Fotoaktiveret lokalisering mikroskopi (PALM) kombineret med enkelt-molekyle sporing giver mulighed for direkte observation og kvantificering af protein-DNA-interaktioner i levende Escherichia coli-celler.
Protein-DNA interaktioner er kernen i mange fundamentale cellulære processer. For eksempel er DNA-replikation, transskription, genopretning og kromosom organisation styret af DNA-bindende proteiner, som genkender specifikke DNA-strukturer eller sekvenser. In vitro eksperimenter har været med til at generere detaljerede modeller for funktionen af mange typer af DNA-bindende proteiner, og alligevel De nøjagtige mekanismer af disse processer og deres organisation i det komplekse miljø af den levende celle forbliver langt mindre forstået. Vi har for nylig indført en metode til at kvantificere DNA-reparation aktiviteter i levende Escherichia coli-celler ved hjælp Fotoaktiveret Lokalisering Microscopy (PALM) kombineret med enkelt-molekyle tracking. Vores generelle fremgangsmåde identificerer individuelle DNA-bindende begivenheder ved ændringen i mobilitet et enkelt protein ved associering med kromosomet. Fraktionen af bundne molekyler giver en direkte kvantitativ måling for proteinet handlingivity og overflod af substrater eller bindingssteder på enkelt-celle niveau. Her beskriver vi begrebet metoden og demonstrere prøveforberedelse, dataopsamling, og de procedurer, dataanalyse.
Denne protokol beskriver direkte måling af protein-DNA-interaktioner i levende Escherichia coli-celler. Teknikken udnytter ændringen i diffusionskoefficienten af et enkelt fluorescensmærket protein som binder kromosomet (figur 1). For at demonstrere den metode, vi anvender DNA-polymerase I (Pol1), en prototypisk DNA-bindende protein, der udfylder DNA huller i tilbagestående streng replikation og excision reparation veje 1.
Fremkomsten af super-opløsning fluorescensmikroskopi muliggør visualisering af molekylære strukturer i celler med nanometer opløsning. Fotoaktiveret Lokalisering Microscopy (PALM) beskæftiger fluorescerende proteiner, som kan aktiveres fra en indledende mørk tilstand til en fluorescerende tilstand (figur 2). Kun en delmængde af alle mærkede molekyler aktiveres til enhver tid at bestemme deres positioner på en sekventiel måde, uafhængigt af than samlede koncentration af mærkede molekyler i prøven 2. Lokaliseringen præcision pr molekyle afhænger primært af størrelsen af den fluorescerende punktspredningsfunktion (PSF), antallet af indsamlede fotoner, og baggrunden signal 3. Mange anvendelser af denne fremgangsmåde fokuserer på forbedret visualisering af cellulære strukturer. Erkendelsen af, at PALM kan kombineres med enkelt-molekyle sporing 4 åbnet nye veje til direkte følge bevægelsen af vilkårlige antal mærkede proteiner i levende celler. Øget følsomhed og tidslig opløsning af fluorescens mikroskoper nu tillade sporing af enlige spredende fluorescerende proteiner i bakteriens cytoplasma 5..
Her beskæftiger vi PAmCherry, et konstrueret fluorescerende protein, der uigenkaldeligt konverterer fra en indledende fluorescerende tilstand til en fluorescerende tilstand ved bestråling med 405 nm lys 6. Aktiverede PAmCherry fluoroforer kan billedetd ved excitation ved 561 nm og følges i flere frames indtil fotoblegning. Vi demonstrerer evne metode til at identificere forbigående DNA-bindende begivenheder enkelt proteiner ved hjælp af en fusion af Pol1 og PAmCherry. Behandling af celler med methylmethansulfonat (MMS) forårsager DNA methylering skader, der er slået ind gapped DNA substrater ved basen-excision reparation enzymer. Vores metode viser tydelig binding af enkelte Pol1 molekyler som reaktion på MMS skade 7..
Vi diskuterer en række centrale overvejelser for succes i forsøget.
Valg og ekspression af fluorescerende fusionsprotein: Der er en stor palet af fotoaktiverbare og photoswitchable fluorescerende proteiner 17. Det specifikke valg afhænger af mikroskopets egenskaber, især lasere og filtre til rådighed. Kombinationen af 405 nm og 561 nm er ideel til almindelige fotoaktiverbare fluorescerende proteiner. Vi valgte PAmCherry 6, fordi det er monomert og viste ingen aggregering i celler. Endvidere irreversibel fotoaktivering muliggør tælling af antallet af aktiverede fluoroforer at måle protein kopiantal pr celle. I stedet for at udtrykke fusionsproteinet fra et plasmid, foretrækker vi kromosomale indsættelse af genet, som koder for fusionsproteinet på vildtype-locuset. Dette sikrer fuldstændig udskiftning af proteinet af interesse med fluorescerende version og opretholdelse ekspressionsniveauet vildtype.
Fotoaktivering rate: Det er vigtigt at justere fotoaktiveringsprogrammet sådan hastighed, at mindre end et molekyle per celle i gennemsnit er i den fluorescerende tilstand i en ramme af filmen. Dette afhænger af 405 nm intensitet og antallet af molekyler tilbage at blive aktiveret. Ved meget lave billedbehandling tætheder dog ikke alle molekyler vil blive afbildet inden udgangen af filmen eller meget lange film skal erhverves. Antallet af billeder, der optages pr film afhænger af kopi antallet af fusionsproteiner per celle, og den gennemsnitlige fotoblegning levetid PAmCherry ved excitation betingelser. Kopien Antallet af Pol1 er ~ 400 molekyler / celle 1 og middelværdien af den eksponentielle fotoblegning levetid fordeling var ~ 4 frames. Ved at øge 405 nm intensitet gradvist, er aktiveringen jævnt fordelt over de 10.000 frames af filmen. Derfor har hver celle er occupIED af fluorescerende molekyler for i alt ~ 1.600 frames, sikrer lille overlapning af vævede og sporing komplikationer i en film på 10.000 frames.
Eksponeringstid og excitation intensiteter: Fremmest eksponeringstider skal være tilstrækkelig kort til at observere skarpe vævede med lidt bevægelse sløring. Imidlertid bør frame rate vælges til opnåelse af observerbare molekylær bevægelse mellem successive rammer uden lokalisering usikkerhed ellers vigtige fotoner brændt ved oversampling sporet. Bevægelsen af ubundne molekyler skal tages prøver fra tilstrækkelig lang tidsintervaller at være klart adskiller sig fra den tilsyneladende bevægelse af bundne molekyler på grund af lokalisering usikkerhed. Når eksponeringen er indstillet, skal PSF intensitet justeres. Lokaliseringen præcision af PSF stiger med antallet af fotoner detekteret i løbet af varigheden af en ramme. Højere excitation intensiteter øge photon emission rate but også fotoblegning sats og baggrundssignal. Anvend det lavest excitationsintensitet, der giver den ønskede lokalisering præcision. For Pol1-PAmCherry valgte vi 15,26 msek / ramme og 3,5 mW 561 nm excitation (400 W / cm 2). Det er vigtigt at bekræfte cellelevedygtighed for de særlige imaging betingelser ved at overvåge cellevækst og morfologi før og efter dataopsamling (se supplerende information i Uphoff et al. 7).
Pol1 udviser en bindende tid på ~ 2 sek til en gapped DNA substrat in vivo 7, og vi forventer derfor, at størstedelen af molekyler til at være enten i bunden eller ubunden tilstand for hele varigheden af et spor. Bundne molekyler forekommer væsentlige ubevægelig fordi kromosom sites har en diffusionskoefficient flere størrelsesordener lavere (~ 10 -5 mM 2 / sek, Elmore et al. 18) end Pol1 diffusion i cytoplasmaet (~ 1 mM 2 </sup> / sek).
Diffusion analyse: Den tilsyneladende diffusionskoefficient D * beregnes ud fra MSD af enkelte numre, i gennemsnit over et minimum af 4 trin (5 rammer) for at reducere den statistiske fejl. Bemærk, at ~ 75% af molekyler blege inden for mindre end 5 rammer for de billeddannende beskrevne. Sådanne korte numre giver ikke tilstrækkelig statistisk sikkerhed at skelne mellem bundne og ubundne molekyler. Men de relative fraktioner af bundne og ubundne molekyler, der rapporterer om proteinaktivitet er uafhængige af det samlede antal spor, der analyseres.
Det er nyttigt at redegøre for PSF lokalisering fejl (σ LOC) i beregningen af D * fordi usikkerheden tilføjer en tilsyneladende tilfældig skridt til hver lokalisering af et molekyle 15..
For at forbedre klassificeringen af bundne og spredende molekyler, anbefaler vi at beregne D * both fra enkelt-trins fordrivelser og forskydninger over tid af to frames. Det er da muligt at indstille to separate D * tærskler: D * (15 ms) <0,15 mM 2 / sek og D * (30 ms) <0,075 mM 2 / sek.
Bemærk, at D * er en tilsyneladende diffusionskoefficient, der er påvirket af celle indespærring af sporene og bevægelse sløring som følge af diffusion i løbet af eksponeringstiden. At udtrække præcise upartiske diffusionskoefficienter, har det vist sig nyttigt at sammenligne den observerede bevægelse til simulerede data baseret på en stokastisk Brownsk bevægelse model 5,7. Simulerede data kan også bruges til at teste procedurer dataanalyse.
Potentielle anvendelser af denne fremgangsmåde: Vi beskriver en generel fremgangsmåde til at visualisere og kvantificere protein-DNA-interaktioner in vivo ved ændringen i mobiliteten af et protein ved binding til kromosomet. Aktiviteterne af DNA-ellerRNA-bindende proteiner involveret i reparation, kan replikation, transkription og kromosom vedligeholdelse derfor skal følges i realtid på enkelt-celle niveau med en rumlig opløsning under optisk diffraktion grænsen. Fotoaktiveret enkelt molekyle sporing udvider traditionelle sporingsmetoder, der er begrænset til nogle få mærkede molekyler per celle. En alternativ metode, der måler molekylær diffusion in vivo er Fluorescence Recovery Efter Fotoblegning (FRAP). Mens FRAP er meget nyttigt til at måle globale diffusionskarakteristika i store celler, det er begrænset i sin evne til at løse en række molekylære arter med forskellige mobiliteter i et rumligt heterogent miljø, især for små bakterieceller.
Vi har anvendt fotoaktiveret enkelt molekyle sporing at måle DNA-bindende aktiviteter og subcellulære lokalisering af en række forskellige proteiner i E. coli herunder Pol1, DNA-ligase, Fis-protein, DNA-polymerase III 7, samt Strukturelle Vedligeholdelse af kromosomer proteiner MukB, E, og F 19. Vi forventer, at metoden også kan tilpasses til andre celletyper.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender Justin Pinkney og Johannes Hohlbein efter hjælp til opførelsen af skræddersyede mikroskop og Seamus Holden til lokalisering software. Rodrigo Reyes-Lamothe er takkede for at give E. coli-stamme. Forskningen blev støttet af Europa-Kommissionen syvende rammeprogram Grant FP7/2007-2013 SUNDHED-F4-2008 til 201.418, UK Bioteknologi og biologiske Sciences Research Council Grant BB/H01795X/1, og Det Europæiske Forskningsråd Grant 261.227 til ANK. DJS blev finansieret af en Wellcome Trust Program Grant WT083469. SU blev understøttet af en MathWorks ph.d.-stipendium.
E.coli strain carrying a chromosomal insertion for a PAmCherry DNA-binding fusion protein | created by Lambda-Red recombination | ||
MEM amino acids | Invitrogen | 11130-051 | minimal medium supplement |
MEM vitamins | Invitrogen | 11120-052 | minimal medium supplement |
Agarose | BioRad | 161-3100 | certified molecular biology grade |
Microscope coverslips No 1.5 thickness | Menzel | BB024060SC | remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1h |
Methyl methanesulfonate (MMS) | Sigma-Aldrich | 129925 | CAUTION: toxic |
PALM setup | home-built | described in Uphoff et al. 2013 | |
MATLAB | MathWorks | for data analysis and visualization | |
Localization software | custom-written, available online | http://www.physics.ox.ac.uk/Users/kapanidis/Group/Main.Software.html | MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. Cite Holden et al. 2010 if used in publication. |
Tracking software | available online | http://physics.georgetown.edu/matlab/ | MATLAB implementation by Blair and Dufresne. Cite Crocker & Grier 1996 if used in publication. |