ECM Белковые Нановолокон и наноструктуры Инженерная Использование Поверхность по инициативе Ассамблеи
Summary
Метод получения нановолокон и сложных наноструктур из одной или нескольких белков внеклеточного матрикса описана. Этот метод использует белок-поверхностные взаимодействия для создания на основе белков материалы свободно стоящая с перестраиваемой состава и архитектуры для использования в различных тканевой инженерии и биотехнологии приложений.
Abstract
Внеклеточного матрикса (ECM) в тканях синтезируется и собран клеток, чтобы сформировать 3D фибриллярных, сеть белка с жестко регулируется диаметра волокна, состава и организации. В дополнение к обеспечению структурной поддержки, физические и химические свойства ECM играют важную роль в нескольких клеточных процессов, включая адгезию, дифференцировки и апоптоза. В естественных условиях, ЕСМ собраны, подвергая загадочное самосборки (фибриллогенеза) сайтов в белках . Этот процесс варьируется для различных белков, но фибронектин (FN) фибриллогенез хорошо охарактеризованы и служит в качестве модельной системы для клеточного сборки ECM. В частности, клетки используют рецепторов интегрина на клеточной мембране, чтобы связать FN димеры и актомиозин генерируемые сократительные силы разворачиваться и подвергать сайты связывания для сборки в нерастворимые волокна. Этот процесс рецептор-опосредованного позволяет клетки собрать и организовать ECM от сотовой, чтобы ткани SCAле. Здесь мы представляем метод называется поверхность инициативе в сборе (SIA),, которая рассматривает сборку матрицу клеточный помощью белка-поверхностные взаимодействия разворачиваться ECM белков и собрать их в нерастворимые волокна. Во-первых, ECM белки адсорбируются на гидрофобной полидиметилсилоксана (PDMS) поверхности, где они частичной денатурации (раскройте) и выставить загадочные связывающие домены. В развернутые белки, которые затем передаются в четко определенных микро-и nanopatterns через микроконтактной печати на термочувствительной поли (N-изопропилакриламида) (PIPAAm) поверхности. Термически срабатывает роспуск PIPAAm приводит к окончательной сборки и выпуска нерастворимых ECM белка нановолокон и наноструктур с четко определенными геометрий. Сложные архитектуры возможны инженерными определяется узоры на марках PDMS, используемых для микроконтактной печати. В дополнение к FN, процесс SIA может быть использован с ламинин, фибриногена и коллагены типа I и IV, чтобы создать многокомпонентный ECM наноструктурвания. Таким образом, SIA может использоваться для проектирования на основе белков ЕСМ материалов с точным контролем над белковой композиции, геометрии волокна и лесов архитектуры для того, чтобы повторять структуру и состав внеклеточного матрикса в естественных условиях.
Introduction
Внеклеточного матрикса (ECM) в тканях состоит из многофункциональных белков, участвующих в физической и химической регуляции нескольких процессов адгезии клеток, включая, пролиферации, дифференцировки и апоптоза 1-3. ЕСМ синтезируется, собран и организован клеток и составляющие белковые фибриллы имеют уникальные композиции, размер волокна, геометрии и взаимосвязанные архитектуры, которые меняются в зависимости от типа ткани и стадии развития. Последние работы показал, что ECM может обеспечить поучительные сигналы для руководства клеток образовывать инженерии тканей 4, предполагая, что Резюмируя ECM с точки зрения состава и структуры может способствовать развитию биомиметических материалов для тканевой инженерии и биотехнологии приложений.
Ряд способов изготовления были разработаны для проектирования полимерных каркасов, которые могут имитировать аспекты ЕСМ в тканях. Например, электропрядения и фаза СовместноеAtion оба продемонстрировали способность к образованию пористых матриц волокон с диаметром от десятков микрометров до десятков нанометров 5-7. Оба метода показали также, что очень пористые матрицы нановолокон может поддерживать клеточную адгезию и проникновение в эшафот 8. Однако эти подходы ограничены в возможных волокна геометрий, ориентаций и 3D архитектур, которые могут быть созданы. Электропрядения обычно производит строительные леса либо случайно ориентированных или сильно выровненных волокон, тогда как разделение фаз производит строительные леса со случайно ориентированными волокнами. Существуют также ограничения на материалах с использованием исследователи обычно синтетические полимеры, такие как поли (ε-капролактон) 8 и поли (молочной-со-гликолевой кислоты) 9, который впоследствии покрывают белков ЕСМ в целях содействия адгезии клеток. Природные биополимеры, также используются, в том числе коллагена типа I 10, желатин 11, фибриноген 12,хитозан 13, и шелк 14, но они представляют лишь небольшую часть белков, обнаруженных в нативной ткани. Большинство тканей содержат большее среду белков ЕСМ и полисахаридов, включая фибронектин (FN), ламинин (LN), коллагена типа IV и гиалуроновой кислоты, которые трудно или невозможно изготовить нановолокон с использованием существующих методов.
Для решения этой проблемы, мы сосредоточили наши усилия исследования на имитируя путь клетки синтезировать, собрать и организовать ECM белка фибрилл в их окружении. В то время как специфический процесс фибриллогенез варьируется для различных белков ECM, как правило, изменение конформации в молекуле ECM белка запускается с помощью ферментативных или рецептор-опосредованного взаимодействия, который предоставляет загадочные места самосборки. Здесь мы используем FN в качестве модельной системы, чтобы лучше понять процесс фибриллогенеза. Вкратце, FN гомодимеры связываются с интегрином рецепторы на поверхности клетки с помощью последовательности RGD аминокислоты в 10-м типа IIПовторяю блок. После связывания интегрины раздвигаются с помощью сокращения актомиозинового и разворачиваться димеры FN выставить загадочные места самосборки. Разоблачение этих сайтов связывания FN-НС позволяет димеры FN собрать в нерастворимый фибриллы прямо на поверхности клетки 15. Работа в бесклеточных системах показал, что криптические сайты связывания FN-FN могут быть выявлены через развертывание с использованием денатурирующих 16 или поверхностное натяжение на воздух-жидкость-твердое тело 17-19. Однако волокна FN, созданные этими методами ограничены конкретных размеров и геометрии волокна и, как правило, связаны с поверхностью.
Здесь мы опишем подход называется, поверхность инициативе в сборе (SIA) 20, который преодолевает эти ограничения, используя белок-поверхностные взаимодействия для создания свободно стоящая нерастворимые нановолокон, nanofabrics (2D листов) и других наноструктур, состоящих из одного или нескольких белков ECM (рис. 1 ). В этом рrocess, ECM белки адсорбируются от компактного, шаровидной конформации в растворе и частично денатурированный (в сборе) на узорной, гидрофобный полидиметилсилоксана (PDMS) марки. Контроллер ЭСУД белки, которые затем передаются в этом состоянии на термочувствительного поли (N-изопропилакриламида) (PIPAAm) поверхности через микроконтактной печати 22. Когда гидратируют 40 ° С воды PIPAAm остается твердым, но при охлаждении до 32 ° С он проходит через ниже критической температуры раствора (НКТР), где она становится гидрофильной, набухает водой, а затем растворяется, высвобождая собранные ECM наноструктур офф поверхность. Метод SIA обеспечивает контроль над размерами с нанометрового масштаба точностью. Контролируя ключевые параметры, такие как композиции, геометрии волокна, и архитектуры, можно резюмировать многие свойства ЕСМ, найденные в естественных условиях и для разработки современных лесов для тканевой инженерии и биотехнологии приложений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод SIA представленные здесь имитирует клеточный узел матрицы и позволяет инжиниринг ECM белка нановолокон и наноструктур с размером перестраиваемый, организации и состава. В то время как не идентичны клеток генерируемые ECM, SIA создает ECM состоит из наноразмерных белковых волокон 20,</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансовая поддержка была оказана в JMS от NIH биомеханики в регенеративной медицине программы T32 подготовки (2T32EB003392), чтобы QJ от Дауд-ICES стипендий и АСФ из Нью-премии Новатор Директора NIH (1DP2HL117750).
Materials
| Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm | Polysciences | 21458-10 | 40,000 Mw |
| Sylgard 184 Silicone kit (PDMS) | Dow Corning | Mix 10 parts base with 1 part curing agent. | |
| Butanol | |||
| Fibronectin | BD biosciences | 354008 | Human, 1mg |
| Laminin | BD biosciences | 354239 | Ultrapure, mouse, 1mg |
| Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU8 Developer | Microchem | ||
| Sonicator Branson M3510 | Branson Ultrasonic Corporation | CPN-952-318 | |
| Thinky ARE-250 Mixer | Thinky Corporation | ||
| Spincoater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| Glass cover 25mm diameter, No 1.5 | Fisher Scientific | 12-545-86 |
References
- Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix and the cytoskeleton. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 793-805 (2001).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. . Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. l. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
- Teo, W. E., Ramakrishna, S. A review on electrospinning design and nanofibre assemblies. Nanotechnology. 17, (2006).
- Reneker, D. H., Chun, I. Nanometre diameter fibres of polymer, produced by electrospinning. Nanotechnology. 7, 216-21 (1996).
- Ma, P. X., Zhang, R. Synthetic nano-scale fibrous extracellular matrix. Journal of Biomedical Materials Research. 46, 60-72 (1999).
- Yoshimoto, H., Shin, Y. M., Terai, H., Vacanti, J. P. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24, 2077-2082 (2003).
- Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: a novel scaffold for tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research. 60, 613-621 (2002).
- Matthews, J. A., Wnek, G. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. . Electrospinning of Collagen Nanofibers. Biomacromolecules. 3, 232-238 (2002).
- Huang, Z. -. M., Zhang, Y. Z., Ramakrishna, S., Lim, C. T. Electrospinning and mechanical characterization of gelatin nanofibers. Polymer. 45, 5361-5368 (2004).
- Wnek, G. E., Carr, M. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. . Electrospinning of Nanofiber Fibrinogen Structures. Nano Letters. 3, 213-216 (2002).
- Bhattarai, N., Edmondson, D., Veiseh, O., Matsen, F. A., Zhang, M. Electrospun chitosan-based nanofibers and their cellular compatibility. Biomaterials. 26, 6176-6184 (2005).
- Jin, H. -. J., Chen, J., Karageorgiou, V., Altman, G. H., Kaplan, D. L. Human bone marrow stromal cell responses on electrospun silk fibroin mats. Biomaterials. 25, 1039-1047 (2004).
- Wierzbicka-Patynowski, I., Schwarzbauer, J. E. The ins and outs of fibronectin matrix assembly. Journal of Cell Science. 116, 3269-3276 (2003).
- Mosher, D. F., Johnson, R. B. In vitro formation of disulfide-bonded fibronectin multimers. Journal of Biological Chemistry. 258, 6595-6601 (1983).
- Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biology. 27, 451-461 (2008).
- Ulmer, J., Geiger, B., Spatz, J. P. Force-induced fibronectin fibrillogenesis in vitro. Soft Matter. 4, 1998-2007 (2008).
- Klotzsch, E., et al. Fibronectin forms the most extensible biological fibers displaying switchable force-exposed cryptic binding sites. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. , (2009).
- Feinberg, A. W., Parker, K. K. Surface-Initiated Assembly of Protein Nanofabrics. Nano Letters. 10, 2184-2191 (2010).
- Deravi, L. F., et al. Differential Contributions of Conformation Extension and Domain Unfolding to Properties of Fibronectin Nanotextiles. Nano Letters. 12, 5587-5592 (2012).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J Vis Exp. , 1065 (2008).
- Vogel, V. Mechanotransduction Involving Multimodular Proteins: Converting Force into Biochemical Signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).
