Summary
Transplantation av neurala stam / progenitorceller (NPC) har stora löften i regenerativ neurologi. Den systemiska leverans av NPCs har förvandlats till en effektiv, låg invasiva, och terapeutiskt mycket effektivt protokoll för att leverera stamceller i hjärnan och ryggmärgen hos gnagare och icke-mänskliga primater som påverkas av experimentell kronisk inflammatorisk skada i det centrala nervsystemet.
Abstract
Neurala stam / precursorceller (NPC) är en lovande stamcellskälla för transplantation metoder syftar hjärn reparation eller återställande i regenerativ neurologi vid. Direktivet har uppstått ur det omfattande bevis för att hjärnan reparerar uppnås efter fokal eller systemisk NPC transplantation i flera prekliniska modeller av neurologiska sjukdomar.
Dessa experimentella data har identifierat cellleveransvägen som ett av de främsta hindren för reparativ stamcellsterapier för hjärnsjukdomar som kräver akut bedömning. Intraparenkymal stamcells ympning representerar en logisk inställning till dessa sjukdomar som kännetecknas av isolerade och tillgängliga hjärnskador såsom ryggmärgsskador och Parkinsons sjukdom. Tyvärr är denna princip dåligt tillämpliga på förhållanden som kännetecknas av en multifokal, inflammatoriska och spridas (både i tid och rum) natur, inklusive multipel skleros (MS). Som sådan hjärna inriktning efter systemic NPC leverans har blivit en låg invasiv och terapeutiskt effektiva protokoll för att leverera celler till hjärnan och ryggmärgen hos gnagare och icke-mänskliga primater som påverkas av experimentell kronisk inflammatorisk skada i det centrala nervsystemet (CNS).
Denna alternativa metod för celladministrering åberopar NPC pathotropism, specifikt deras inneboende förmåga att (i) avkänna omgivningen via funktionella celladhesionsmolekyler och inflammatoriska cytokin och kemokinreceptorer; (Ii) korsa läckande anatomiska hinder efter intravenös (iv.) Eller intracerebroventrikulär (ICV) injektion; (Iii) ackumuleras vid nivån för multipel perivaskulär ställe (n) av inflammatorisk hjärn-och ryggmärgsskada; och (iv) utövar anmärkningsvärd vävnad trofisk och immun regulatoriska effekter på olika värd målceller in vivo.
Här beskriver vi de metoder som vi har utvecklat för iv. och <em> icv leverans av syngena NPCs i möss med experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE), som modell för kronisk CNS-inflammatorisk demyelinisering, och tänka sig den systemiska stamcells leverans som en värdefull teknik för selektiv inriktning av den inflammerade hjärn i regenerativ neurologi.
Introduction
Starka bevis har uppstått från in vivo studier styrker den terapeutiska effekten av transplantation av somatiska neurala stam / föregångare celler (NPC) i djurmodeller av CNS-sjukdomar 1-8. Trots ett antal frågor i samband med leverans av stamceller i värden kräver noggrant övervägande innan dessa experimentella resultat kan omsättas i kliniska tillämpningar. En särskilt betydande hinder mot utvecklingen av (nonhematopoietic) reparativ stamcellsterapier för multifokala, kroniska inflammatoriska sjukdomar i hjärnan är identifieringen av den ideala vägen för NPC injektion. En fast förståelse av patofysiologin av den riktade sjukdomen (fokal eller multifokal, primär inflammatorisk eller primär degenerativ), och en försiktig analys av genomförbarhet och riskfrågor i samband med leveranstekniker är att identifiera den optimala protokollet för stamcells leverans.
Medan fokus (
Stort löfte fram ur de iakttagelser som NPCs riktar en intrakraniell tumör (t. ex. Gliom) i möss när det injiceras intravaskulärt utanför CNS9. Efter denna seminalin vivo-bevis för stamcells pathotrophism 10 har omfattande data som samlats avseende genomförbarhet och terapeutiska effekten av den systemiska transplantation av NPC i försöksdjur med experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE), en modell av inflammatorisk CNS-skada, via antingen intravenös (iv) eller intracerebroventrikulär (ICV.) NPC injektion 1,2,5,6,8 .. Vi har först visat att detta är beroende av förmågan att transplanterade NPCs att rikta och komma in i inflammerade CNS, och att därefter engagera flera inter kommunikationsprogram inom specifika mikromiljöer i vivo 11. För att särskilt inrikta CNS, NPCs levereras direkt i cerebrospinalvätskan (CSF) cirkulation genom icv injektion, eller i blodomloppet via intravenös injektion. När kommer in antingen i blodomloppet eller CSF, transplanterade NPCs aktivt interagera medblod-hjärn (BBB) eller blod cerebrospinalvätska (BCSFB) barriärer och ange CNS parenkymet. Denna interaktion mellan NPC transplantat och BBB (eller BCSFB) regleras av specifik uppsättning NPC yta celladhesionsmolekyler (CAM) och underlättas av uttryck av höga nivåer av CAM counter-ligander på aktiverade endotelceller / ependymalceller 12-14. Exempel på dessa kammar innefattar receptorn för hyaluronat, CD44 och intercellulär adhesionsmolekyl (ICAM) -1 liganden mycket sent antigen (VLA) -4 5,15,16 (som, i leukocyter, är ansvariga för interaktionen med aktiverad ependymala och endotelceller), och till en mycket lägre utsträckning lymfocytfunktion-associerat antigen (LFA) -1 och P-selektin glykoprotein ligand (PSGL) -1. NPC uttrycker också ett brett utbud av kemokinreceptorer, inbegripet CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3 och CXCR4 (men inte uttrycker CCR3 och CCR7), vilka är funktionellt aktiva, både in vitro och in vivo, 5,16. Sålunda systemically injicerade NPC använda dessa kammar, tillsammans med G-proteinkopplad receptor (GPCR), att ackumuleras på nivån för den inflammerade CNS. Omvänt, NPCs injiceras systemiskt i friska möss inte kommer in i CNS via kärl eller cerebrospinalvätska utrymmesvägar 2. CNS-inflammation, eller endotel / ependymal cellaktivering efter systemisk cytokin eller lypopolisaccharide (LPS) injektion som en modell för kemiskt inducerad encefalit, är därför nödvändig för ackumulering av systemiskt injicerade NPCs in i hjärnan och ryggmärgen 2. Således är framgångsrik inriktning av CNS med system NPC terapier beroende av identifiering av ett sjukdomsspecifikt fönster Möjligheternas (WoO), där hjärnan och ryggmärgen miljö bidrar till ackumulation och transendotelial migration av NPCs. Sådana förhållanden uppstår i allmänhet i samband med akut och subakut inflammation 17. En gång efter att ha gått in i CNS, transplanterade odifferentierade NPCshar visats för att förbättra klinisk-patologiska särdrag hos möss såväl som större, icke-humana primater med EAE. Detta har beskrivits att vara beroende av minsta cell ersättning 2 och märkliga utsöndring av immun reglerande och nervskyddande parakrina faktorer inom perivascular CNS 2,5,6,18 vs icke-CNS inflammerade områden 19,20 (t.ex. lymfkörtlar) som svar på inflammatorisk cellsignalering som framkallats genom infiltrering av immunceller 5.
Häri beskriver vi de viktigaste metodologiska aspekterna av systemisk injektion av somatiska NPCs i en musmodell av kronisk EAE. Mer specifikt, vi definierar de protokoll som vi har inrättats för att (i) härleda, expandera och förbereda för transplantation somatiska NPCs från subventrikulära zonen (SVZ) av vuxna C57BL / 6 möss; (Ii) inducerar kronisk EAE i dessa möss och (iii) utföra terapeutiskt verksam systemisk (iv eller icv) NPC transplantation i.nto EAE-möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla som deltar i djurförsök utförs enligt principerna för försöksdjurs vård som godkänts av den brittiska inrikesministeriet inom djuren (vetenskapliga förfaranden) Act 1986 (PPL nr 80/2457 till SP).
1. Härledning av somatisk Neural Stem / progenitorceller (NPC) från subventrikulära zonen (SVZ) i hjärnan hos vuxna möss
- Beredning av dissektionsinstrument och media
OBS: Dessa två lösningar måste beredas 1-2 timmar innan dissektioner instrument är redo och förvärmt vid 37 º C i minst 20-30 minuter före användning (det hjälper till att späda papain och optimerar enzymaktivitet).- Autoklav en rak vass sax, en liten kirurgisk sax och två små böjda sågtandade pincett.
- "Digestion" lösning: Bered två separata 50 ml rör med:
Lösning # 1: 25 ml Earles balanserade saltlösning (EBSS) + 10 mg etylendiamintetraättiksyra (EDTA) + 10 mg L-cystein;och
Lösning # 2: 25 ml EBSS + 50 mg papain. - Förbered "Complete Growth Medium" (CGM): fullständigt mus basmedium med mus proliferations tillskott, heparin 0,002%, basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF, 10 ng / ml), epidermal tillväxtfaktor (EGF, 20 ng / ml) och antibiotika (Penna / Strep).
- Brain dissektion
OBS: Borttagandet av de tidsmässiga ben kan lätt skada vävnaden på grund av sin skärpa. För att undvika detta, stadigt fästa benen med pincett och dra ut tills hela benet har tagits bort.- För varje beredning av NPC: er, utgallring av halsdislokation n = 5-7, 4-8 veckor gamla C57BL / 6 möss.
- Tvätta med 70% etanol (i vatten) i håret av de utgallrade möss och skär bakom öronen med rak vass sax för att avlägsna huvudet;
- Gör ett mittlinjesnitt med en liten kirurgisk sax för att skära in i huden över skallen. Med hjälp av pincett, vika upp de två fläckar på huden på mässore skallen.
- Med den lilla kirurgiska sax utföra två små snitt vid basen av skallen och ta bort benen under pons / medulla (ventrala skallen). Fortsätt genom att dra ut de tidsmässiga ben. Med samma scissor utföra ett snitt längs hela skallen, med start från basen till lökarna, utan att skada ytan av hjärnan. Dessutom utför ett snitt mellan de främre ben och ögon, för att underlätta avlägsnandet av de parietalben. Med två pincett börja ta bort skallen genom att dra varje parietalben mot utsidan. Medan du drar, uppmärksamma hjärnhinnorna, vilket kan skada hjärnan när benen tas bort.
- När skallen har avlägsnats skjuter tången mellan hjärnan och skallen för att fullständigt lösgöra hjärnhinnorna kvar. Lyft försiktigt upp hjärnan från skallen. Skär synnerverna att släppa hjärnan och slutligen samla hjärnan i en tub med kall fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
- Håll röret på is ettd upprepa samma procedur för alla möss.
- Dissektion av SVZ, neurosfären bildning och underhållsanalyser
Genomsnittligt antal celler x utspädningsfaktor x 10 4
Vart 10 4 representerar omvandlingen av den totala volymen av den hematocytometer kammaren (total volym = 0,1 mm 3 -> 10-4 cm 3 -> 10-4 ml). När man beaktar utspädningsfaktorn, både den som sker med CGM och med den avgörande fläcken måste beaktas. Som ett exempel, om 160 celler har räknats i de 4 hörn torg, kommer den slutliga densitet (celler / ml) av cellsuspensionen vara:
160/4 x 5 (utspädning med CGM) x 2 (spädning med vital fläck) x 10 4- Slå på en dissektion huva försedd med ett dissektionsmikroskop.
- Rengör alla ytor med 70% etanol (i vatten), och spraya med en anti Mycoplasma lösning för att minska risken för kontaminering.
- Skalner i en bägare med steril gasbinda (för att bevara vässade instrument) och fyll den med 70% etanol (i vatten). Blötlägg i bägaren två par pincett, ett par mikro sax och en kirurgisk kniv.
- Placera hela hjärnan på hjärnan-slicer matris.
- Med hjälp av två rakblad utför en coronal sektione 2 mm från den främre stolpen av hjärnan, med undantag av de optiska skrifter, och 3 mm posteriort om tidigare skär; och placera vävnaden på en ren petriskål.
- Under dissekera mikroskop isolera SVZ vävnad och skär i 1 mm 3 bitar med hjälp iridectomy sax. Upprepa för alla hjärnor.
- Blanda väl de två lösningarna (avsnitt 1.1.2) ovan och filtrera genom ett 0,22 ìm filter direkt efter hjärnan dissekeras och SVZs är redo att brytas ned.
- Överför sektioner i 30 ml "Digestion"-lösning, försiktigt resuspendera med a10 ml pipett och inkubera 30 minuter vid 37 ° C i 5% CO2. Var 15 minuter försiktigt skaka röret 2-3x.
- Centrifugera vid 300 x g under 10 min.
- Avlägsna supernatanten och suspendera pelleten i 200 l av CGM genom att pipettera först med en P1000 och sedan med en P200 pipett (10-20x vardera), till dess att erhålla en enda cell suspension.
- Ta suspensionen upp till 5 ml med CGM och överför till en T25 cm 2 kolv.
- Efter 5-7 dagar in vitro (DIV) neurospheres bildas. Samla suspensionen i ett 15 ml rör och centrifugera i 10 min vid 150 x g..
- Avlägsna supernatanten och suspendera pelleten i 200 l av CGM.
Dissociera neurospheres mekaniskt genom att passera de celler 100-150x med en P200 pipett, till dess att erhålla en enda cell fjädring och ta upp till 1 ml med CGM. - Späd cellsuspensionen, t ex 10 | il av cellsuspension i 40 | il av CGM för erhållande av en 1:05 spädning, och blanda väl. Blanda 10 pl av dilute cellsuspension med 10 l av en vital fläck och blanda väl.
- Fyll en hemocytometer räkningskammare med 10 pl av en 1:1 cellsuspension: vital fläck lösning. Separat räkna antalet levande (vita) och döda (blå) celler i de 4 hörnrutorna. För att bestämma antalet celler / ml, tillämpa följande beräkning:
- Resuspendera 2 x 10 5 celler i 5 ml av CGM och överföring till en T25 cm 2 kolv;
- Upprepa avsnitt 1.3.11-1.3.12 varje 4-5 DIV. Från den andra passagen av expansionen framåt, bedöma cellulära livskraft genom vital fläck utslagning och börja bygga upp en kontinuerlig tillväxtkurva genom plätering NPCs vid klonal densitet (8,000 celler/cm2), enligt beskrivning 21. Behåll cellnummer och upprepa proceduren varje 4-5 DIV. För att generera en kontinuerlig tillväxtkurva, gör så här:
OBS: Om du vill ha en bra cell förberedelse, efter 4-5 DIV sfärer borde ha nått en diameter på 150-200 nm. För att ha en god uppskattning av than celltäthet, är det viktigt att hitta en optimal spädningsfaktor för att få väl fördelade, nonoverlapping celler i hela hematocytometer. Helst bör det finnas mellan 50 till 200 totala celler. Vid räkning av endast de celler som ingår i det kvadratiska utan att röra vid gränserna måste beaktas. Dessutom, är livskraften i cellerna en avgörande faktor för att ha en sund förberedelse. Huvudsakligen bör det vara större av 90%. En linjär tillväxtkurva är en annan indikator på en frisk cellberedning.- Räkna antalet levande och döda celler (t ex 1,3 x 10 6).
- Definiera ökningstakten dividera antalet levande celler med antalet strukna cellerna (t.ex. 1,3 x 10 6/2 x 10 5 = 6,5).
- Beräkna det totala antalet celler genom att multiplicera den genomsnittliga tillväxten för det totala antalet celler närvarande vid föregående tidpunkt (i början = 2 x 10 5).
- Redovisa genomsnittet7; standardavvikelse för att bygga upp en linjär trendlinje.
- Från och passagen 6, är mekanisk dissociation ersätts av enzymatisk dissociation. Efter centrifugering vid 150 x g under 10 min, avlägsna supernatanten, återsuspendera pelleten i 200 | il av cellaggregat dissociationslösning, resuspendera 7-8x med en P200 och inkubera 10 minuter vid 37 ° C, 5% CO2.
- Resuspendera 7-8x med en P200 för att erhålla en enkelcellsuspension och tillsätt 800 pl av CGM. Räkna celler (både levande och döda) och etablera sin livskraft. Resuspendera 2 x 10 5 celler i 5 ml CGM och överföring till en T25 cm 2 kolv.
- Viral transduktion av NPCs för in vivo-spårning cell
OBS: För att kontrollera effektiviteten av viral transduktion, bygga en parallell tillväxtkurva med omvandlade och nontransduced NPCs. Dessutom är klonal effektivitet, är att det absoluta antalet neurosfärbildande celler närvarande i en cell beredning eller ett cellcykelanalys av DNA-innehåll (med propidiumjodid, PI), kan användas som ytterligare indikationer av cellstatus. Om andelen infekterade celler inte ska vara bra, kan protokollet av viral transduktion upprepas en andra gång med samma population av celler. När nivån av infektion är tillfredsställande och tillväxtkurvan är liknande den som erhölls med vild typ celler kan transducerade NPC utökas och / eller transplanteras.- Skörda neurosfärer och erhålla en enkelcellsuspension. Plate cellerna vid hög densitet (1,5 x 10 6 celler i en T75 cm 2 kolv) i 10 ml CGM.
- Efter 12 tim till 3 x 10 6 TU / ml av en tredje generationens lentivirusvektor pRRLsin. PPT-hCMV konstruerad med E. coli-härlett β-galaktosidas (lacZ) eller med grönt fluorescerande protein (GFP).
- 48 h senare, skörda cellerna, centrifugera vid 300 xg under 10 minuter och förnyad utbredning cellerna vid ett 1:01 förhållande.
- Efter3 passager in vitro kontrollera effektiviteten av infektionen. Flödescytometri används allmänt för att testa infektion effekt och en tillfredsställande nivå av infektion är allmänt accepterat att vara i intervallet från 75 till 95% av positiva celler. Kontrollera igen effektiviteten av infektion efter tre ytterligare passager av expansion för att kontrollera bibehållandet av marköruttryck.
- Neurosfär frysning
- Skörda neurospheres från en T25 cm 2 kolv, centrifugera vid 300 xg under 10 minuter, och kassera supernatanten.
- Resuspendera pelleten med 1 ml frysmedium (CGM med 10% dimetylsulfoxid (DMSO).
- Placera kryobehållare vid -80 ° C i en frysbehållare.
- Efter minst 24 tim flytta cellerna till en cryobox och förvara vid -80 ° C i flera månader, eller tillföra flytande kväve (N 2) för längre förvaring.
- Neurosfär tining
OBS: För att undvika de toxiska effekterna av långvarig kontakt of NPCs med DMSO, måste upptiningsprocessen vara så snabb som möjligt.- Avlägsna köldkärlet från -80 ° C / N-2 och hålla den på torris.
- Snabbt tina flaskan på ett vattenbad, tills nästan all cellsuspensionen tinas och endast en liten bit av iskallt suspension är.
- Resuspendera cellsuspension med 5 ml av förvärmt färskt CGM.
- Centrifugera vid 300 x g under 10 min.
- Avlägsna supernatanten, resuspendera försiktigt med 5 ml färsk CGM plattan cellsuspensionen i en ren, obehandlad T25 cm 2 kolv.
- 1.7) NPC karakterisering
Anmärkning: Den sista tvättn PBS kan ersättas med 0,05% natriumazid-PBS för att förhindra svamptillväxt eller kontamineringar, och coverslides lagras vid 4 ° C under 2-3 veckor.
OBS: För att färga för intracellulära markörer lägga en permeabilisering agent till PBS i den blockerande lösningen. Om källan för den primära antikroppen är get, bovint serum Albumin (BSA) eller serum från annat än get bör användas.
OBS: För att färga för intracellulära markörer använder en permeabilisering agent i den primära antikroppen lösningen.- Placera en 13 mm glas coverslide på botten av en 24-brunnsplatta. Addera 150 pl av beläggningslösningen på toppen av varje coverslide att skapa en liten droppe. Inkubera under minst 30 minuter vid 37 ° C, 5% CO2.
- Skörda neurosfärer och dissocieras för att erhålla en enkelcellsuspension.
- Räkna levande celler och späd att erhålla 80.000 cells/35 pl. Ta bort överskottet av beläggningslösningen från coverslide genom försiktig uppsugning, och platta de 35 l av cellsuspension.
- Inkubera 25 minuter vid 37 ° C, CO 5% 2. Snabbt kontrollera vid kontrastfasen mikroskop om cellerna har börjat följa.
- Förbered differentieringsmediet genom att blanda basal mus medium med lämpliga tillägg (se tabell 1) och antibiotika (Pen / Strep).
- Addera 400 pl av differentieringsmedium och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2.
- Efter 3 DIV, förändring hälften av mediet med färskt differentieringsmedium.
- Efter 6 DIV, avlägsna mediet och tvätta en gång med PBS. Enligt ett dragskåp avlägsna PBS och till 300 ul av förvärmd 4% paraformaldehyd (PFA) 4% sackaros. Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur (RT). Ta av PFA och tvätta 3x med PBS.
- För att fortsätta med immuncytokemi, ta bort PBS och blockera med PBS 10% normalt getserum (NGS) (blockeringslösning), och inkubera i 1 timme vid RT.
- Avlägsna den blockerande lösningen och tillsätt önskad primär antikropp utspädd med PBS 1% NGS. Inkubera vid 4 ° CO / N eller alternativt 120 min vid rumstemperatur.
- Efter inkubationen tvättas 2x med PBS. Inkubera med lämplig sekundär antikropp utspädd med PBS-1% NGS. Inkubera 60 min vid RT.
- Tvätta 2x med PBS och kontra färga kärnor med 4 ',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) spädd 1:20.000 med PBS permeabilisering medel för 3 min vid RT i mörker. Tvätta två gånger med PBS och en gång med destillerat vatten.
- Sätt en droppe monteringsmedium på ett glasfilt bild och med pincett montera coverslide med cellerna inför monteringsmedium. Tryck försiktigt coverslide att pressa ut överskottet av monteringsmedel. Låt coverslide i mörker vid RT tills monteringsmedium torkas och förvaras vid 4 ° C.
2. Myelin Oligodendrocyte glykoprotein (MOG)-inducerad Experimental Autoimmunitet i C57BL / 6 möss
- Framställning av emulsion
- På en glasbägare förbereda en emulsion bestående av ofullständigt Freunds adjuvans innehållande 4 mg / ml Mycobacterium tuberculosis [annars definieras som fullständigt Freunds adjuvans (CFA)] och 200 pg av MOG (peptid 35-55), med tanke på att den totala mängden emulsion per mus blir 300 pl.
OBS: anslagte kontroller av MOG-immuniserade möss i CFA är möss immuniserade med endast CFA. Den förväntade variansen i sjukdomsdebut i MOG-immuniserade möss är 11,3 (± 1,8) dpi.
OBS: Vid beräkning av den totala volymen av emulsion som behövs, anser dubbelt så mycket volym som antalet möss för att vaccinera. Glas bör föredraget att plasten för att minimera avfall av en del av emulsionen.- Med en glasspruta som innehar en 19 G nål blandning under ca 30 min, att alltid hålla emulsionen på is.
- För att kontrollera om emulsionen är klar, släppa en liten mängd emulsion på vatten. Emulsionen är färdig att injiceras endast om droppen förblir som den är och inte dispergeras.
- Immunisera kontrollgruppen av möss med enbart CFA. Behandla experimentella möss (MOG immuniserade) med MOG i CFA. Den förväntade variansen i sjukdomsdebut i MOG immuniserade möss är 11,3 (± 1,8) dpi.
- Överför 19 G nål till en 1 ml plastspruta ennd aspirera emulsionen. Undvik bubblor, byta nål med en 25 G och låt sprutan på is. Sprutor fyllda med emulsionen är redo att användas och bör hållas på is i ett par timmar.
- På en glasbägare förbereda en emulsion bestående av ofullständigt Freunds adjuvans innehållande 4 mg / ml Mycobacterium tuberculosis [annars definieras som fullständigt Freunds adjuvans (CFA)] och 200 pg av MOG (peptid 35-55), med tanke på att den totala mängden emulsion per mus blir 300 pl.
- Immunisering
- Placera möss (6-8 veckor gamla, kvinnliga) i en värmande låda och vänta ca 10 minuter för att låta svansvenen att vidgas.
- För över en mus från uppvärmningen rutan till en mus rainer. Stäng rainer att undvika varje förflyttning av musen.
- Fyll en spruta 1 ml insulin med 100 pl av pertussistoxin (5 mikrogram / ml) undviker att göra bubblor. Injicera långsamt lösningen i svansvenen. Ta bort nålen och trycker på några sekunder med ett papper att plugga blödningen.
- Placera musen tillbaka i buren och upprepa samma procedur för alla mössen.
- Bedöva en mus med kontinuerlig isofluran inandning (1-2%, 2 l / min) och injicera 100 | il av emulsionen subkutant vid nivånav de två sidorna och basen av svansen (300 | il emulsion / mus). Långsamt ta bort sprutan, undvika läckage av emulsionen.
- Markera musen med ett öra hålslag, placera mössen i buren och kolla tills fullständig återhämtning. Upprepa för alla möss.
- Efter 48 timmar (2 dagar efter immunisering, dpi) upprepa avsnitt 2.2.3.
- Beteendeanalys av EAE-möss
- Från och med 5 dpi, väga mössen dagligen och övervaka sina rörelseapparaten föreställningar med hjälp av skalan poängsystem som beskrivs i tabell 1.
3. Injektion av neurala stam / progenitorceller i svansvenen (iv)
- Cell framställning
- Harvest neurosfärer genom centrifugering vid 300 x g under 10 min.
- Avlägsna supernatanten och tillsätt 200 | il av cellaggregat dissociationslösning. Inkubera 10 minuter vid 37 ° C, CO 5% 2.
- Försiktigt resuspendera 10-12x (avoiding bubblor) med en P200 tills erhålla en enda cellsuspension och ta till 800 l med basal medium utan Ca 2 + och Mg 2 +.
- Räkna celler med hjälp av en vital fläck för analys cellviabiliteten och späda suspensionen med basalt medium utan Ca 2 + och Mg 2 + för att erhålla en slutlig densitet av 10 6 cells/150 | il. Håll cellsuspensionen på is fram till användning.
- NPC intravenös injektion
OBS: Den ideala dissociation i en enda cell fjädring och avsaknaden av luftbubblor är två viktiga aspekter att tänka på för att minska risken för antingen klumpar / aggregat vs emboli bildning som kan leda till venocklusion och därmed död.- På toppen av sjukdomen (16-18 dpi), väga och poäng mössen. Fördela möss enligt sina poäng för att få homogena grupper.
- Placera mössen i en värmande låda och vänta ca 10 minuter för att låta svansvenen att vidgas. För över en mus från uppvärmningen rutan till en mus rainer. Stäng rainer att undvika varje förflyttning av musen.
- Fyll en spruta 1 ml insulin med 150 l av cellsuspension och se till att ta bort alla bubblor. Injicera långsamt lösningen i svansvenen. Ta bort nålen och trycker på några sekunder med en bit papper att ansluta blödning (fig. 6A och 6B).
- Placera musen i buren och kolla till återhämtning. Upprepa samma procedur för alla möss.
4. Injektion av neurala stam / progenitorceller i Cisterna Magna (ICV)
- Cell framställning
- Harvest NPC genom centrifugering vid 300 x g under 10 min.
- Avlägsna supernatanten och tillsätt 200 | il av cellaggregat dissociationslösning. Inkubera 10 minuter vid 37 ° C, CO 5% 2.
- Försiktigt resuspendera 10-12x med en P200 tills erhålla ett enda cell fjädring och ta till 800 l med basal medium utan Ca 2 + och Mg 2 +.
- Räkna celler och späd ut suspensionen med basalt medium utan Ca 2 + och Mg 2 + för att erhålla den önskade celltätheten. Håll cellsuspensionen på is fram till användning.
- 4.2) NPC icv injektion
- På toppen av sjukdomen (16-18 dpi), väga och poäng mössen. Fördela möss enligt sina poäng för att få homogena grupper.
- Placera musen på en stereotaktisk apparat under kontinuerlig isofluran inandning (1-2%, 2 L / min). Fäst huvudet av musen med örat barer. Justera därefter både mun och näsa bitar. Se till att huvudet av musen är plan och fast.
- Tvätta huvudet av musen med povidon-jod (PVP-I) och göra ett snitt för att skära in i huden i den bakre delen av huvudet för att exponera skallen.
- Med hjälp av en mikromanipulator, in spetsen på en mikroliteriter sprutan i klyftan mellan nackknöl och atlas kotan genom de intakta muskler och ligament i mittlinjen på baksidan av halsen. Den böjda delen av nålen hålls i nära kontakt med den inre ytan av occiput för hela längden, såsom beskrivits 22.
- Långsamt in nålen och vänta några sekunder. Operatören är tänkt att lära sig att känna igen känslan av nålen att vara "hooked" till musen skalle, före start injicera cellpreparatet. Injicera långsamt volymen av celler (inom 3-5 minuter). Låt nålen på plats under ytterligare några sekunder efter injektionen och avlägsna långsamt sprutan.
- Sy upp huden och placera musen i en återhämtning bur tills fullständig återhämtning.
5. Vävnadsbearbetning
- Djupt söva möss med en blandning av 0,5 ml ketamin (100 mg / ml), 0,25 ml xylazin (23,32 mg / ml) och 4,25 ml sterilt vatten och transcardically BEGJUTA, vföraskning med saltlösning-EDTA och fastställande med 4% PFA. Ta bort både ryggrad och hjärna och postfix i 4% PFA i 12 timmar vid 4 ° C. Tvätta vävnaden i PBS, avlägsna de ryggmärg från benen och lämnar vävnaden åtminstone 48 h i 30% sackaros (i PBS) vid 4 ° C. Bädda vävnader i optimal skärtemperatur (oktober) förening och knäppa frysa med flytande kväve, som beskrivs 2.
- Använd en mikrotom för att skära vävnader på 10-12 mikrometer tjocka skivor.
- Alternativt bädda frisk vävnad i agaros och skära vävnad med hjälp av en vibratome 50-80 ìm tjocka skivor.
- I de båda fall, inkubera O / N vid 37 ° C i 5-brom-4-klor-3-indolyl-β D-galaktopyranosid (X-gal)-lösning för att detektera kärn-β-galaktosidasaktivitet.
- Recut sektioner innehållande β-gal + celler till 5 | im skivor och dubbel fläck med användning antiglial fibrillärt surt protein (GFAP) för astrocyter (50 | ig / ml), antineuronal nukleär antigen (NeuN) för neuroner (1 &# 956, g / ml) och antiNestin för odifferentierade neurala celler (10 | ig / ml).
- Fortsätt enligt beskrivningen i avsnitten 1.7.11 och 1.7.12. För flera färgningar se till att använda sekundära antikroppar konjugerade med olika fluoroforer.
- För vävnader som innehåller GFP märkta celler fortsätta som förklaras i steg från 5,1 till 5,3 och fortsätt med de många färgningar.
- Lägg några droppar monteringsmedium på objektglas och täck med en vävnadstäckglas.
- För sektioner färgade med biotin konjugerade antikroppar förbereda en lösning av avidin biotin komplex (ABC-lösning, se tabell 2) och lämna in agitation i 45 min.
- Inkubera skivor 5 min med 1% H 2 O 2 för att blockera aktiviteten av endogent peroxidas.
- Tvätta två gånger med PBS.
- Inkubera med ABC-lösning under 1 timme vid RT.
- Tvätta två gånger med PBS.
- Inkubera med 3,3 '-diaminobensidin-lösning och 0,3% H 2 O 2. Övervaka reaktionen under mikroskop och tvätta med PBS så fort skivan börjar få brun (vanligtvis runt 5-10 min).
- Tvätta två gånger med PBS och fortsätt enligt beskrivningen i steg 5.7.
Omfattande lista över material och reagens visas i tabell 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
NPC härledning och karakterisering
SVZ dissektioner utförs på pooler (n = 5-7 möss / pool) av 6-8 veckor gamla C57BL / 6 möss med hjälp av mekanisk och enzymatisk dissociation (Figur 1A). Efter några dagars odling i CGM, fritt flytande neurosfärer börjar bilda (fig. 1A och 1B). Primära sfärer samlas och mekaniskt passe varje 4-5 DIV. Vid passage, är antalet levande och döda celler konstaterats och kumulativa cell nummer ritas för att generera en tillväxtkurva (Figur 1C). Detta ger en indikation på utbredningshastigheten, vilket ger en indirekt parameter för att utvärdera den övergripande stabiliteten av NPC beredning. När prolifererande som neurosfärer, NPC uttrycka markörer av mitotisk aktivitet (fosfo-histon H3, phh3, 5 | ig / ml) och av odifferentierade neurala celler (t.ex. Nestin) (Figur 2A). Odifferentierade NPC som är för att vara terapeutiskt efficacious i EAE efter transplantation måste uttrycka cellyte-adhesionsmolekyler som inkluderar CD44 (5 pg / ml), den α4 subenheten av VLA-4 (10 ^ g / ml) (figur 2F). När pläterade under lämpliga differentieringsvillkor, NPC uttrycka markörer som är typiska för de tre neuronala härstamningar, (figur 2b), såsom astroglial markör GFAP (Figur 2C), den neuronala markören mikrotubulus associerat protein-2 (MAP-2, 5 | ig / ml ) (figur 2D) och oligodendrogliala markörer O4 (5 | ig / ml) och basiskt myelinprotein (MBP, 10 | ig / ml) (Figur 2E), vilket bekräftar att NPC är multipotenta i riktning mot de tre huvudsakliga neuronala härstamningar. För att underlätta identifieringen av transplanterade celler in vivo, är NPCs omvandlas med lentivirus engineered till stabilt expressrapportgener såsom GFP. Transducerade NPC uttrycka GFP både som prolifererande neurosfärer (fig. 3A och 3C) såväl som när differentiera in vitro vid tillväxtfaktor indragning (figur 3B). För att kontrollera effektiviteten i transduktion, är uttrycket av GFP analyseras med flödescytometri, med början så tidigt som 3 passager efter cellöverföring (som ger tillräckligt med tid för att ha robusta uttryck av den införda transgenen på proteinnivå). Vid tillämpning av tredje generationens lentiviruses till NPCs in vitro, vi konsekvent iaktta> 90% av cellerna som uppvisar höga halter av GFP över flera oberoende experiment (figur 3C), med varken uppenbar toxicitet eller förändringar i spridning, när man jämför tillväxtkurvorna för vild typ och lenti-GFP-transducerade NPC (Figur 3D).
Kronisk EAE-induktion
EAE är en av de bäst karakteriserade modeller av MS, eftersom den rekapitulerar de flesta av de patologiska och kliniska händelser hos MS. Immunisering av C57BL / 6 möss med MOG35-55 leder till UTVECKLINGt av en kronisk form av EAE. När man närmar sig sjukdomsdebut (11,3 ± 1,8 dpi) under induktionsfasen (preklinisk), MOG immuniserade möss börja förlora vikt (Figur 4A). I början av den effektor / invasion fas (topp klinisk, 16,8 ± 3,2 dpi) EAE-möss nå toppen av sjukdomen (poäng 3,5 ± 0,7), och strax efter en topp de visar en progressiv och partiell återhämtning som slutligen stabiliseras under den kroniska fas (stabil klinisk) från cirka 30 dpi och framåt (betyg 2,8 ± 0,9) (Figur 4B). Ett flertal studier, bland annat en del undersöker EAE antingen intravital mikroskopi 23 eller magnetisk resonanstomografi 24, parat med in vivo vävnadspatologi, har identifierats i toppen av effektor / invasion fas (16-22 dpi) den perfekta gyllene tillfälle (WoO) på sig att utföra systematiska experimentella behandlingar med stamceller avsedda att komma in i kroniskt inflammerad EAE CNS och skydda den från sekundär dkada.
NPC injektion
Syngena NPCs injicerade system i EAE-möss (Figur 6) återfinns nästan uteslutande i perivaskulära områden av CNS-skador, både i hjärnan (Figur 5A) och ryggmärgen (figur 5B-D), upp till 45 dagar efter transplantation (dpt), såsom beskrivits 5. iv. injiceras NPCs företrädesvis behålla en omogen, Nestin + (figur 5C) fenotyp, medan några NPCs flyttar ut ur den perivaskulära området uttrycker Neun (Figur 5D). Notera NPCs injiceras iv i friska kontroller misslyckas med att komma in i CNS via kärlvägen (Figur 5E). Efter iv NPC injektion, är ett betydande antal injicerade NPCs på nivån av icke-CNS-organ såsom lever, tarm, mjälte, lungor och njurar, men inte hjärtat, så tidigt som 10 dpt (figur 5F). Icke-CNS ackumulerande NPCs är helt rensas ur thes e perifera organ med 30 dpt (figur 5G).
B, Neurosfärer in vitro. C Figur 1. Isolering av NPC från SVZ av vuxna möss och generering av stabilt expander NPC linjer. A, Schematisk representation av de viktigaste kritiska stegen av generering av stabilt expanderbar, och beredning av injicerbara mus NPC. , odlade NPCs som neurospheres pass var 4-5 dagar. Antal levande och döda celler samlas och kumulativa cell nummer ritas för att generera en tillväxtkurva. Skalan bar i B är 200 nm. Data i C är genomsnittliga kumulativa antalet celler ± SD (n = 3).
gur 2 "fo: innehåll-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/51154/51154fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51154/51154fig2.jpg "/>
Figur 2. NPCs karakterisering. A, förökar mus neurospheres uttrycker phh3 kärn histon protein (grön), och typ VI intermediära filament protein Nestin (röd). BE, Efter 6 DIV i differentieringsförhållanden, NPCs är multi mot astroglial (GFAP, röd i C), neuronal (MAP-2, grön i D) och oligodendroglial (O4, gröna i E, och MBP, röd i E) härstamningar. Kvantifiering av GFAP-, MAP-2-och O4-uttryckande celler vid 6 DIV efter NPC differentiering in vitro har visat i B. Data i B är såsom medelvärde% ± SD (n = 3). Skalans streck i CE är 50 | im. F, flödescytometrianalys av uttrycket av de huvudsakliga cellyteadhesionsmolekyler reglerar leukocyte extravasering i mus neurosfärer. Figur 2F reproduceras från Pluchino et al. 2
Figur 3. Transduktion av NPC med lentivirus uttrycker reportergener (t ex GFP. A och B, faskontrast bilder av neurosfärer (A) och differentierande NPC (B) som har omvandlats med en 3: e generationens lenti-GFP-vektorn. Flödescytometrianalys av NPC i A. C, Vildtyp (ej transducerade) och lenti-GFP-transducerade NPC odlas som neurosfärer passerades var 4-5 dagar. Antal levande och döda celler uppsamlas och kumulativa cellantal plottas för att generera en tillväxtkurva. Skalan bar iA och B är 200 | im. Data i C är genomsnittliga kumulativa antalet celler ± SD (n = 3).
Figur 4. Funktionell karakterisering av kronisk EAE. A, daglig vikt övervakning i MOG-och CFA-immuniserade C57BL / 6 möss över en total uppföljning av 40 dpi. B, Daily EAE poäng övervakning i MOG-och CFA-immuniserade C57BL / 6 möss över en total uppföljning av 40 dpi . Data uttrycks som medelvärden tal ± SD (n = 10 möss / grupp).
Figur 5. Systemiskt injiceras NPC stråt i parenkymet av EAE-möss. AE, X-gal-färgning av vibratom-snitt (70 pm) hjärna (A) och ryggmärgen (B) vävnadssnitt från EAE-möss injicerades iv med syngena NPC och visar transplanterade β-gal +-celler ( blå celler) kvarstår inom perivaskulära CNS-områden fram till slutet av den kliniska uppföljningen (106 dpi). C, β-gal + iv.-injicerade NPC: er (blå) kvarstår inom perivaskulära CNS-områden, behåller en Nestin + (brun) fenotyp. D , Några flytt NPCs uttrycker Neun + (brun) så länge de rör sig ut ur den perivaskulära området. E, X-gal-färgning i ett representativt ryggmärgen avsnitt från en bluff-behandlad EAE-mus. . Skala barer, FG, Analys av andra än CNS vävnader visar 20 nm som IC -. Eller iv.-Injicerade NPC: er (blå celler) når nästan alla organ (. T.ex. lunga, lever, mjälte, hjärta, tarm, njure) within 10 dpt (F), men rensas från samma organ med 30 dpt (G). Figurerna 5A-E är hämtad från referens 5, medan figur 5F-G reproduceras från Pluchino et al. 2
. Figur 6 Schematisk bild av protokollet för systemisk injektion av NPCs i möss med EAE Huvud kritiska stegen i systemisk injektion av NPCs i möss med EAE:. Från beredningen av injicerbara CAM uttrycka enda cell dissocierade NPCs cellodlingsrummet (A) , till injektion i svansvenen hos EAE-möss på toppen av fasen effektor / invasion sjukdom (B), i riktning mot detekteringen in vivo av de injicerade NPC: er som har riktat inCNS (C), till vävnads patologiska studier in vivo som möjliggör studie av mekanismerna för terapeutisk plasticitet av injicerade NPC (D). I D, gröna celler är oligodendrocyter, mörkblå celler är axoner, är ljusblå celler transplanterade NPCs, apelsin celler är astrocyter, och röda blodkroppar är endotelceller.
| Betyg | Rörelseapparaten Responses |
| 0 | Vanlig mus. Inga uppenbara tecken på sjukdom |
| 1 | Slapp svans: fullborda slapphet av svansen, och frånvaro av curling vid spetsen på svansen när musen plockas upp |
| 1,5 | Bakbenssvaghet: musen visar enstaka och korta trippings när man går på en vaggande gång |
| 2 | Limp svansen och bakbenen svaghet: när de placeras på rygg, kan musen inte vända sig till sitt normala läge |
| Partiell bakbensförlamning: musen kan inte längre använda bakbenen att bibehålla bakdels hållning eller gå men kan fortfarande flytta ett eller båda bakbenen i viss utsträckning, framben förbli opåverkade | |
| 3 | Komplett bakbensförlamning: total förlust av rörelse i bakben. Musen drar sig enbart på sina framben som inte påverkas. Möss i detta stadium ges mat på burens golv, långa sipper rören och daglig subkutan injektion av fuktande lösningar för att förhindra uttorkning. Om möss utvecklar sår eller hudskador som inte återhämta sig med behandling, kommer de avlivas på ett humant |
| 3,5 | Frambens svaghet: när plats på ett vertikalt rutnät, är musen inte kan klättra och sakta faller |
| 4 | Moribund tillstånd |
| 5 | Musen hittats döda eller avlivats enligt humana slutpunkter |
Table 1. Fem skede skala av kliniska tecken och uppåtstigande paralys i EAE-möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Somatiska stamcellsbaserade terapier är fram som en av de mest lovande strategier för behandling av kroniska inflammatoriska sjukdomar i centrala nervsystemet såsom MS2 11. Medan de mekanismer upprätthålla sin terapeutiska effekter måste fortfarande vara helt klarlagd, har betydande inverkan på NPC transplantation i olika experimentella modeller av neurodegenerativa sjukdomar givit upphov till den något provocerande tron att stamceller kan snart användas i humanstudier. Men innan man planerar eventuella mänskliga tillämpningar av sådana innovativa terapier som vi behöver för att möta en del viktiga frågor och ta upp några obesvarade frågor, såsom identifiering av den ideala stamcellskälla för transplantation (autolog vs allogen, pluripotenta vs multi) och den bästa vägen av administration.
Neurodegenerativa sjukdomar skiljer sig åt i sina pathophysiologies, där vissa är rumsligt begränsat (t ex. Ryggmärg ijury, stroke) medan andra kännetecknas av en rumslig tids spridning (t.ex. MS). Det härleder att bränn injektion av (stamceller) celler kan vara en lämplig behandling för de förstnämnda, medan det kan vara otillräckliga eller helt enkelt omöjligt för den senare, där det finns flera webbplatser för hjärnskada innebär en ytterligare utmaning som måste övervinnas.
Samstämmiga uppgifter har visat att intravenös tillförsel kan utgöra en giltig (och låg invasiva) protokoll för cell administration, med stöd av den inneboende förmågan hos stamceller att känna av miljön och särskilt hemma mot webbplatsen (er) för skador. Dock är översättningen av systemiska NPC behandlingar i kliniker fortfarande hindras av några begränsningar, till exempel eventuell ansamling av transplanterade celler i perifera icke-CNS-organ (t.ex. lungor, mjälte, lymfkörtlar och njurarna) som kan eller inte kan vara platser av lokala inflammatoriska svar in vivo. Även denna ospecifika ackumulation av injicerade NPC av målet CNS snabbt rensas i möss med kronisk EAE2, det finns tecken på lång sikt NPC persistens (eller i vissa fall exklusiv inriktning) vid nivån för de sekundära lymfoida organ (t. ex. lymfkörtlar och mjälte) efter systemisk injektion i möss med recidiverande EAE5 19,20. Det faktum att ett stort antal transplanterade NPCs återcirkulerar mot icke-CNS-organ ger en utspädningseffekt, oundvikligen minskar det absoluta antalet NPCs i CNS. Intressant, systemiskt injicerade NPCs är terapeutiskt effektiva (t.ex. via immunregleringsåtgärder) även när ackumulera enbart ur CNS 19,20. Och de övergripande terapeutiska effekterna av injicerade NPCs riktar CNS endast 5 eller lymfkörtlarna bara 19 är jämförbara. Detta kan i en del på grund av en inneboende plasticitet av cellerna, som reagerar olika på de molekylära komponenterna i surrounding mikromiljö. Notably, om å ena sidan transplanterade NPC kan känna av närvaron av inflammatoriska cytokiner och utöva deras terapeutiska effekt genom immunmodulerande mekanismer 16, å andra sidan de kan komma i kontakt med fientliga mikromiljöer vilket slutligen leder till bildningen av tumörer 25,26. Av dessa skäl är det bästa alternativet i dagsläget för att koncentrera injicerade NPCs i CNS. Som sådan är den intratekal administrering (via en ländryggen eller cisternal väg) fortfarande den mest accepterade blivande administrerings i kliniska prövningar. Emellertid kan multifocality och patologiskt heterogena MS-lesioner begränsa effektiviteten för ett sådant tillvägagångssätt.
Här beskriver vi ett effektivt protokoll för att isolera, upprätthålla och karakterisera mus neurala stamceller från vuxen SVZ och i följd, hur man systemiskt (både iv och ICV) injicera NPC i möss som drabbats av kronisk EAE, en av de mest studog modeller av MS. Även om relativt enkel och okomplicerad, dessa protokoll presentera några viktiga steg som måste tas i beaktande. Först, är det obligatoriskt för att erhålla ett stabilt expanderbar och frisk cellberedning. Som beskrivs under protokollet, får stabilitet cellerna indirekt härledas genom att titta på deras tillväxt. Helst bör neurosfärer nå en diameter av 150-200 um varje 4-5 DIV och procentandelen celldöd vid passagerna måste vara mycket låg (mindre än 10%). Dessutom måste neurospheres presentera en kompakt och regelbunden runda formen på mikroskopet. Den infektion med lentivirus kan interferera med överlevnad och cellernas stabilitet. För att erhålla en optimal infektion, är det obligatoriskt för att erhålla en titrering av viruset av intresse är tillräcklig för att erhålla 3 x 10 6 TU / ml. I själva verket, medan å ena sidan en låg mängd virus skulle leda till en liten andel av infekterade celler, å andra sidan användningen av en hög mängd would sannolikt leda till en toxicitetseffekt (starkt beroende av den gen som ska infekteras). NPCs kan smittas flera gånger med integrerande virus, bör resultatet av den första transduktion leder till låg andel transgena positiva levande celler. Det är alltid en god idé att ha inom experimentell jämförelse av stabilitets-och lönsamhetsparametrar med vildtypen, nontransduced styr NPCs. När det gäller framkallande av kronisk EAE, är den mest problematiska delen representeras av beredningen av emulsionen. Såsom beskrivits, måste glasvaror och is vara användning vid alla tidpunkter. Beredningen av emulsionen tar 30-45 min, och det kan anses vara färdig att injiceras endast när det inte skingra när tappas på vatten. Om emulsionen försvinner i vatten, betyder det att den är ännu inte klar och kräver ytterligare blandning.
God noggrannhet under intravenös injektion förfarande vid tidpunkten för cell administration är kritisk. För det första är det extremt viktigt att ha såingle cellsuspension, såsom injektion av aggregerade celler kan hindra venerna i den injicerade musen och leda till dess omedelbara död. För att säkerställa rätt placering av nålen i venen, är det bra att aspirera med sprutan några mikroliter blod. I fallet med inget blod kommer in i sprutan bör operatören långsamt flytta nålen bakåt eller framåt tills korrekt läge hittas. Endast vid denna punkt kan cellsuspensionen injiceras långsamt. Viktigt är att operatören ska normalt inte vara skyldiga att tillämpa något tryck på sprutan eftersom vätskan lätt skulle flyta i venen. En felaktig injektion skulle oundvikligen leda till en subkutan svullnad motsvarande injektionsstället.
Det är värt att notera att inom en mycket snar framtid systemiskt injicerade NPCs2, 27, genetiskt modifierad eller ej, kan själva utgöra ett behandlingsalternativ, samt att ge ett viktigt verktyg för att leverera immun modulatory och / eller nervskyddande läkemedel och pro remyelinating medel direkt in i CNS 28. Därför, medan vissa begränsningar relaterade till systemisk tillförsel av NPC existerar både iv. och icv. vägar kan i slutändan representerar giltigt alternativ terapeutisk metod i dessa sjukdomar där bränn injektion av celler inte kan utgöra guldstandardprotokoll för behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna tackar Jayden Smith för att kritiskt granska och bevis att redigera manuskriptet. Detta arbete har fått stöd från National Multiple Sclerosis Society (NMSS, partiella bidrag RG-4001-A1), den italienska Multiple Sclerosis Association (AISM bevilja 2010/R/31), det italienska hälsoministeriet (GR08-7), Wings for Life, Banca Agricola Popolare di Ragusa (BAPR), Europeiska forskningsrådet (ERC) inom ramen för ERC-2010-StG bidragsavtal nr 260.511-SEM_SEM och Europeiska gemenskapen (EG) 7: e ramprogram (FP7/2007-2013) enligt bidragsavtalet n * grad; 280.772 - Ione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| EBSS | Sigma | E2888 | |
| L-Cystein | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Papain | Worthington | 30H11965 | |
| EDTA | Fisher Scientific | D/0700/50 | |
| Mouse NeuroCult basal medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult proliferation supplements | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Basic fibroblast growth factor | Peprotech | 100-18B-1000 | |
| Epidermal growth factor | Peprotech | AF-100-15-1000 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 1514012 | |
| Matrigel (coating solution) | BD Biosciences | 354230 | |
| NeuroCult® Differentiation Kit (Mouse) | Stem Cell Technologies | 05704 | |
| Accumax | eBioscience | 00-4666-56 | |
| Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) without Ca and Mg | PAA Laboratories | H15-011 | |
| Myco trace | PAA Laboratories | Q052-020 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Immunofluorescence | |||
| Normal goat serum | PAA Laboratories | B11-035 | |
| Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Mouse anti Nestin | Abcam | ab11306 | |
| Rabbit anti GFAP | DAKO | 203344 | |
| Mouse anti Histone H3 (phospho S10) | Abcam | ab14955 | |
| Rabbit anti MAP-2 | Abcam | ab32454 | |
| Rat anti MBP | AbD SEROTEC | MCA409S | |
| Anti-O4 Antibody, clone 81 | MAB345 | Millipore | MAB345 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Mounting solution | DAKO | S3023 | |
| EAE | |||
| Freund's Adjuvant Incomplete | Sigma Aldrich | F5506 | |
| Mycobacterium tuberculosis | DIFCO | H37Ra | |
| MOG(35–55) | Espikem | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories | 181 | |
| Tissue processing | |||
| Iris scissor straight | Fine Sciences Tools | 14060-09 | |
| Blunt/bended forceps | Fine Sciences Tools | 11080-02 | |
| Brain slicer | Zivic Instruments | BSMAS005-1 | |
| Surgical blades | Swann-Morton | 324 | |
| P200, P1000 pipettes | |||
| Ketamine (Vetalar) | Boehringer Ingelheim | 01LC0030 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 32371 | |
| Stereotaxic frame | KOPF | Model 900 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7762-04 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 158127 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 |
References
- Ben-Hur, T., et al. Transplanted multipotential neural precursor cells migrate into the inflamed white matter in response to experimental autoimmune encephalomyelitis. Glia. 41, 73-80 (2003).
- Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422, 688-694 (2003).
- Chu, K., Kim, M., Jeong, S. W., Kim, S. U., Yoon, B. W. Human neural stem cells can migrate, differentiate, and integrate after intravenous transplantation in adult rats with transient forebrain ischemia. Neurosci. Lett. 343, 129-133 (2003).
- Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14, 634-644 (2008).
- Pluchino, S., et al. Neurosphere-derived multipotent precursors promote neuroprotection by an immunomodulatory mechanism. Nature. 436, 266-271 (2005).
- Einstein, O., et al. Intraventricular transplantation of neural precursor cell spheres attenuates acute experimental allergic encephalomyelitis. Mol. Cell Neurosci. 24, 1074-1082 (2003).
- Chu, K., et al. Human neural stem cell transplantation reduces spontaneous recurrent seizures following pilocarpine-induced status epilepticus in adult rats. Brain Res. 1023, 213-221 (2004).
- Jeong, S. W., et al. Human neural stem cell transplantation promotes functional recovery in rats with experimental intracerebral hemorrhage. Stroke. 34, 2258-2263 (2003).
- Aboody, K. S., et al. Neural stem cells display extensive tropism for pathology in adult brain: evidence from intracranial gliomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12846-12851 (2000).
- Muller, F. J., Snyder, E. Y., Loring, J. F. Gene therapy: can neural stem cells deliver. Nat. Rev. Neurosci. 7, 75-84 (2006).
- Martino, G., Pluchino, S. The therapeutic potential of neural stem cells. Nat. Rev. Neurosci. 7, 395-406 (2006).
- Deckert-Schluter, M., Schluter, D., Hof, H., Wiestler, O. D., Lassmann, H. Differential expression of ICAM-1, VCAM-1 and their ligands LFA-1, Mac-1, CD43, VLA-4, and MHC class II antigens in murine Toxoplasma encephalitis: a light microscopic and ultrastructural immunohistochemical study. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 457-468 (1994).
- Hemmer, B., Archelos, J. J., Hartung, H. P. New concepts in the immunopathogenesis of multiple sclerosis. Nat. Rev. Neurosci. 3, 291-301 (2002).
- Butcher, E. C., Picker, L. J. Lymphocyte homing and homeostasis. Science. 272, 60-66 (1996).
- Rampon, C., et al. Molecular mechanism of systemic delivery of neural precursor cells to the brain: assembly of brain endothelial apical cups and control of transmigration by CD44. Stem Cells. 26, 1673-1682 (2008).
- Pluchino, S., et al. Human neural stem cells ameliorate autoimmune encephalomyelitis in non-human primates. Ann. Neurol. 66, 343-354 (2009).
- Martino, G., Pluchino, S., Bonfanti, L., Schwartz, M. Brain regeneration in physiology and pathology: the immune signature driving therapeutic plasticity of neural stem cells. Physiol. Rev. 91, 1281-1304 (2011).
- Aharonowiz, M., et al. Neuroprotective effect of transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursors in an animal model of multiple sclerosis. PLoS ONE. 3, e3145 (2008).
- Pluchino, S., et al. Immune regulatory neural stem/precursor cells protect from central nervous system autoimmunity by restraining dendritic cell function. PLoS One. 4, (2009).
- Einstein, O., et al. Neural precursors attenuate autoimmune encephalomyelitis by peripheral immunosuppression. Ann. Neurol. 61, 209-218 (2007).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J. Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
- Furlan, R., Pluchino, S., Marconi, P. C., Martino, G. Cytokine gene delivery into the central nervous system using intrathecally injected nonreplicative viral vectors. Methods Mol. Biol. 215, 279-289 (2003).
- Constantin, G. Visualization and analysis of adhesive events in brain microvessels by using intravital microscopy. Methods Mol. Biol. 239, 189-198 (2004).
- Politi, L. S., et al. Magnetic-resonance-based tracking and quantification of intravenously injected neural stem cell accumulation in the brains of mice with experimental multiple sclerosis. Stem Cells. 25, 2583-2592 (2007).
- Melzi, R., et al. Co-graft of allogeneic immune regulatory neural stem cells (NPC) and pancreatic islets mediates tolerance, while inducing NPC-derived tumors in mice. PLoS One. 5, (2010).
- Amariglio, N., et al. Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLoS Med. 6, (2009).
- Ben-Hur, T., et al. Effects of proinflammatory cytokines on the growth, fate, and motility of multipotential neural precursor cells. Mol. Cell Neurosci. 24, 623-631 (2003).
- Giusto, E., Donega, M., Cossetti, C., Pluchino, S. Neuro-immune interactions of neural stem cell transplants: From animal disease models to human trials. Exp. Neurol. , (2013).
