Indledning af metastatisk brystkræft karcinom ved Målretning af Duktalt epitel med Adenovirus-Cre: A Novel transgene mus Model for brystkræft

Summary

Aktivering af latente mutationer med adenovirus-Cre i brystkirtler duktalt system resulterer i en klinisk relevant metastatisk brystkræft. Indarbejdelse af en YFP promotor muliggør sporing af distale metastatiske tumorceller. Denne model er nyttig til at studere latent metastase, anti-tumor immunitet og for at udforme nye immunoterapier til behandling af brystkræft.

Abstract

Brystkræft er en heterogen sygdom, der involverer komplekse cellulære interaktioner mellem udvikle tumor og immunsystemet, til sidst resulterer i eksponentiel tumorvækst og metastase til distale væv og sammenbruddet af anti-tumor immunitet. Mange nyttige dyremodeller findes til at studere brystkræft, men ingen fuldstændig rekapitulere sygdomsprogression, der forekommer i mennesker. For at få en bedre forståelse af de cellulære interaktioner, der resulterer i dannelsen af ​​latent metastaser og nedsat overlevelse, har vi skabt en inducerbar transgene mus model af YFP-udtrykker duktalt karcinom, der udvikler sig efter seksuel modenhed i immun-kompetente mus og drives ved konsekvent, hormonforstyrrende-uafhængig onkogen ekspression. Aktivering af YFP, ablation af p53, og udtryk for en onkogen form af K-ras blev opnået ved levering af et adenovirus, der udtrykker Cre-rekombinase i brystkirtler kanal af kønsmodne, jomfru hunmus. Tumorerbegynder at dukke 6 uger efter indledningen af ​​onkogene begivenheder. Efter tumorer fremgå, at de udvikler langsomt i cirka to uger, inden de begynder at vokse eksponentielt. Efter 7-8 uger efter adenovirus injektion observeres vaskulatur forbinder tumormassen til distale lymfeknuder med eventuel lymphovascular invasion af YFP + tumorceller til de distale axillære lymfeknuder. Infiltrerende leukocytpopulationer svarer til dem, der findes i humane bryst-carcinomer, herunder tilstedeværelsen af ​​αβ og γδ T-celler, makrofager og MDSCs. Denne unikke model vil lette undersøgelsen af ​​cellulære og immunologiske mekanismer involveret i latent metastase og hviletilstand ud over at være anvendelige til at designe hidtil ukendte immunoterapeutiske tiltag til behandling af invasiv brystkræft.

Introduction

Brystkræft er den hyppigst forekommende malignitet hos kvinder i hele verden ^1,2 og den anden hyppigste årsag til cancer-relaterede dødsfald ^2. Komplekse genetiske ^3,4 histologisk ^5, og kliniske fænotyper ⁶ anvendes til at karakterisere de forskellige undertyper af brystkræft, og som ofte anvendes som et middel til at forudsige overlevelse. Analyse af en stor gruppe af kvinder med brystcancer viste, at de fleste (ca. 80%) af de patienter, der døde recidiverende inden for 10 år efter fjernelse af den primære tumor ^7. For et flertal af invasive brystcarcinomaer, er blevet vist lymphovascular invasion at være stærkt korreleret til et dårligt resultat og mere aggressive kliniske sygdomsforløb ^8.

På grund af den genetiske og fænotypiske kompleksitet af brystkræft, er der ingen dyremodel, der rekapitulerer hele forløbet af sygdommen. Humane bryst tumorcellelinier har været hyppigtbruges som xenograft eller ortotopisk ⁹ modeller af kræft invasiv og metastatisk brystkræft i immune mangel mus. Selv informative, optræder disse modeller i fravær af immun pres, og fordi det er et kors art graft, fordrejer virkningerne af hele tumor mikromiljø. Inducerbare genetiske mutationer drevet af brystkirtler specifikke promotorer, såsom murine brysttumorvirus (MMTV) og surt valleprotein (WAP) har bidraget med en enorm mængde af viden om den genetiske natur brystkræft. Imidlertid er vævet specifik ekspression af disse promotorer kompromitteret af deres lydhørhed over for det endokrine system ^10-16, hvilket resulterer i variable udtryk af inducerede genetiske mutationer, der ikke afspejler udtryk for onkogener typisk overudtrykt i human brystkræft. For at overvinde endokrine styring af MMTV drevne udtryk for onkogener, Moody genereret en betinget, doxycyclin inducerbare model overekspression Neu i brystet et al.epitel ^17. Denne model er nyttig til deinducing Neu efter tumordannelse at studere regression og tilbagefald, men kræver konstant doxycyclin administration for konsekvent, langsigtet onkogen ekspression. En omfattende diskussion af de mange relevante bryst tumor modeller kan findes i revisionen af Vargo-Gogola et al. ^10.

Vores mål var at udvikle en musemodel af kræft sporbart bryst på en fuld C57BL / 6 baggrund, at der efter den permanente induktion af mutationsbegivenheder, modeller dannelsen af ​​en spirende tumor i tilstedeværelse af immun pres. Vi introducerede en adenovirus der udtrykker Cre-rekombinase i brystkirtler aftrækskanaler transgene mus, der indeholder floxet alleler af TP53 og en onkogent form af K-ras og YFP. Cre-ekspression ablates TP53, en hyppigt muterede gen i mange brystcancere ¹⁸ og inducerer en oncogen allel af K-ras foruden YFP ekspression specifikti mælkekirtlen ductal epitel. Selvom mutationer i K-ras er sjældne i brystkræft, der forekommer i kun 6,5% af brystkræftpatienter ^19,20, overekspression af opstrøms kinaser såsom Her2/neu og EGFR resulterer i konstitutiv aktivering af Ras-signalvejen i humane brysttumorer ^21-23. Aktivering af Ras-signalvejen i mange bryst tumorcellelinjer er også blevet rapporteret ^24,25. Vi vil beskrive indledningen af ​​tumor dannelse og teknikken af ​​intraductal injektion af et adenovirus, der udtrykker Cre-rekombinase i kønsmodne, jomfru hunmus. Denne model af brystkræft udvikler åbenlyse læsioner, der vokser eksponentielt efter ca 8 uger af langsom tumorprogression med lymphovascular invasion og metastasering til armhulen lymfeknude ved 7-8 uger. Fordi disse mus er på en fuld C57BL / 6 baggrund og YFP-udtrykkende tumorceller er sporbare i distale lymfeknuder, denne model giver et relevant redskab til at studere cellular og immunologiske mekanismer latent metastaser, og vil bidrage til at udvikle nye terapeutiske tilgange til behandling af metastatisk cancer ductal brystkræft.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af Wistar Institute Animal Care og brug Udvalg.

1.. Generation og Vedligeholdelse af transgene mus

1. Race LSL-K-ras ^{tm4Tyj 26} og Trp53 ^{tm1Brn 27} (opnået fra NCI musemodeller for human cancer konsortium på en blandet baggrund) til en fuld C57BL / 6 baggrund ²⁸ ved tilbagekrydsning mindst 10 generationer med C57BL / 6 mus. Hvis du vil spore tumor metastase, race B6.129X1-Gt (ROSA) 26Sor ^{TM1 (EYFP) Cos} / J (LSL-EYFP, opnået fra The Jackson Laboratory på en fuld C57BL / 6 baggrund) med dobbelt transgene LSL-K-ras ^{G12D / +} p53 ^{loxP / loxP-mus.}
   Bemærk: Transgene LSL-K-ras ^{G12D / +} p53 ^{loxP / loxP-mus} har loxP flankerer et transkriptionelt til tavshed allel onkogene K-ras og det endogene p53 locus, således at ved Cre-medieret udskæring overekspression af et onkogent K-ras mutanten og ablation af p53 er Achieved.
   Bemærk: LSL-EYFP mus indeholder en stopkodon flankerer et gen til forbedret gult fluorescerende protein (YFP), som ved Cre-medieret excision resulterer i ekspressionen af ​​YFP i væv, hvor YFP stopper kassetten udtaget.
   1. Race transgene mus for at opnå LSL-K-RAS ^{G12D / +} p53 ^{loxP / loxP} mus eller LSL-K-ras ^{G12D / +} p53 ^{loxP / loxP} LSL-EYFP mus til intraductal injektioner.
      Bemærk: Mus er avlet som homozygote for p53 ^{loxP / loxP} og heterozygot for LSL-K-ras ^{G12D / +} fordi mus med en homozygot deletion af K-ras dø i livmoderen. Brug naive jomfruelige hunner mindst seks uger gamle, for intraductal injektioner.
      Bemærk: De primere til genotypebestemmelse homozygot floxet p53 allel er p53 - T010-FWD (5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3 ') og p53-T011-rev (5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3'). De producerer en vildtypeallelen på 391 bp og p53 floxet allelen på 461 bp ^29,30.
      Bemærk: De primere til at detektere mutant form af K-ras er oIMR8273 (5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3 ') og oIMR8274 (5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3'). De producerer mutant bånd detekteret ved 600 bp.
      Bemærk: For YFP reporter tredobbelt transgene mus, at primerne detektere ROSA kassette (5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3 '), vildtypeallelen (5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3'), og en delt allel (5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT 3 ') resulterer i amplifikation af bånd ved 320 bp for floxet allel og 600 bp for vildtypeallelen.

2. Kirurgisk Forberedelse

1. Ren kirurgiske materialer med 75% EtOH og autoklaver dem før og efter alle injektioner.
2. Udføre kirurgi på en ren ryddeligt laboratorium bænk i en steriliserede rum i et dyr facilitet. Tør alle overflader, herunder scenen og ringer af det kirurgiske mikroskop med et bredspektret desinfektionsmiddel efterfulgt af 75% EtOH.
3. Afvejes og bedøver mus ved intraperitoneal injektion af en blanding af ketamin (80-100 mg / kg) og xylazin (8-10 mg / kg) i sterilt saltvand.
4. Anbring forsigtigt mus tilbage i deres bure uforstyrret i 5 min, mens de går under anæstesi. I løbet af denne tid generere virus bundfald (se protokol 3).
5. Kontroller manglende respons på smerte ved tå klemme. Dækker forsigtigt øjnene af bedøvede mus med veterinær salve for at forhindre overdreven udtørring af hornhinden.
6. For at forhindre hypotermi, placere bedøvede mus på en varmepude indstillet til lav varme under den kirurgiske procedure, og indtil de begynder at komme sig.
7. For forvaltningen af ​​smerte, administrere mus meloxicam subkutant på 1 mg / kg før operationen og 24 timer efter.

3. Generering af Virus Udfældning

ADVARSEL: Adenovirusvektorer, selv om de er blevet ændret, og er i stand til at replikere, udgør en risiko forinfektion. Håndtag adenovirus med forsigtighed. Alt personale skal være behørigt uddannet i overensstemmelse med institutionens retningslinjer for håndtering BSL2 agenter Efter intraductal injektion, bortskaffes adenovirus i overensstemmelse med BSL2 retningslinjer.

1. Store adenovirus koncentreret virusstammer ved -80 ° C nedfrosset i portioner af 4 x 10 ⁸ pfu hver, tilstrækkelig til injektion 16 dyr med 3 ml 2,5 x 10 ⁷ pfu adenoviruspartikler.
2. Opbevar adenovirus portioner på tøris indtil ca 15-20 min før du begynder injektioner.
   Bemærk: Undgå gentagne fryse tø cykler, som virustiteren falder betydeligt mellem hver cyklus.
   Bemærk: Adenovirus bundfald dannes ved at modificere en protokol beskrevet tidligere ^31.
3. Opløs 504 mg MEM pulver med 50 ml sterilt molekylærbiologisk kvalitet vand, supplere med 244 mg natriumhydrogencarbonat og filter i sterile forhold og opbevares ved 4 ° C.
   <li> Forbered calciumchloridopløsningen ved at tilsætte 1,5 g calciumchlorid til 50 ml af molekylærbiologisk kvalitet vand og filter i sterile forhold og opbevares ved 4 ° C.
   1. Blandingsalikvoterne indeholdende 4 x 10 ⁸ pfu adenovirus-Cre med tilstrækkelig 3% sucrose i sterilt vand til et slutvolumen på 10 ml. Tilføj 34 ml MEM for virus og bland forsigtigt. Derefter tilsættes 4 ml _{CaCl2-opløsning,} bland forsigtigt og inkuberes ved stuetemperatur i 15-20 min.
   2. Store Adenovirus på tøris indtil den er klar til at danne bundfald. Undgå optøning af adenovirus og lagring på is eller stuetemperatur i længere tid, hvis der dannes bundfald.
      Bemærk: Det er også muligt at blande sakkarose, MEM og _CaCl2 forud for operationer, hvis det ikke er muligt at optø adenovirus alikvot og begynde at gøre udfældes umiddelbart efter fjernelse fra -80 ° C. Denne portion af saccharose, MEM, og calcium kan gemmes på tøris indtil klar til at tilføje adenovirus.
      Bemærk: Viruspartikler er stabile i ca 1 time.
   3. Før hver injektion, forsigtigt svirp røret for at sikre viruspartikler blandet. Udarbejde 3 ml (2,5 x 10 ⁷ PFU) af viruspartikler i 10 ml sprøjten og forberede musen for intraductal injektion.

4.. Intraductal Injektion af viruspartikler

1. Anbring forsigtigt musen på ryggen på den oplyste scene af en ren dissektion mikroskop. Oplys abdominal side med en ekstra lyskilde, og find venstre 4 ^th eller højre ^9. lyske brystkirtel af de små hvide pletter af pels (synlige på C57BL / 6 tæver) omgiver hver brystvorte.
2. Gnid brystvorten forsigtigt med en steril ethanol gennemvædet bomuld applikator for at fjerne hår fra brystvorten og at sterilisere injektionsstedet. Hvis de er vanskelige at lokalisere, forsigtigt anvende et tykt lag af en rigtige spørgsmål creme eller bruge saks til at afsløre brystvorterne. Fjern keratin stik, et lag af tætte døde hudceller, som dækker brystvorten. Når brystvorten er udsat for, skal keratin stik være let synlige under dissektion mikroskop.
3. Fastgør brystvorten med fine kirurgiske pincet og trække op med lys kraft til at fjerne keratin stik.
4. Stabiliser brystvorten mellem pincet.
5. Sæt forsigtigt nålen mellem pincet, kanylering kanalen kanalen ved 90 °. Indtast sugekoppen lidt forbi skråspids nål (ikke mere end 2 mm) for at forhindre gennemtrængning af brystvævet og ind i serøse membraner fra den ventrale legemshulrum.
   1. Indsæt ikke nålen for dybt. At sikre korrekt dybde af injektion, træk forsigtigt nålen op efter at sætte det ind i lumen af kanalen, der trækker brystvorten op langs kanterne af nålen, når den trækkes op.
      Bemærk: Visualisering af injektion er vanskelig, og derfor practicanbefales e til dette trin ved hjælp af trypanblåt.
6. Når nålen er passende placeret i brystkirtler kanal, frigive de 3 ml virus bundfald (2,5 x 10 ⁷ pfu adenovirus-CRE) ved forsigtigt at kaste sprøjten med tommelfingeren på den hånd der holder sprøjten. Niplen bør være lidt puste som tilsættes væsken.

5.. Inddrivelse af Mus

1. Placer musen tilbage på varmepude efter injektionen, indtil det begynder at komme sig efter anæstesi.
2. Når musen er genvundet, læg det tilbage i en ren bur og overvåge for fuld helbredelse og bevægelse.
3. 24 timer efter intraductal injektion subkutant administrere meloxicam ved 1 mg / kg.

6.. Overvågning tumorprogression

1. Palpere injicerede brystkirtel på dag 30 for udvidelsen og hævelse.
   1. Overvåg tumorprogression hver 5-7 dage, når en opsvulmet og forstørret brystkirtler Glanobserveres d.
2. Mål tumorvolumener hver 3-4 dage for tumor vækstkinetik når tydelige tumorer forekommer (ca. 50-60 dage efter adenoviral injektion).
3. Aflive mus ved tumorvolumener overstiger 10% af legemsvægten af ​​mus.

Representative Results

Vellykket målretning af mammary ductal træet kan visualiseres ved at fremstille hele underlag af mælkekirtlen som tidligere beskrevet ³² efter injektion af trypanblåt (for at kontrollere korrekt injektionsteknik (figur 1A) eller et adenovirus, der udtrykker mCherry (for at kontrollere korrekt viruspræparat og infektion af duktale epitelceller, figur 1B).

Figur 1. Intraductal målretning af mælkekirtlerne ved injektion med trypanblåt eller adenovirus-mCherry. A) En hel mount, som tidligere rapporteret ³² af mælkekirtlen efter injektion af mælkekirtlen # 4 med trypanblåt blev fremstillet 3 timer efter injektion visualisere / bekræft målretning af hele duktalttræ. Billeder er 4X forstørrelse. B) Infektion i duktalt epitel med adenovirus ved at injicere 2,5 x 10 ⁷ pfu adenovirus der udtrykker mCherry. Mus blev injiceret intraduktalt, og 4 dage efter injektion, en hel mount af mælkekirtlen var parat til at bekræfte virusinfektion i duktalt træet. Billedet er 4X forstørrelse. MG er brystkirtel, LD er lactiferous eller hovedkanalen, og TD er den terminal kanalen. Klik her for at se større billede.

Når tumorer induceres i p53 ^{loxP / loxP} LSL-K-ras ^{G12D / +} transgene mus, tumorer vil ikke være synlige indtil omkring dag 40, hvor mælkekirtlerne bliver udvidet og hævede. Det er nødvendigt at begynde palpations når dette observeres, overvågning tumorvækst hver 5-7 dage. I vores hænder, hærdning af mælkekirtlen altid går forud for påbegyndelsen af ​​tumor udvikling. Tumorer vil skride langsomt i yderligere 2 uger. Begyndende omkring dag 56, vil tumorer begynder at vokse eksponentielt (figur 2B). På dette tidspunkt, er det vigtigt at måle tumorvolumener hver 3 dage, hvis kinetiske undersøgelser er ønsket, fordi der vil være en lille mus til variabilitet mus i tumorprogression, som er normal (figur 2A og 3A). Store abdominale forandringer vil være indlysende ved dag 80 (figur 2A, 2B og 3A), hvorefter musene bør aflives hvis tumorer overstiger mere end 10% af deres kropsvægt. cDNA-analyse af tre kloner fra et tumor-bærende mus afslørede ekspression af mesothelin, cytokeratin-8, Her2/neu, og østrogen-receptor-α (figur 2C).

Tumor udvikling i p53 ^loxP> Figur 2. ^{/ LoxP} LSL-K-ras ^{G12D / +} mus injiceret intraduktalt med adenovirus-Cre. A) To eksempler på tumorer 80 dage efter injektion med adenovirus, der udtrykker Cre. Mus blev givet 2,5 x 10 ⁷ PFU adenovirus, der udtrykker Cre og 80 dage efter tumor-initiering, kan store tydelige masser visualiseres rager ud fra den abdominale side af dyret. B) Typisk tumor kinetik og palpering tidsplan for inducerede tumorer i p53 ^{loxP / loxP} LSL-K-ras ^{G12D / +} mus. C) Karakterisering af tre tumor-cellekloner afledt fra samme homogeniserede tumor af et ^{p53-loxP / loxP} LSL-K-ras ^{G12D / +} mus. RNA blev ekstraheret og cDNA syntetiseret til RT-PCR-analyse under anvendelse af primere specifikke for β-actin, mesothelin, cytokeratin-8, Her2/neu, progesteron-receptor, østrogen-receptor-α, og østrogen-receptor-β.TPS :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.

Svarende til det cellulære mikromiljø human brystcancer, har vi observeret infiltration af αβ og γδ T-celler samt myeloide afledte suppressor-celler og makrofager i tumorer (figur 4). Vasculature afdrypning på armhulen lymfeknude vil begynde at mætte før tumorer er vokset til at omfatte hele brystvæv hvor injektionen blev udført (figur 3A). Lymphovascular invasion og metastase af tumorceller kan spores ved at krydse LSL-K-ras ^{G12D / +} p53 ^{loxP / loxP} mus med LSL-EYFP mus. Efter Cre-medieret udskæring tumorceller udtrykker YFP (både høj og lav) påvist i tumoren og kan spores metastaserer til afdrypning armhulen lymfeknude (fig. 3B). Metastase til den distale axillær lymfekirtel blev bekræftetved med held at dyrkning af en tumor cellelinie fra dette site i en tumor-bærende LSL-K-ras ^{G12D / +} p53 ^{loxP / loxP} mus (data ikke vist).

Figur 3.. Dannelse af tumorer og latent metastaser til aksillær lymfeknude. A) Eksempel på tre avancerede brysttumorer med forskellige satser for tumorprogression. En fast masse angivet ved pilespids, former og til sidst vokser til størrelsen af ​​hele abdominal brystvæv. Tumor forbliver begrænset til brystvævet og observeres ikke at invadere eller knytte til musklen, der dækker bughulen. Der er indlysende overfyldning af den overfladiske epigastric vene mellem lyske og armhulen lymfeknuder, angivet med hvide pilespidser. Efter 7-8 uger, the axillær lymfekirtel begynder at blive udvidet på grund af lymphovascular invasion af tumorceller, angivet ved pilen. B) Metastase af YFP positive tumorceller kan visualiseres i armhulen lymfeknude ved flowcytometri. LSL-K-ras ^{G12D / +} p53 ^{loxP / loxP} LSL-EYFP mus blev anvendt til at inducere tumorer og aktivering af YFP ved intraductal levering af adenovirus-Cre. For at verificere lymphovascular invasion af tumorceller i armhulen lymfeknude, 80 dage efter adenoviral injektion blev de angivne lymfeknuder og organer høstet og farvet for lymfocyt markører og undersøgt for YFP ekspression. CL repræsenterer kontralaterale nontumor drænende lymfeknude. Resultaterne repræsenterer gating på CD45 negative tumorceller, med angivelse af tumorceller invaderer distale axillær lymfekirtel. Tal repræsenterer procent YFP positive celler fra den samlede befolkning. Klik her for at se largis image.

Figur 4.. Immune infiltrater i mus transgene brystkræft. Mouse brysttumorer blev homogeniseret og farvet for CD45, CD3, γδTCR, CD11 og GR1. Tal repræsenterer procent positive leukocytter i hele tumoren (63,5), total CD3 ⁺ (46,7), total CD3 negative (40,1), total CD3 ⁺ γδ ⁺ (γδ T-celler, 13), CD3 ⁺ γδnegative (24), i alt GR1 høj CD11 (MDSC, 28,6), og de ​​samlede CD11b GR1 lav (makrofager, 18,5). Klik her for at se større billede.

På grund af anatomien af ​​mus og teknik intraductal injektioner finder vi målretning of brystkirtler 4 og 9 (fig. 5) giver de mest konsistente resultater og pålidelige injektioner. Imidlertid kan enhver kirtel målrettes afhængigt af præference for teknikeren at udføre operationen.

Figur 5. Nummerering af mammae kanalerne. Brystkirtler kanaler 4 og 9 er fremhævet med rødt på diagrammet og angivet med pile på musen. I vores hænder, fandt vi, at injektioner var lettest at udføre på disse brystkirtler kanaler, men alle andre brystkirtler væv, som vi målrettet udviklet tumorer med lignende kinetik. Klik her for at se større billede.

Discussion

Succesen for denne procedure afhænger af korrekt teknik under intraductal injektioner, som vil være vanskeligt for utrænede eksperimentatorer. Erfarne forskere i vores laboratorium typisk indhente bryst tumorer 79% af de gange, de administrerer adenovirale injektioner. Problemer med injektion kan resultere i betydeligt forsinket, variabel, eller fraværende tumor udvikling. Hvis nålen er indsat for dybt eller et upassende vinkel, kan duktalt kanalen blive savnet. Det er vigtigt at indtaste sutten lidt forbi skråspids nål (ikke mere end 2 mm), for at forhindre indtrængen gennem brystvævet og ind i serøse membraner fra den ventrale legemshulrum. Desuden kan for lavvandet placering af nålen eller injektion af mere end 3 ml virus bundfald resultere i spild af viral prep uden mælkekirtlen og induktion af utilsigtede tumorer. En måde at overvinde disse problemer er at indsætte nålen ind i brystvorten lidt deeper end 3 mm, og langsomt trække sprøjten tilbage op og ud af kanalen, indtil 2 mm fra spidsen af ​​facet. Dette vil sikre, at brystvæv er målrettet stedet for musklen omkring bughulen af mus (figur 1A). Dette vil også strække brystvorten langs kanterne af sprøjten, så at når virussen udstødes ind i kanalen, er der ingen spild og tab af virale bundfald.

Visualisering af injektion er vanskelig og anbefales praksis for dette skridt. Vi har observeret en stigning i succesfulde injektioner følgende praksis, hvilket resulterer i en højere penetrans af tumorudvikling. Fordi denne teknik bruger nonlactating jomfruelige hunner, er det afgørende at fjerne keratin prop, der brystvorten at afsløre den underliggende kanal kanalen. Vi anbefaler, at praktisere dette trin ved at injicere trypanblåt eller et andet sterilt spores farvestof kanalens inderside og forberede hele brystkirtler mounts at bekræfte målretning af duktalt tree. Derudover har andre protokoller beskriver intraductal injektion af reagenser blevet offentliggjort ^33,34, som kan være nyttige til at udvikle korrekt teknik. Problemer med viral forberedelse eller infektion i ductale lumen kan også undersøges ved hjælp af en mCherry udtrykker adenovirus. Non-transgene mus kan anvendes til hvert af disse formål, indtil injektionsteknik optimeres.

Selv om enhver brystkirtel kan bruges til at indlede tumorer, har vi opnået de mest konsekvente vækstrater ved at målrette brystkirtel 4 eller 9, som vi mener, er fordi det er lettere at udføre ordentlig injektioner på disse kirtler, hvilket resulterer i en mere effektiv målretning af kanalen. Nærheden til venstre 4 ^th eller højre 9 ^th inguinale mælkekirtler til drænende lyskelymfeknuder lymfeknude er også nyttigt at undersøge anti-tumor immunrespons i forskellige tidsmæssige punkter af tumorprogression. For at modellere og spore latent metastaser til distale steder, transgenic mus blev krydset med LSL-EYFP mus. Tumoren skrider frem, vil vaskulatur forbinder tumoren armhulen lymfeknude blive lidt engorged på cirka 5 uger før tumoren begynder at vokse eksponentielt (figur 3A). Til sidst, efter 7-8 uger, vil lymphovascular invasion resultere i tumorvækst i armhulen lymfeknude (figur 3A og 3B). Brug reporter mus og Cre-loxP teknologi, inkorporering af YFP skaber en platform til at spore tumorceller metastaserende til distale steder i hele tumorprogression. Dette kan lette undersøgelser med henblik på at belyse de cellulære og epigenetiske mekanismer, der fremmer latent metastaser. I vores hænder, brysttumor-cellelinier udtrykte cytokeratin-8, mesothelin, østrogen-receptor-α og Her2/neu, bekræfter målretning af duktale epitel. Men alt efter mutationerne inducerede og på grund af vanskeligheder og variabiliteten af ​​injektioner, anbefaler vihistologisk karakterisering af tumorer Når modellen er veletableret i laboratoriet.

Eftersom brystcancer er sådan en dødelig og omsiggribende sygdom ^1,2, er det vigtigt at anvende dyremodeller, der nøjagtigt rekapitulere komplekst samspil mellem tumor og vært. Her beskriver vi en fuldt tilbagekrydses C57BL / 6 murin brysttumor. Først ved at inducere tumorer fra native celler, vi tillader tumoren til at udvikle sig naturligt i en fuld immun mikromiljø. Immun mikromiljø i de avancerede mus brysttumorer sammenfatter populationer af αβ og γδ T-celler, myeloide afledte suppressor celler og makrofager almindeligt observerede i human brystkræft (Figur 4). Som vi har offentliggjort tidligere brug af adenovirus-Cre at inducere tumorer i æggestokkene, fandt vi, at den virale injektion havde ubetydelig indvirkning på de tilsvarende tumor infiltrater og tumorprogression ^28. Sekund, endokrine uafhængigudtryk for onkogener sikrer, at tumorceller har vedvarende høje niveauer af target genekspression. For det tredje, ved at udnytte latente mutationer, kan vi styre tidspunktet for tumorigenese at præcis tidsmæssig sporing af tumor evolution. Anvendelser af denne model omfatter forskning på tumorens cellebiologi, undersøgelser af faktorer i tumormikromiljøet, anti-tumor immunrespons, og selv effektiviteten evaluering af nye lægemidler. Gennem tilgængeligheden af ​​Cre-loxP-systemet, kan denne teknik bruges som en platform til at undersøge en bred vifte af yderligere mutationer i indledningen og progression af brystkræft. Vi håber, at brugen af ​​denne model vil øge forståelsen af ​​brystkræft biologi og i sidste ende føre til nye lægemidler rettet mod behandling af metastatisk brystkræft.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trp53tm1Brn Transgenic mice K-rastm4Tyj Transgenic mice	Obtained from NCI mouse models of human cancer consortium		Mice were backcrossed ten times to a full C57BL/6 background
B6.129X1- Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J Transgenic mice	Jackson Labs	006148
Primers p53loxP/loxP	Integrated DNA Technologies		5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3' 5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3'
Primers LSL-K-rasG12D/+	Integrated DNA Technologies		5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3' 5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3'
Primers for LSL-EYFP to detect Rosa promoter	Integrated DNA Technologies		5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3' 5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3' 5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-3'
Primers for detection of Mesothelin expression	Integrated DNA Technologies		5'-TTGGGTGGATACCACGTCTG-3' 5'-CGGAGTGTAATGTTCTTCTGTC-3'
Primers for detection of Progesterone Receptor expression	Integrated DNA Technologies		5'-GCAATGGAAGGGCAGCATAA-3' 5'-TGGCGGGACCAGTTGAATTT-3'
Primers for detection of Cytokeratin 8 expression	Integrated DNA Technologies		5'-ATCAGCTCTTCCAGCTTTTCCC-3' 5'-GAAGCGCACCTTGTCAATGAAGG-3'
Primers for detection of Erbb2 expression	Integrated DNA Technologies		5'-ACCTGCCCCTACAACTACCT-3' 5'-AAATGCCAGGCTCCCAAAGA-3'
Primers for detection of Estrogen Receptor A expression	Integrated DNA Technologies		5'-ATGAAAGGCGGCATACGGAA-3' 5'-GCGGTTCAGCATCCAACAAG-3'
Primers for detection of Estrogen Receptor B expression	Integrated DNA Technologies		5'-ACCCAATGTGCTAGTGAGCC-3' 5'-TGAGGACCTGTCCAGAACGA-3'
Primers for detection of B-Actin expression	Integrated DNA Technologies		5'-GCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3' 5'-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3'
Adenovirus-Cre	Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa	Ad5CMVCre	Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80 °C to avoid repeated freeze thaw cycles.
Adenovirus-mCherry	Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa	Ad5CMVmCherry	Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80 °C to avoid repeated freeze thaw cycles.
Hamilton syringe	Hamilton company	701RN	10 μl syringe, RN series. Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.
Custom needle	Hamilton company	7803-05	33 G 0.5 in long RN needle, with a 12° bevel. Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.
Surgical forceps	Dumont	52100-58	Dumostar No. 5 forceps. Clean with 75% ethanol after each use, followed by autoclaving
MEM powder	Cellgro	50 012 PB	Store at 4 °C in powder and reconstituted form
Sodium Bicarbonate	Fisher	S233	Add to MEM and filter stearilize
Calcium Chloride	Sigma	C4901	Minimum 96%, anhydrous