ECM प्रोटीन Nanofibers और nanostructures इंजीनियर का उपयोग कर सतह द्वारा आरंभ विधानसभा
Summary
एक या कई बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन से nanofibers और जटिल है nanostructures प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णन किया है. इस विधि ऊतक इंजीनियरिंग और जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों की एक किस्म में इस्तेमाल के लिए ट्यून करने योग्य रचना और वास्तुकला के साथ मुक्त खड़े प्रोटीन आधारित सामग्री बनाने के लिए प्रोटीन सतह बातचीत का उपयोग करता है.
Abstract
ऊतकों में बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) संश्लेषित और कसकर विनियमित फाइबर व्यास, संरचना और संगठन के साथ एक 3 डी तंतुमय, प्रोटीन नेटवर्क के रूप में कोशिकाओं द्वारा इकट्ठा किया है. संरचनात्मक समर्थन प्रदान करने के अलावा, ईसीएम की भौतिक और रासायनिक गुणों आसंजन, भेदभाव, और apoptosis सहित कई सेलुलर प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. में vivo, ईसीएम प्रोटीन के भीतर गुप्त आत्म विधानसभा (तन्तुजनन) साइटों को उजागर द्वारा इकट्ठा किया है . यह प्रक्रिया अलग प्रोटीन के लिए बदलता है, लेकिन fibronectin (एफ एन) तन्तुजनन अच्छी तरह से विशेषता है और सेल की मध्यस्थता ईसीएम विधानसभा के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में कार्य करता है. विशेष रूप से, कोशिकाओं अघुलनशील फाइबर में विधानसभा के लिए बाध्यकारी साइटों प्रकट करना और बेनकाब करने के लिए एफ एन dimers और actomyosin जनित सिकुड़ा बलों बाध्य करने के लिए कोशिका झिल्ली पर integrin रिसेप्टर्स का उपयोग करें. इस रिसेप्टर की मध्यस्थता प्रक्रिया ऊतक एससीए को सेलुलर से ईसीएम को इकट्ठा करने और संगठित करने के लिए कोशिकाओं को सक्षम बनाता हैलेस. यहाँ, हम ईसीएम प्रोटीन प्रकट करना और अघुलनशील फाइबर में उन्हें इकट्ठा करने के लिए प्रोटीन सतह बातचीत का उपयोग सेल की मध्यस्थता मैट्रिक्स विधानसभा स्मरण दिलाता है जो एक विधि कहा जाता सतह शुरू की विधानसभा (एसआईए), प्रस्तुत करते हैं. सबसे पहले, ईसीएम प्रोटीन वे आंशिक रूप से (खोलें) denature और गुप्त बाध्यकारी डोमेन का पर्दाफाश जहां एक हाइड्रोफोबिक polydimethylsiloxane (PDMS) सतह पर adsorbed रहे हैं. सामने आया प्रोटीन तो एक thermally संवेदनशील पाली (एन isopropylacrylamide) (PIPAAm) सतह पर microcontact मुद्रण के माध्यम से अच्छी तरह से परिभाषित सूक्ष्म और nanopatterns में स्थानांतरित कर रहे हैं. PIPAAm की Thermally ट्रिगर विघटन अंतिम विधानसभा और अच्छी तरह से परिभाषित geometries के साथ अघुलनशील ईसीएम प्रोटीन nanofibers और nanostructures की रिहाई के लिए जाता है. परिसर आर्किटेक्चर microcontact मुद्रण के लिए इस्तेमाल किया PDMS टिकटों पर इंजीनियरिंग परिभाषित पैटर्न से ही संभव है. एफ एन के अलावा, एसआईए प्रक्रिया laminin, फाइब्रिनोजेन के साथ प्रयोग किया जा सकता है और कोलेजन मैं और चतुर्थ बहु घटक ईसीएम nanostruc बनाने के लिए टाइप करेंtures. इस प्रकार, एसआईए विवो में ईसीएम की संरचना और संरचना पुनरावृत्ति के क्रम में प्रोटीन की संरचना, फाइबर और ज्यामिति पाड़ वास्तुकला पर सटीक नियंत्रण के साथ ईसीएम प्रोटीन आधारित सामग्री इंजीनियर इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
ऊतकों में बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) आसंजन, प्रसार, भेदभाव, और apoptosis 1-3 सहित कई सेल प्रक्रियाओं की भौतिक और रासायनिक विनियमन में शामिल multifunctional प्रोटीन से बना है. ईसीएम, संश्लेषित इकट्ठे, और कोशिकाओं द्वारा आयोजित और घटक प्रोटीन तंतु ऊतक प्रकार और विकास मंच के साथ बदलती हैं कि अद्वितीय रचनाओं, फाइबर आकार, geometries और परस्पर आर्किटेक्चर है है. हाल ही में काम ईसीएम संरचना और संरचना के मामले में ईसीएम recapitulating ऊतक इंजीनियरिंग और जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों के लिए biomimetic सामग्री के विकास के लिए सक्षम हो सकता है, सुझाव है कि इंजीनियर के ऊतकों 4 के लिए फार्म कोशिकाओं मार्गदर्शन करने के लिए शिक्षाप्रद cues प्रदान कर सकते हैं कि प्रदर्शन किया है.
निर्माण विधियों की एक संख्या के ऊतकों में ईसीएम के पहलुओं की नकल कर सकते हैं कि polymeric scaffolds इंजीनियर करने के लिए विकसित किया गया है. उदाहरण के लिए, electrospinning और चरण separव्यावहारिक दोनों नीचे micrometers के दसियों से नैनोमीटर 5-7 की दसियों को लेकर व्यास के साथ फाइबर का झरझरा matrices फार्म की क्षमता का प्रदर्शन किया है. दोनों तकनीकों भी nanofibers के बेहद असुरक्षित matrices पाड़ 8 में सेल आसंजन और घुसपैठ का समर्थन कर सकते हैं कि पता चला है. हालांकि, इन तरीकों से बनाया जा सकता है कि संभव फाइबर geometries, झुकाव और 3 डी आर्किटेक्चर में सीमित कर रहे हैं. चरण जुदाई अनियमित उन्मुख फाइबर के साथ scaffolds पैदा करता है जबकि Electrospinning आमतौर पर बेतरतीब ढंग से उन्मुख या अत्यधिक गठबंधन या तो फाइबर के साथ scaffolds पैदा करता है. सामग्री पर सीमाओं के शोधकर्ताओं आम तौर पर इस तरह के पाली बाद में सेल आसंजन को बढ़ावा देने के ईसीएम प्रोटीन के साथ लेपित हैं कि (ε-caprolactone) 8 और पाली (लैक्टिक सह एसिड) 9, के रूप में, सिंथेटिक पॉलिमर उपयोग करने के साथ, वहाँ भी कर रहे हैं. प्राकृतिक biopolymers भी, कोलेजन प्रकार मैं 10 जिलेटिन, 11, फाइब्रिनोजेन 12 सहित, उपयोग किया जाता हैchitosan 13, और रेशम 14, लेकिन देशी ऊतकों में पाया प्रोटीन के केवल एक छोटे सबसेट का प्रतिनिधित्व करते हैं. सबसे ऊतकों मौजूदा तरीकों का उपयोग कर nanofibers निर्माण के लिए मुश्किल या असंभव हैं कि fibronectin (एफ एन), laminin (एल एन), कोलेजन प्रकार चतुर्थ और hyaluronic एसिड सहित ईसीएम प्रोटीन और polysaccharides के एक बड़े वातावरण में होते हैं.
इस चुनौती का पता, हम कोशिकाओं को इकट्ठा करने और अपने परिवेश में ईसीएम प्रोटीन तंतुओं का आयोजन, synthesize तरह से नकल उतार पर हमारे अनुसंधान प्रयासों पर ध्यान केंद्रित किया है. विशिष्ट तन्तुजनन प्रक्रिया अलग ईसीएम प्रोटीन के लिए बदलता रहता है, जबकि आमतौर पर ईसीएम प्रोटीन अणु में एक गठनात्मक परिवर्तन गुप्त आत्म विधानसभा साइटों को उजागर करता है, जो एक enzymatic या रिसेप्टर की मध्यस्थता बातचीत, से शुरू हो रहा है. यहाँ हम बेहतर तन्तुजनन प्रक्रिया को समझने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में एफ एन का उपयोग करें. संक्षेप में, एफ एन homodimers 10 वीं प्रकार द्वितीय में RGD अमीनो एसिड अनुक्रम के माध्यम से कोशिका की सतह पर रिसेप्टर्स integrin करने के लिए बाध्यमैं इकाई दोहराएँ. एक बार ही, integrins actomyosin संकुचन के माध्यम से अलग ले और गुप्त आत्म विधानसभा साइटों को बेनकाब करने के लिए एफ एन dimers प्रकट करना. इन FN-एफ एन बाध्यकारी साइटों के लिए जोखिम सही कोशिका की सतह 15 पर एक अघुलनशील महीन रेशा में इकट्ठा करने के लिए एफ एन dimers सक्षम बनाता है. सेल मुक्त प्रणाली में कार्य गुप्त FN-एफ एन बाध्यकारी साइटों एक हवाई तरल ठोस इंटरफ़ेस 17-19 में denaturants 16 या सतह तनाव का उपयोग खुलासा माध्यम से पता चला जा सकता है कि प्रदर्शन किया है. हालांकि, इन तकनीकों के द्वारा बनाई गई एफ एन फाइबर विशिष्ट फाइबर आकार और geometries के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं और आम तौर पर एक सतह के लिए बाध्य कर रहे हैं.
यहाँ हम मुक्त खड़े अघुलनशील nanofibers, nanofabrics (2 डी शीट) और (चित्रा 1 एक या कई ईसीएम प्रोटीन से बना अन्य nanostructures बनाने के लिए प्रोटीन सतह बातचीत के उपयोग से इन सीमाओं पर काबू एक दृष्टिकोण है कि करार सतह शुरू की विधानसभा (एसआईए) 20 वर्णन ). इस पी मेंrocess, ईसीएम प्रोटीन समाधान में एक कॉम्पैक्ट, गोलाकार रचना से adsorbed और आंशिक रूप से एक नमूनों, हाइड्रोफोबिक polydimethylsiloxane (PDMS) के टिकट पर (सामने आया) विकृत कर रहे हैं. ईसीएम प्रोटीन तो 22 मुद्रण microcontact के माध्यम से एक thermally संवेदनशील पाली (एन isopropylacrylamide) (PIPAAm) की सतह पर इस राज्य में स्थानांतरित कर रहे हैं. 40 डिग्री सेल्सियस पानी के साथ हाइड्रेटेड जब PIPAAm एक ठोस बनी हुई है, लेकिन 32 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा जब यह यह हाइड्रोफिलिक हो जाता है, जहां एक कम महत्वपूर्ण समाधान तापमान (LCST) से होकर गुजरता है, पानी के साथ पहुँच जाती है और फिर घुल, के बंद इकट्ठे ईसीएम nanostructures, रिहा सतह. एसआईए विधि नैनोमीटर पैमाने परिशुद्धता के साथ आयामों पर नियंत्रण प्रदान करता है. ऐसी रचना, फाइबर ज्यामिति, और वास्तुकला के रूप में मुख्य मापदंडों को नियंत्रित करके, यह vivo में पाया ईसीएम के कई गुण पुनरावृत्ति करना और ऊतक इंजीनियरिंग और जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों के लिए उन्नत scaffolds का विकास संभव है.
Protocol
Representative Results
Discussion
एसआईए विधि यहाँ mimics सेल की मध्यस्थता मैट्रिक्स विधानसभा प्रस्तुत और tunable आकार, संगठन और संरचना के साथ ईसीएम प्रोटीन nanofibers और nanostructures के इंजीनियरिंग में सक्षम बनाता है. सेल उत्पन्न ईसीएम के समान नहीं है, जबकि ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
वित्तीय समर्थन एनआईएच के निदेशक नई अन्वेषक पुरस्कार (1DP2HL117750) से Dowd-ICES फैलोशिप से QJ करने और AWF के लिए, पुनर्योजी चिकित्सा T32 ट्रेनिंग प्रोग्राम (2T32EB003392) में एनआईएच Biomechanics से JMS के लिए प्रदान किया गया.
Materials
| Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm | Polysciences | 21458-10 | 40,000 Mw |
| Sylgard 184 Silicone kit (PDMS) | Dow Corning | Mix 10 parts base with 1 part curing agent. | |
| Butanol | |||
| Fibronectin | BD biosciences | 354008 | Human, 1mg |
| Laminin | BD biosciences | 354239 | Ultrapure, mouse, 1mg |
| Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU8 Developer | Microchem | ||
| Sonicator Branson M3510 | Branson Ultrasonic Corporation | CPN-952-318 | |
| Thinky ARE-250 Mixer | Thinky Corporation | ||
| Spincoater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| Glass cover 25mm diameter, No 1.5 | Fisher Scientific | 12-545-86 |
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