ألياف النانو البروتين ECM والنانو المهندسة طريق الجمعية بمبادرة السطحية
Summary
ووصف طريقة للحصول على ألياف النانو والنانو معقدة من واحد أو عدة البروتينات المصفوفة خارج الخلية. يستخدم هذا الأسلوب تفاعلات البروتين السطحي لخلق مواد البروتين على أساس قائمة بذاتها مع تكوين الانضباطي والهندسة المعمارية لاستخدامها في مجموعة متنوعة من التطبيقات هندسة الأنسجة والتكنولوجيا الحيوية.
Abstract
ويتم تصنيع المصفوفة خارج الخلية (ECM) في الأنسجة وتجميعها من قبل الخلايا لتشكيل ييفي 3D، شبكة البروتين مع تنظيم محكم قطر الألياف وتكوينها وتنظيمها. بالإضافة إلى توفير الدعم الهيكلي، والخصائص الفيزيائية والكيميائية للECM تلعب دورا هاما في العمليات الخلوية متعددة بما في ذلك التصاق، والتمايز، وموت الخلايا المبرمج. في الجسم الحي، يتم تجميعها في ECM من خلال تعريض خفي التجميع الذاتي (اللييفات) مواقع داخل البروتينات . هذه العملية تختلف عن البروتينات المختلفة، ولكن فبرونيكتين (FN) اللييفات هو، تتميز بشكل جيد ويخدم كنظام نموذج لبوساطة خلية التجمع ECM. على وجه التحديد، وخلايا المستقبلات استخدام إنتغرين على غشاء الخلية لربط dimers FN والقوات مقلص ولدت أكتوميوزين تتكشف وفضح مواقع الربط لتجميع ألياف غير قابلة للذوبان في. هذه العملية بوساطة مستقبلات الخلايا تمكن لتجميع وتنظيم ECM من الأنسجة الخلوية لهيئة السلع التموينيةليه. هنا، نقدم طريقة تسمى بمبادرة سطح التجمع (SIA)، والذي يلخص الخلية بوساطة تجميع مصفوفة باستخدام تفاعلات البروتين على سطح تتكشف البروتينات ECM وتجميعها إلى ألياف غير قابلة للذوبان. الأولى، وكثف البروتينات ECM الصعود إلى polydimethylsiloxane مسعور (PDMS) السطح حيث أنها تفسد جزئيا (تتكشف) وفضح المجالات ملزمة خفي. ثم يتم تحويل البروتينات تكشفت في واضحة المعالم الدقيقة وnanopatterns من خلال microcontact الطباعة على بولي حراريا استجابة (N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) السطح. حل أثار حراريا للPIPAAm يؤدي إلى التجميع النهائي وإطلاق سراح غير قابلة للذوبان ألياف النانو البروتين ECM والنانو مع هندستها واضحة المعالم. أبنية معقدة ممكنة عن طريق الهندسة تعريف أنماط على الطوابع PDMS تستخدم لmicrocontact الطباعة. بالإضافة إلى FN، ويمكن استخدام عملية SIA مع laminin، الفيبرينوجين والكولاجين النوع الأول والرابع لخلق متعددة المكونات النانوية ECMتوريس. وبالتالي، SIA يمكن استخدامها لهندسة المواد القائمة على البروتين ECM مع مراقبة دقيقة على تكوين البروتين، والألياف وهندسة العمارة السقالة من أجل تلخيص هيكل وتكوين ECM في الجسم الحي.
Introduction
وتتكون المصفوفة خارج الخلية (ECM) في أنسجة متعددة الوظائف البروتينات المشاركة في تنظيم الفيزيائية والكيميائية للعمليات الخلية متعددة بما في ذلك التصاق، والانتشار، والتمايز، وموت الخلايا المبرمج 1-3. يتم تصنيعه في ECM، وتجميعها، والذي نظمته الخلايا والألياف البروتين المكونة لها تركيبة فريدة من نوعها، وحجم الألياف، وهندستها المعمارية المترابطة التي تختلف مع نوع الأنسجة والمرحلة التنموية. وقد أظهرت الأعمال الأخيرة أن ECM يمكن أن توفر العظة مفيدة لتوجيه الخلايا لتشكيل الأنسجة المهندسة 4، مما يدل على أن تلخص في ECM من حيث تكوينها وهيكلها قد تمكن من وضع المواد بيوميمتيك لتطبيقات هندسة الأنسجة والتكنولوجيا الحيوية.
وقد تم تطوير عدد من الأساليب لتصنيع السقالات هندسة البوليمر التي يمكن أن تحاكي جوانب ECM في الأنسجة. على سبيل المثال، وelectrospinning المرحلة separأوجه أثبتت كل من القدرة على تشكيل المصفوفات التي يسهل اختراقها من الألياف بأقطار تتراوح بين عشرات ميكرومتر وصولا الى عشرات نانومتر 5-7. وقد أظهرت كل من التقنيات أيضا أن المصفوفات التي يسهل اختراقها للغاية من ألياف النانو يمكن أن تدعم التصاق الخلية والتسلل إلى السقالة 8. ومع ذلك، هذه المناهج تقتصر في هندستها الألياف والتوجهات و3D أبنية المحتملة التي يمكن أن تنشأ. Electrospinning تنتج عادة السقالات مع ألياف إما موجهة بشكل عشوائي أو الانحياز للغاية في حين أن مرحلة الانفصال تنتج السقالات بألياف موجهة بشكل عشوائي. وهناك أيضا قيود على المواد، وعادة ما تستخدم مع البوليمرات الاصطناعية الباحثين، مثل بولي (ε-caprolactone) (8) وبولي (حمض اللبنيك المشترك، الجليكوليك) 9، والتي هي المغلفة في وقت لاحق مع بروتينات ECM لتعزيز التصاق الخلية. وتستخدم البوليمرات الحيوية الطبيعية أيضا، بما في ذلك نوع الكولاجين أنا 10، والجيلاتين 11، 12 الفيبرينوجين،الشيتوزان 13، والحرير 14، ولكن لا تمثل سوى مجموعة فرعية صغيرة من البروتينات الموجودة في الأنسجة الأصلية. معظم الأنسجة تحتوي على الوسط أكبر من البروتينات والسكريات بما في ذلك ECM فبرونيكتين (FN)، laminin (LN)، ونوع الكولاجين الرابع وحمض الهيالورونيك التي يصعب أو يستحيل افتعال ألياف النانو باستخدام الأساليب القائمة.
لمواجهة هذا التحدي، فقد ركزنا جهودنا البحثية على محاكاة طريقة تجميع الخلايا وتجميع وتنظيم الألياف البروتين ECM في محيطهم. في حين أن عملية تكون اللييفات معين يختلف عن البروتينات ECM مختلفة، وعادة ما يتم تشغيل تغيير متعلق بتكوين جزئي في جزيء البروتين ECM من قبل الأنزيمية أو التفاعل بوساطة مستقبلات، الذي يعرض مواقع التجميع الذاتي خفي. نحن هنا استخدام FN كنظام نموذج لفهم أفضل لعملية اللييفات. لفترة وجيزة، homodimers FN ربط إنتغرين المستقبلات على سطح الخلية عبر تسلسل الأحماض الأمينية RGD في نوع 10 IIأكرر حدة. مرة واحدة ملزمة، وبصرف النظر لل integrins التحرك عبر أكتوميوزين الانكماش وتتكشف dimers FN لفضح مواقع التجميع الذاتي خفي. تعرض هذه المواقع ملزمة FN-FN تمكن dimers FN لتجميع الى يفية غير قابلة للذوبان الحق على سطح الخلية 15. وقد أثبت العمل في أنظمة خالية من الخلايا أن مواقع ملزمة FN-FN خفي يمكن كشف من خلال تتكشف باستخدام denaturants 16 أو التوتر السطحي في ل-السائل الصلبة واجهة الهواء 17-19. ومع ذلك، يتم تقييد الألياف FN إنشاؤها بواسطة هذه التقنيات إلى أحجام الألياف محددة وهندستها وعادة ما تكون منضمة إلى السطح.
نحن هنا تصف وصف التجمع بمبادرة سطح النهج (SIA) 20 أن يتغلب على هذه القيود من خلال الاستفادة من التفاعلات بروتين السطح لخلق بذاتها غير قابلة للذوبان ألياف النانو، nanofabrics (أوراق 2D) والنانو أخرى تتكون من البروتينات ECM واحدة أو متعددة (الشكل 1 ). في هذه الصفحةrocess، وكثف من البروتينات ECM المدمجة، والتشكل كروية في حل والتشويه والتحريف جزئيا (كشف) في الصعود إلى منقوشة، polydimethylsiloxane مسعور (PDMS) ختم. ثم يتم تحويل البروتينات ECM في هذه الولاية على بولي حراريا استجابة (N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) السطح من خلال microcontact الطباعة 22. عندما رطب مع 40 درجة مئوية الماء يبقى PIPAAm صلبة، ولكن عندما تبرد إلى 32 درجة مئوية فإنه يمر من خلال درجة حرارة المحلول أقل الحرجة (LCST) حيث يصبح ماء، تتضخم مع الماء ثم يذوب، والإفراج عن النانو ECM تجميعها الخروج من السطح. يوفر طريقة SIA السيطرة على أبعاد بدقة نانومتر النطاق. من خلال التحكم في المعايير الأساسية مثل تكوين، والهندسة الألياف، والهندسة المعمارية، فمن الممكن أن ألخص العديد من الخصائص من ECM وجدت في الجسم الحي، ووضع السقالات المتقدمة لتطبيقات هندسة الأنسجة والتكنولوجيا الحيوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقة SIA المقدمة هنا يقلد الخلية بوساطة تجميع مصفوفة وتمكن هندسة ECM البروتين وألياف النانو النانو مع حجم الانضباطي والتنظيم والتكوين. في حين لم تكن متطابقة إلى ECM-لدت الخلية، SIA يخلق ECM تتكون من البروتين الألياف النانوية التي تخضع للطي 20 عكسها / تتكشف خلال سلالة ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقدمت الدعم المالي لدائرة الخدمات الطبية المشتركة من المعاهد الوطنية للصحة الميكانيكا الحيوية في الطب التجديدي برنامج التدريب T32 (2T32EB003392)، إلى QJ من زمالة دود-ICES وAWF من جائزة مبتكر جديد للمدير المعاهد الوطنية للصحة (1DP2HL117750).
Materials
| Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm | Polysciences | 21458-10 | 40,000 Mw |
| Sylgard 184 Silicone kit (PDMS) | Dow Corning | Mix 10 parts base with 1 part curing agent. | |
| Butanol | |||
| Fibronectin | BD biosciences | 354008 | Human, 1mg |
| Laminin | BD biosciences | 354239 | Ultrapure, mouse, 1mg |
| Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU8 Developer | Microchem | ||
| Sonicator Branson M3510 | Branson Ultrasonic Corporation | CPN-952-318 | |
| Thinky ARE-250 Mixer | Thinky Corporation | ||
| Spincoater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| Glass cover 25mm diameter, No 1.5 | Fisher Scientific | 12-545-86 |
References
- Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix and the cytoskeleton. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 793-805 (2001).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. . Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. l. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
- Teo, W. E., Ramakrishna, S. A review on electrospinning design and nanofibre assemblies. Nanotechnology. 17, (2006).
- Reneker, D. H., Chun, I. Nanometre diameter fibres of polymer, produced by electrospinning. Nanotechnology. 7, 216-21 (1996).
- Ma, P. X., Zhang, R. Synthetic nano-scale fibrous extracellular matrix. Journal of Biomedical Materials Research. 46, 60-72 (1999).
- Yoshimoto, H., Shin, Y. M., Terai, H., Vacanti, J. P. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24, 2077-2082 (2003).
- Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: a novel scaffold for tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research. 60, 613-621 (2002).
- Matthews, J. A., Wnek, G. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. . Electrospinning of Collagen Nanofibers. Biomacromolecules. 3, 232-238 (2002).
- Huang, Z. -. M., Zhang, Y. Z., Ramakrishna, S., Lim, C. T. Electrospinning and mechanical characterization of gelatin nanofibers. Polymer. 45, 5361-5368 (2004).
- Wnek, G. E., Carr, M. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. . Electrospinning of Nanofiber Fibrinogen Structures. Nano Letters. 3, 213-216 (2002).
- Bhattarai, N., Edmondson, D., Veiseh, O., Matsen, F. A., Zhang, M. Electrospun chitosan-based nanofibers and their cellular compatibility. Biomaterials. 26, 6176-6184 (2005).
- Jin, H. -. J., Chen, J., Karageorgiou, V., Altman, G. H., Kaplan, D. L. Human bone marrow stromal cell responses on electrospun silk fibroin mats. Biomaterials. 25, 1039-1047 (2004).
- Wierzbicka-Patynowski, I., Schwarzbauer, J. E. The ins and outs of fibronectin matrix assembly. Journal of Cell Science. 116, 3269-3276 (2003).
- Mosher, D. F., Johnson, R. B. In vitro formation of disulfide-bonded fibronectin multimers. Journal of Biological Chemistry. 258, 6595-6601 (1983).
- Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biology. 27, 451-461 (2008).
- Ulmer, J., Geiger, B., Spatz, J. P. Force-induced fibronectin fibrillogenesis in vitro. Soft Matter. 4, 1998-2007 (2008).
- Klotzsch, E., et al. Fibronectin forms the most extensible biological fibers displaying switchable force-exposed cryptic binding sites. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. , (2009).
- Feinberg, A. W., Parker, K. K. Surface-Initiated Assembly of Protein Nanofabrics. Nano Letters. 10, 2184-2191 (2010).
- Deravi, L. F., et al. Differential Contributions of Conformation Extension and Domain Unfolding to Properties of Fibronectin Nanotextiles. Nano Letters. 12, 5587-5592 (2012).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J Vis Exp. , 1065 (2008).
- Vogel, V. Mechanotransduction Involving Multimodular Proteins: Converting Force into Biochemical Signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).
