Las nanofibras ECM proteínas y Uso Asamblea Superficie iniciadas Nanoestructuras Engineered
Summary
Un método para obtener nanofibras y nanoestructuras complejas de proteínas de la matriz extracelular individuales o múltiples se describe. Este método utiliza las interacciones proteína-superficie para la creación de materiales a base de proteínas exentas con la composición sintonizable y la arquitectura para el uso en una variedad de aplicaciones de ingeniería de tejidos y de biotecnología.
Abstract
La matriz extracelular (ECM) en los tejidos se sintetiza y ensambla por las células para formar un fibrilar 3D, la red de proteínas con estrictamente regulados diámetro de la fibra, la composición y la organización. Además de proporcionar soporte estructural, las propiedades físicas y químicas de la ECM desempeñan un papel importante en varios procesos celulares que incluyen la adhesión, diferenciación y apoptosis. In vivo, el ECM se ensambla mediante la exposición de críptico de auto-ensamblaje (fibrilogénesis) sitios dentro de las proteínas . Este proceso varía para diferentes proteínas, pero la fibronectina (FN) fibrilogénesis es bien caracterizado y sirve como un sistema modelo para el montaje de ECM mediada por células. Específicamente, las células utilizan receptores de la integrina en la membrana celular para unirse dímeros FN y las fuerzas contráctiles de actomiosina-generada para desplegar y exponer sitios de unión para el montaje en fibras insolubles. Este proceso mediado por receptor permite que las células de montar y organizar el ECM desde el celular al tejido scales. A continuación, presentamos un conjunto iniciado por superficie método denominado (SIA), que recapitula el montaje matriz mediada por células mediante interacciones proteína-superficie para desplegar proteínas ECM y ensamblarlos en fibras insolubles. En primer lugar, las proteínas ECM se adsorben sobre un polidimetilsiloxano (PDMS) hidrófobo superficie donde se desnaturalizan parcialmente (desplegar) y exponen dominios de unión crípticos. Las proteínas no plegadas se transfieren luego en bien definidos micro y nanopatterns través de la impresión microcontacto sobre un poli térmicamente sensible (N-isopropilacrilamida) (PIPAAm) superficie. Disolución térmicamente activado de la PIPAAm conduce hasta el montaje final y la liberación de nanofibras de proteínas ECM insolubles y nanoestructuras con geometrías bien definidas. Arquitecturas complejas son posibles por los patrones de ingeniería se define en los sellos PDMS utilizados para la impresión por microcontacto. Además de FN, el proceso de SIA se puede utilizar con la laminina, fibrinógeno y colágenos de tipo I y IV a crear nanoestructuras ECM de componentes múltiplesturas. Por lo tanto, SIA se puede utilizar para diseñar materiales a base de proteínas de ECM con un control preciso sobre la composición de proteínas, la geometría de la fibra y la arquitectura andamio con el fin de recapitular la estructura y la composición de la MEC in vivo.
Introduction
La matriz extracelular (ECM) en los tejidos se compone de proteínas multifuncionales implicadas en la regulación física y química de múltiples procesos celulares, incluyendo la adhesión, la proliferación, la diferenciación, la apoptosis y 1-3. El ECM está sintetizado, ensamblado, y organizada por las células y las fibrillas de proteínas constituyentes tienen composiciones únicas, tamaño de la fibra, geometrías y arquitecturas interconectadas que varían con el tipo de tejido y la etapa de desarrollo. Trabajos recientes han demostrado que el ECM puede proporcionar señales instructivas para guiar a las células para formar tejidos de ingeniería 4, lo que sugiere que la recapitulación de la ECM en términos de composición y estructura podría permitir el desarrollo de materiales biomiméticos para aplicaciones de ingeniería de tejidos y de biotecnología.
Un número de métodos de fabricación se han desarrollado para diseñar andamios poliméricos que pueden imitar aspectos de la ECM en los tejidos. Por ejemplo, electrospinning y separ faseción han demostrado tanto la capacidad para formar matrices porosas de fibras con diámetros que van desde decenas de micrómetros abajo hasta decenas de nanómetros 5-7. Ambas técnicas han demostrado también que las matrices altamente porosas de nanofibras pueden apoyar la adhesión celular y la infiltración en el armazón 8. Sin embargo, estos métodos son limitados en las geometrías de fibra, orientaciones y 3D posibles arquitecturas que se pueden crear. Electrospinning produce típicamente andamios con fibras orientadas al azar o ya sea altamente alineados mientras que la separación de fases produce andamios con fibras orientadas al azar. También hay limitaciones en los materiales, con los investigadores típicamente usando polímeros sintéticos, tales como poli (ε-caprolactona) 8 y poli (ácido láctico-co-glicólico) 9, que posteriormente se recubre con proteínas de ECM para promover la adhesión celular. También se utilizan los biopolímeros naturales, incluyendo el colágeno de tipo I 10, gelatina 11, fibrinógeno 12,quitosano 13, 14 y seda, pero representan sólo una pequeña parte de las proteínas que se encuentran en el tejido nativo. La mayoría de los tejidos contienen un medio más grande de proteínas ECM y polisacáridos incluyendo la fibronectina (FN), laminina (LN), colágeno tipo IV y ácido hialurónico que son difíciles o imposibles de fabricar nanofibras utilizando métodos existentes.
Para hacer frente a este desafío, hemos centrado nuestros esfuerzos de investigación en la imitación de la forma en las células de sintetizar, reunir y organizar las fibrillas de proteínas ECM en sus alrededores. Mientras que el proceso de fibrilogénesis específica varía para diferentes proteínas ECM, típicamente un cambio conformacional en la molécula de proteína de ECM se activa por un enzimática o la interacción mediada por receptor, que expone sitios de autoensamblaje crípticos. Aquí se utiliza FN como un sistema modelo para comprender mejor el proceso de fibrilogénesis. Brevemente, homodímeros FN se unen a los receptores de integrina en la superficie celular a través de la secuencia de aminoácidos RGD en el décimo tipo IIRepito unidad. Una vez unido, las integrinas se separan a través de la contracción actomiosina y despliegan los dímeros FN para exponer los sitios de autoensamblaje crípticos. La exposición de estos sitios de unión FN FN-permite a los dímeros de FN para montar en un fibrillas insolubles a la derecha en la superficie de la célula 15. El trabajo en sistemas libres de células se ha demostrado que los sitios crípticos vinculantes FN-FN pueden ser revelados a través de desarrollo usando desnaturalizantes 16 o la tensión superficial en la interfase aire-líquido-sólido 17-19. Sin embargo, las fibras FN creados por estas técnicas se limitan a los tamaños y geometrías de fibra específicas y típicamente se une a una superficie.
Aquí se describe un conjunto iniciado por superficie denominado enfoque (SIA) 20 que supera estas limitaciones mediante la utilización de las interacciones proteína-superficie para crear exentas nanofibras insolubles, nanofabrics (planos 2D) y otras nanoestructuras compuestas de proteínas únicas o múltiples de ECM (Figura 1 ). En esta proceso, proteínas ECM se adsorben a partir de una conformación compacta, globular en solución y parcialmente desnaturalizado (desplegado) en una, polidimetilsiloxano (PDMS) hidrófobo el sello estampado. Las proteínas ECM se transfieren entonces en este estado en un poli térmicamente sensible (N-isopropilacrilamida) (PIPAAm) superficie a través de la impresión por microcontacto 22. Cuando se hidrata con 40 ° C el agua la PIPAAm sigue siendo un sólido, pero cuando se enfría a 32 ° C que pasa a través de una temperatura de solución crítica inferior (LCST) donde se convierte en hidrófila, se hincha con agua y luego se disuelve, la liberación de las nanoestructuras de ECM montados fuera de la superficie. El método SIA proporciona control sobre las dimensiones con precisión a escala nanométrica. Mediante el control de los parámetros clave tales como la composición, la geometría de la fibra, y la arquitectura, es posible recapitular muchas propiedades de la ECM se han encontrado in vivo y para desarrollar andamios avanzados para aplicaciones de ingeniería de tejidos y de biotecnología.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método SIA presenta aquí imita la matriz de montaje mediada por células y permite la ingeniería de nanofibras y nanoestructuras de proteínas ECM con el tamaño sintonizable, organización y composición. Aunque no es idéntica a la ECM de células generadas, SIA crea ECM compuesta de fibrillas de proteína nanoescala 20 que se someten plegable reversible / desplegado durante la tensión mecánica 21 y se pueden unir las células 20. Esto proporciona una capacidad única para cons…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Se prestó apoyo financiero a JMS de los NIH Biomecánica en el Programa de Capacitación T32 Medicina Regenerativa (2T32EB003392), a QJ del Dowd-ICES Fellowship y para AWF del Premio Innovador Nueva del director del NIH (1DP2HL117750).
Materials
| Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm | Polysciences | 21458-10 | 40,000 Mw |
| Sylgard 184 Silicone kit (PDMS) | Dow Corning | Mix 10 parts base with 1 part curing agent. | |
| Butanol | |||
| Fibronectin | BD biosciences | 354008 | Human, 1mg |
| Laminin | BD biosciences | 354239 | Ultrapure, mouse, 1mg |
| Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU8 Developer | Microchem | ||
| Sonicator Branson M3510 | Branson Ultrasonic Corporation | CPN-952-318 | |
| Thinky ARE-250 Mixer | Thinky Corporation | ||
| Spincoater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| Glass cover 25mm diameter, No 1.5 | Fisher Scientific | 12-545-86 |
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