ECM 단백질 나노 섬유 및 나노 구조 엔지니어링 사용하여 표면 시작 회의
Summary
단일 또는 다수의 세포 외 기질 단백질로부터 나노 섬유 및 나노 구조 복합체를 얻는 방법을 설명한다. 이 방법은 조직 공학 및 생명 공학 응용 프로그램의 다양한 사용을위한 조정 가능한 구성과 아키텍처 무료 서 단백질 계 물질을 생성하는 단백질 표면의 상호 작용을 사용합니다.
Abstract
조직의 세포 외 기질 (ECM)의 합성과 밀접 규제 섬유 직경, 조성 및 조직 차원 섬유 성 단백질의 네트워크를 형성하기 위해 세포에 의해 조립된다. 구조적지지를 제공하는 것 외에도, ECM의 물리 화학적 특성은 접착 성, 분화 및 세포 사멸 등 다양한 세포 과정에 중요한 역할을한다. 생체, ECM은 단백질 내에서 암호화 된 자기 조립 (fibrillogenesis) 사이트를 노출시킴으로써 조립할 . 이 과정은 다른 단백질을 다양하지만, 피브로넥틴 (FN) fibrillogenesis 잘 특징입니다 세포 매개 ECM 조립을위한 모델 시스템 역할을합니다. 특히, 세포는 불용성 섬유로 어셈블리에 대한 바인딩 사이트를 펼치고 노출 FN 이량 체 및 actomyosin 생성 수축력을 바인딩하는 세포막에 인테그린 수용체를 사용합니다. 이 수용체 – 중재 과정은 조직 SCA에 세포에서 ECM을 조립하고 구성하는 세포 수레. 여기, 우리는 ECM 단백질을 전개하고 불용성 섬유로 그들을 조립하는 단백질 표면의 상호 작용을 이용하여 세포 매개 매트릭스 어셈블리를 되풀이되었습니다 방법이라면 시작한 어셈블리 (SIA)를 제시한다. 첫째, ECM 단백질들은 부분적으로 (펼치) 변성 및 암호화 된 바인딩 도메인을 노출 소수성 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 표면에 흡착된다. 펼쳐진 단백질은 다음 열 감응성 폴리 (N-이소 프로필) (PIPAAm) 표면에 미세 접촉 인쇄를 통해 잘 정의 된 마이크로 및 나노 패턴을에 전송됩니다. PIPAAm의 열 트리거 용해 최종 조립과 잘 정의 된 지오메트리와 불용성 ECM 단백질 나노 섬유 및 나노 구조의 릴리스로 연결됩니다. 복잡한 구조는 미세 접촉 인쇄에 사용되는 PDMS 스탬프에 엔지니어링 정의 된 패턴에 의해 가능하다. FN 이외에, SIA 프로세스는 라미닌, 피브리노겐으로 사용될 수 있고 콜라겐은 I 및 IV는 다 성분 ECM의 나노 구조를 만드는 입력뚜. 따라서, SIA는 생체 내에서 ECM의 구조와 구성을 다시 요약하기 위해 단백질 조성물, 섬유 형상 및 지지체 구조를 정확하게 제어하여 ECM 단백질 계 물질을 설계하는 데 사용될 수있다.
Introduction
조직의 세포 외 기질 (ECM)를 부착, 증식, 분화 및 세포 사멸 1-3 포함한 여러 세포 프로세스의 물리적, 화학적 조절에 관여 다기능 단백질로 구성되어있다. ECM은, 합성, 조립 및 세포 조직의 구성 단백질 섬유 조직의 종류와 발달 단계에 따라 달라 독특한 성분, 섬유의 크기, 형상 및 상호 연결된 구조를 가지고있다. 최근 작품은 ECM이 조성과 구조의 측면에서 ECM을 recapitulating하는 조직 공학 및 생명 공학 응용을위한 생체 모방 재료의 개발을 가능하게 할 수 있다고 제안, 설계 조직 4를 형성하는 세포를 안내하는 유익한 단서를 제공 할 수 있음을 보여 주었다.
제조 방법의 수는 조직에 ECM의 측면을 모방 할 중합체 골격을 설계하기 위해 개발되었다. 예를 들어, 전기 방사 및 위상 저전압 회로 차단기ATION 모두 다운 수십 마이크로 미터에서 나노 미터 5-7 수십에 이르는 직경 섬유의 다공성 매트릭스를 형성하는 능력을 증명하고있다. 두 가지 기술은 나노 섬유의 다공성 매트릭스는 발판 (8)에 세포 부착 및 침투를 지원할 수있는 것으로 나타났습니다. 그러나 이러한 접근 방식을 만들 수 있습니다 가능한 섬유 형상, 방향 및 3D 아키텍처에 제한됩니다. 상 분리가 무작위로 지향 섬유 지지체를 생산하는 반면 전기 방사는 일반적으로 무작위로 지향 또는 매우 정렬 된 하나 섬유 발판을 생산하고 있습니다. 재료에 대한 제한은 연구자 전형적 폴리이어서 세포 부착을 촉진하는 ECM 단백질로 코팅된다 (ε-카프로 락톤) (8) 및 폴리 (락트산 – 코 – 글리콜 산) (9)와 같은 합성 중합체를 사용하여도있다. 자연 생물 중합체는 또한, 콜라겐 타입 I (10), 젤라틴 (11), 피브리노겐 (12)을 포함하여 사용된다키토산 (13), 실크 (14) 만 네이티브 조직에서 발견되는 단백질의 일부만을 나타낸다. 대부분의 조직은 기존의 방법을 사용하여 나노 섬유를 제조하기가 어렵거나 불가능한 피브로넥틴 (FN), 라미닌 (LN), 콜라겐 IV 형과 히알루 론산 등의 ECM 단백질과 다당류의 더 큰 환경을 포함한다.
이 문제를 해결하기 위해, 우리는 세포가 조립하고 자신의 주변에서 ECM 단백질 섬유를 구성, 합성 방식을 흉내 낸에 대한 우리의 연구 노력을 집중했다. 특정 fibrillogenesis 프로세스가 상이한 ECM 단백질에 대해 다르지만, 일반적 ECM 단백질 분자의 입체 형태 변화가 애매한 자기 조립 사이트를 노출 효소 또는 수용체 매개의 상호 작용에 의해 트리거된다. 여기에서 우리는 더 fibrillogenesis 과정을 이해하는 모델 시스템으로 FN를 사용합니다. 간단히, FN 동종이 량체는 10 타입 II에서 RGD의 아미노산 서열을 통해 세포 표면의 수용체 인테그린에 결합나는 장치를 반복합니다. 일단 바인딩, 인테그린은 actomyosin 수축을 통해 떨어져 이동하고 암호화 된 자기 조립 사이트를 노출하는 FN 이량 체를 전개. 이 FN-FN 결합 부위의 노출은 바로 세포 표면 (15)에 불용성 브릴로 조립하는 FN 이합체 수 있습니다. 세포가없는 시스템에서 작업은 암호화 된 FN-FN 결합 부위가 공기 – 액체 – 고체 인터페이스 17-19에서 변성제 16 또는 표면 장력을 사용하여 전개를 통해 공개 될 수 있음을 보여 주었다. 그러나, 이들 기술에 의해 생성 된 FN 섬유는 특정 섬유 크기 및 형상에 제한되며, 일반적으로 표면에 결합된다.
여기에 우리가 독립 불용성 나노 섬유, nanofabrics (2D 시트) (그림 1 단일 또는 다중 ECM 단백질로 구성된 다른 나노 구조를 만드는 단백질 표면의 상호 작용을 이용하여 이러한 한계를 극복 할 방법이라면 시작한 어셈블리 (SIA) (20)를 설명 ). 이 P에서로웠은, ECM 단백질은 용액에서 소형, 구형 형태에서 흡착 부분적 패턴, 소수성 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 스탬프 상 (펼쳐진) 변성된다. ECM 단백질은 다음 22 인쇄 미세 접촉을 통해 열 감응성 폴리 (N-이소 프로필) (PIPAAm) 표면에이 상태로 전송됩니다. 40 ° C의 물에 수화 때 PIPAAm 고체 남아 있지만, 32 °의 C로 냉각 할 때 그것은 친수성이되는 낮은 임계 용액 온도 (LCST)를 통과, 물에 팽윤하고 용해 떨어져 조립 ECM 나노 구조를 해제 면. SIA 방법은 나노 미터 스케일의 정밀 치수 제어를 제공한다. 이러한 구성, 섬유 형상 및 구조와 같은 주요 파라미터를 제어함으로써, 생체 내에서 발견 된 ECM의 여러 속성을 요점을 되풀이하고, 조직 공학 및 생명 공학 응용을위한 고급 발판을 개발하는 것이 가능하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
SIA의 방법은 여기에서 모방 세포 매개 매트릭스 어셈블리를 제시하고 조정할 수있는 크기, 조직 및 구성과 ECM 단백질 나노 섬유 및 나노 구조의 설계를 가능하게한다. 세포 생성 ECM과 동일하지는 않지만, SIA는 기계적 변형 21 일 동안 전개 / 가역 접는를 받아야 세포 20을 바인딩 할 수 있습니다 나노 단백질 섬유 (20)로 구성 ECM을 만듭니다. 이것은 생체 내에서 발견 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
금융 지원은 NIH 감독의 새로운 혁신 상 (1DP2HL117750)에서 다우드-ICES 교제 QJ과 AWF에, 재생 의학 T32 교육 프로그램 (2T32EB003392)에 NIH 역학에서 JMS에 제공되었다.
Materials
| Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm | Polysciences | 21458-10 | 40,000 Mw |
| Sylgard 184 Silicone kit (PDMS) | Dow Corning | Mix 10 parts base with 1 part curing agent. | |
| Butanol | |||
| Fibronectin | BD biosciences | 354008 | Human, 1mg |
| Laminin | BD biosciences | 354239 | Ultrapure, mouse, 1mg |
| Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU8 Developer | Microchem | ||
| Sonicator Branson M3510 | Branson Ultrasonic Corporation | CPN-952-318 | |
| Thinky ARE-250 Mixer | Thinky Corporation | ||
| Spincoater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| Glass cover 25mm diameter, No 1.5 | Fisher Scientific | 12-545-86 |
References
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