivhetsverdier representant for mykere elementer, dikte PDMS blokker med ulike fornettede tettheter (01:05, 01:10, 01:25 crosslinker til basen etter vekt) og legg disse ved hjelp av sammein situ lademekanisme.
Fase Kontrast modus for kontrastforbedring av mykere elementer: Kontrast forbedring av PDL kan gjøres ved å utnytte fasekontrastmodus for skanneren. Fundamentalt, utnytter fase kontrast skanner gjenkjenning evner av et skift i fase på kantene av vev, og gir forbedret strukturell detalj. Som et resultat, i denne studien, lakuner av cementocyte-lakuner og osteocyte-lakuner fremsto som porøsitet innenfor respektive mineralisert vev. Disse strukturene ble tidligere uoppdaget i en standard skanning etter absorpsjon modus. Tomografi anskaffet under overføringsmodusen som tillates for visualisering av strukturer i negativ plass, nemlig PDL-plass og endosteal arealer inkludert Haversian kanalsystem (for 3D-modellen se figur S1). Andre strukturer i PDL-rommet kan visualiseres i tillegg, slik som blodkar som er sammenhengende med det in bein.
Ekvilibreres laster for tomogram anskaffelse og systemdrift:. Denne delen kan best forklares ved å henvise til Supplemental Figur 2 Figur S2A demonstrerer behovet for å stabilisere spisslast før anskaffe tomografi. Spisslast alltid henfalle til en lavere magnitude og systemet skal bli utlignet på minst en time før en 6-8 timers tomogram er ervervet. Det bør bemerkes at tomogram ervervet ikke er representativt for den ben-tannkrets ved toppbelastning, men ved en belastning 2-3 N lavere enn toppbelastning. I tillegg ble det målt system drift identifisert ved hjelp av en stiv aluminiums spire funnet å forandre seg med forskyvning hastighet og / eller spisslast (Figur S2B og S2C). Tilnærma drift verdiene varierte fra + 1 N / time.
Etter mekanisk testing ble det tomogram av det fibrøse ledd tatt ved ingen belastning, og til en toppbelastning på et ønsket forskyvningshastighet. Før anskaffe en tomogram henhold lastet forhold, bør man sørge for å la systemet til å komme til en likevekt (stabilitet) følgende som scanning bør fortsette. Lignende forhold ble gjentatt for eksentrisk belastede og PTA farget komplekser. Fra tomografi, ble virtuelle skiver sammenlignet med ingen belastning til belastede forhold for å identifisere tann-bone foreningen både i to-og tre dimensjoner.
Supplerende Figur 1. 3D rekonstruksjon av negativ rom ved hjelp av fasekontrastforsterket røntgenmikroskopi. Under fasekontrastforbedringsmodus faseforskyvningen som forekommer på kantene av vevet ble utnyttet for å fremheve blodkar i PDL. Spesielt absorpsjon modus (til venstre) fremhevet mineralisert vev innenfor synsfeltet, mens overføringsmodus (th) fremhevet blodårene i PDL plass også de endosteal mellomrom.
telt "> Supplemental Figur 2. Decay av peak reaksjonære krefter til en likevektstilstand før CT-scanning. Curves indikere forskjellige dempefaktorer av reaksjonært svar av en fibrøs felles (øverste panel), og en stiv kropp (nedre panel).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne erkjenner finansiering støtte NIH / NIDCR R00DE018212 (SPH), NIH/NIDCR-R01DE022032 (SPH), NIH / NIDCR T32 DE07306 (AJ, JDL), NIH / NCRR S10RR026645, (SPH) og Institutt for forebyggende og Restorative Dental Sciences og Orofacial Sciences, UCSF. I tillegg, forfatterne erkjenner Xradia Graduate Fellowship (AJ), Xradia Inc., Pleasanton, CA.
Forfatterne takker Dr. Kathryn Grand, UCSF for hennes assistanse med etterbehandling av data; Drs. Stephen Weiner og Gili Naveh, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel, Dr. Ron Shahar, The Hebrew University of Jerusalem, Israel for sine innsiktsfulle diskusjoner spesifikke for in situ lademekanisme. Forfatterne vil også takke biomaterialer og bioteknologi MicroCT Imaging Facility ved UCSF for bruk av Micro XCT og in situ lademekanisme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bard Parker Blade | BD | MEDC-001054 | |
| AFM metal disk | Ted Pella | 16218 | |
| Polymethyl methacrylate | GC America | N/A | |
| Uni-Etch | Bisco | E5502EBM | |
| Optibond Solo Plus | Kerr Corp | N/A | |
| Filtek Flow | 3M | N/A | |
| Hurculite Ultra | Kerr | 34346 | |
| Tris buffer | Mediatech Inc. | N/A | |
| Articulating paper | Parkell Inc. | ||
| Phosphotungstic Acid | Sigma Aldrich | HT152 |
References
- Popowics, T. E., Rensberger, J. M., Herring, S. W. Enamel microstructure and microstrain in the fracture of human and pig molar cusps. Arch. Oral Biol. 49, 595-605 (2004).
- Jantarat, J., Palamara, J. E., Messer, H. H. An investigation of cuspal deformation and delayed recovery after occlusal loading. J. Dent. 29, 363-370 (2001).
- Jantarat, J., Panitvisai, P., Palamara, J. E., Messer, H. H. Comparison of methods for measuring cuspal deformation in teeth. J. Dent. 29, 75-82 (2001).
- Asundi, A., Kishen, A. A strain gauge and photoelastic analysis of in vivo strain and in vitro stress distribution in human dental supporting structures. Arch. Oral Biol. 45, 543-550 (2000).
- Asundi, A., Kishen, A. Advanced digital photoelastic investigations on the tooth-bone interface. J. Biomed. Opt. 6, 224-230 (2001).
- Wang, R. Z., Weiner, S. Strain-structure relations in human teeth using Moire fringes. J. Biomech. 31, 135-141 (1998).
- Wood, J. D., Wang, R., Weiner, S., Pashley, D. H. Mapping of tooth deformation caused by moisture change using moire interferometry. Dent. Mater. 19, 159-166 (2003).
- Dong-Xu, L., et al. Modulus of elasticity of human periodontal ligament by optical measurement and numerical simulation. Angle Orthod. 81, 229-236 (2011).
- Li, J., Li, H., Fok, A. S., Watts, D. C. Multiple correlations of material parameters of light-cured dental composites. 25, 829-836 (2009).
- Zhang, D., Arola, D. D. Applications of digital image correlation to biological tissues. J. Biomed. Opt. 9, 691-699 (2004).
- Zhang, D., Mao, S., Lu, C., Romberg, E., Arola, D. Dehydration and the dynamic dimensional changes within dentin and and enamel. Dent. Mater. 25, 937-945 (2009).
- Qian, L., Todo, M., Morita, Y., Matsushita, Y., Koyano, K. Deformation analysis of the periodontium considering the viscoelasticity of the periodontal. 25, 1285-1292 (2009).
- Lin, J. D., et al. Biomechanics of a bone-periodontal ligament-tooth fibrous joint. J. Biomech. , (2012).
- Qian, L., Todo, M., Morita, Y., Matsushita, Y., Koyano, K. Deformation analysis of the periodontium considering the viscoelasticity of the periodontal. 25, 1285-1292 (2009).
- Huelke, D. F., Castelli, W. A. The blood supply of the rat mandible. Anat. Rec. 153, 335-341 (1965).
- Chiba, M., Komatsu, K. Mechanical responses of the periodontal ligament in the transverse section of the rat mandibular incisor at various velocities of loading in vitro. J. Biomech. 26, 561-570 (1993).
- Natali, A. N., et al. A visco-hyperelastic-damage constitutive model for the analysis of the biomechanical response of the periodontal ligament. J. Biomech. Eng. 130, (2008).
- Naveh, G. R., Shahar, R., Brumfeld, V., Weiner, S. Tooth movements are guided by specific contact areas between the tooth root and the jaw bone: A dynamic 3D microCT study of the rat molar. J. Struct. Biol. 177, 477-483 (2012).
- Lin, J. D., et al. Biomechanics of a bone-periodontal ligament-tooth fibrous joint. J. Biomech. 46, 443-449 (2013).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiol. 9, 11 (2009).
- Carrillo, F., et al. Nanoindentation of polydimethylsiloxane elastomers: Effect of crosslinking, work of adhesion, and fluid environment on elastic modulus (vol 20, pg 2820). J. Mater. Res. 21, 535-537 (2006).
- Hiiemae, K. M.
- Hunt, H. R., Rosen, S., Hoppert, C. A. Morphology of molar teeth and occlusion in young rats. J. Dent. Res. 49, 508-514 (1970).
- Komatsu, K., Sanctuary, C., Shibata, T., Shimada, A., Botsis, J. Stress-relaxation and microscopic dynamics of rabbit periodontal ligament. J. Biomech. 40, 634-644 (2007).
- Lin, J. D., et al. Biomechanics of a bone-periodontal ligament-tooth fibrous joint. J. Biomech. 46, 443-449 (2013).
- Quintarelli, G., Zito, R., Cifonelli, J. A.
- Quintarelli, G., Cifonelli, J. A., Zito, R.
- Quintarelli, G., Bellocci, M., Geremia, R. On phosphotungstic acid staining. IV. Selectivity of the staining reaction. J. Histochem. Cytochem. 21, 155-160 (1973).
- Crabtree, W. N., Murphy, W. M. The value of ethanol as a fixative in urinary cytology. Acta Cytol. 24, 452-455 (1980).
