Summary
단일 분자 추적과 함께 Photoactivated 현지화 현미경 (PALM)은 허용 라이브 대장균 세포에서 단백질-DNA 상호 작용의 직접 관찰 및 정량화.
Abstract
단백질-DNA 상호 작용은 많은 기본적인 세포 과정의 핵심이다. 예를 들어, DNA 복제, 전사, 보수, 및 염색체 조직 체외 실험은 DNA-결합 단백질의 여러 유형의 기능에 대한 상세한 모델을 생성하도록 도왔다. 특정 DNA 구조 나 서열을 인식하는 DNA-결합 단백질에 의해 규율, 아직 , 살아있는 세포의 복잡한 환경에서 이러한 프로세스와 조직의 정확한 메커니즘은 훨씬 덜 이해 남아있다. 우리는 최근에 Photoactivated 현지화 현미경 단일 분자 추적과 결합 (PALM)를 사용하여 라이브 대장균 세포에서 DNA 수리 활동을 정량화하는 방법을 소개했다. 우리의 일반적인 방법은 염색체와 연결시 하나의 단백질의 이동성의 변화에 의해 개인의 DNA 결합 이벤트를 식별합니다. 결합 된 분자의 일부는 단백질 행위에 대해 직접 정량적 측정을 제공합니다단일 세포 수준에서의 ivity 및 기판 또는 결합 부위의 풍요 로움. 여기서는 방법의 개념을 설명하고, 샘플 준비, 데이터 수집 및 데이터 분석 절차를 보여준다.
Introduction
이 프로토콜은 대장균 살아있는 세포에서 단백질-DNA 상호 작용의 직접적인 측정을 설명한다. 그것은 염색체 (도 1)로 결합 기술은 단일 형광 표지 된 단백질의 확산 계수의 변화를 이용한다. 우리는 DNA 중합 효소 지체 가닥 복제 및 절단 수리 경로 1의 DNA 갭을 채우는 I (POL1), 원형 DNA 결합 단백질을 사용하는 방법을 보여주기 위해.
슈퍼 해상도의 형광 현미경의 출현은 나노 미터 해상도의 세포에서 분자 구조의 시각화를 가능하게한다. Photoactivated 현지화 현미경 (PALM)는 형광 상태 (그림 2)에 초기 암 상태에서 활성화 할 수있는 형광 단백질을 사용합니다. 남은 모든 표지 분자의 서브 세트를 독립적으로 t, 순차적 인 방식으로 자신의 위치를 결정하기 위하여 임의의 시간에 활성화 될그는 샘플 2에 표시된 분자의 농도를 총. 분자 당 국산화 정도는 주로 형광 포인트 확산 함수 (PSF)의 크기에 따라, 수집 된 광자의 수 및 배경 신호 3. 이 방법의 대부분의 응용 프로그램은 세포 구조의 개선 된 시각화에 초점을 맞 춥니 다. 추적 PALM은 단일 분자와 결합 할 수있는 실현 4 직접 살아있는 세포의 표지 단백질의 임의의 숫자의 움직임에 따라 새로운 길을 열었습니다. 향상된 감도와 형광 현미경의 시간 해상도는 이제 세균 세포질 5에서 하나의 확산 형광 단백질의 추적을 할 수 있습니다.
여기, 우리는 PAmCherry, 비가 역적으로 405 nm의 빛 6 조사에 형광 상태로 초기 비 형광 상태에서 변환하는 설계 형광 단백질을 사용합니다. 활성화 PAmCherry의 형광 이미지 될 수 있습니다561 nm의 여기 및 photobleaching에까지 여러 프레임에 대해 추적에 의해 개발. 우리는 POL1 및 PAmCherry의 융합 단백질을 사용하여 단일의 과도 DNA-결합 이벤트를 식별하는 방법의 능력을 보여준다. 메틸 메탄 (MMS)와 세포 치료는베이스 절단 수리 효소에 의해 갭 DNA 기판으로 설정되어 DNA 메틸화 파손의 원인이됩니다. 우리의 방법은 MMS 손상 7에 대한 응답으로 단일 POL1 분자의 결합 분명히 보여줍니다.
Protocol
1. 세포 배양
무균 배양 튜브 및 피펫 팁을 사용합니다. E. 대장균 균주 AB1157 폴라 - PAmCherry는 POL1의 C-말단 PAmCherry 융합을 수행한다. 융합 등 Datsenko에서 설명한 람다 - 레드 재조합을 이용하여 야생형 유전자를 대체하여 네이티브 염색체 위치에 삽입 하였다. 세포 성장 속도와 DNA 손상 제 메틸에 대한 민감도에 의해 판단으로 융합 단백질의 팔 기능이 확인되었다 메탄 (MMS). 세포주의 구조에 대한 자세한 내용은 Uphoff 등. 7에서 찾을 수 있습니다, Datsenko 등. 8 및 레예스-Lamothe 외. 구 세포 배양은 형광도를 감소시키고 현미경 슬라이드에 배경 입자를 피하기 위해 M9 최소 배지에서 성장된다. 또한, 영양이 풍부한 정의 매체는 10을 사용할 수 있습니다.
- 행진 E. 대장균 균주 AB1157 선택적 항생제 (여기에서, 25 ㎍ / ㎖의 카나마이신)과 루리아 국물 (LB) 아가로 오스 접시에 냉동 글리세롤 재고 폴라 - PAmCherry와 하룻밤 37 ° C에서 알을 품다.
- 하나의 세포 식민지에서 5 ㎖ LB 문화를 접종하고 3 시간 동안 220 rpm으로 흔들어 37 ° C에서 성장한다.
- 5 ㎖의 문화 1:10,000 희석 최소 배지 (M9 배지, MEM의 아미노산 + 프롤린, MEM 비타민, 0.2 % 글리세롤), 37 ° C 하룻밤 220 rpm으로 흔들면서 품어.
- 다음날 아침, 분광 광도계를 사용하여 광학 밀도 (OD)를 측정하고 OD 0.025에 5 ㎖에 신선한 최소한의 매체 문화를 희석. 초기 지수 단계 (OD 0.1)에 220 rpm으로 흔들어 37 ° C에서 2 시간 동안 성장.
- 5 분 2,300 XG에서 원심 분리하여 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 세포를 1 ml의 농축. 상층 액을 제거하고 20 ㎕의 잔류 매체와 소용돌이에있는 세포 펠렛을 resuspend.
2. 현미경 슬라이드 프레파라트이온
- dH보다 2 O.에서 1.5 %의 낮은 형광 아가로 오스 솔루션을 준비합니다 솔루션이 선명해질 때까지 아가로 오스를 용융 전자 레인지를 사용합니다. 부드럽게 피펫 팅에 의해 몇 번 아래로 2 배 최소 배지 500 μL로 용융 아가로 오스 솔루션 500 μl를 섞는다.
- 현미경 커버 슬립 (없음 1.5 두께)의 중심에 균등하게 아가로 오스 솔루션을 확산. 이 아가 로스가 냉각되기 전에 기포를 피하는 빠르게 수행되어야한다.
- 두 번째 커버 슬립 (없음 1.5 두께)와 패드를 평평하게. 배경 형광 입자를 제거하기 위해, 커버 슬립은 이전에 1 시간 동안 500 ° C에서 가열로에서 연소되었다. 구운 커버 슬립은 알루미늄 호일에 덮여 실온에서 주 동안 저장 될 수있다.
- DNA 손상 실험을 위해, 100 mM의 MMS를 포함하는 아가로 오스 패드를 준비한다. 단계 2.1-2.3의 절차를 따라하지만, 100 ㎜ M의 최종 농도를 들어, 용융 1.5 % 아가로 오스의 500 μL와 혼합하기 전에 M9 배지 500 ㎕를 8.3 ㎕의 MMS를 추가MS. (주의 MMS는 독성과 돌연변이 유발과 장갑, 마스크, 고글, 실험실 코트로 처리해야합니다.)
- 패드에서 상단 슬라이드를 제거하고 패드에 집중 세포 현탁액 1 μl를 추가합니다. 사용하지 않는 불에 커버 슬립 (없음 1.5 두께, 현미경 목표 명세서와 일치)와 함께 패드를 덮어 슬라이드에 매우 부드럽게 눌러 세포를 고정시킨다. 세포는 아가로 오스 패드가 마르기 전에 고정 45 분 이내에 몇 군데해야합니다. 더 이상 실험 중 건조를 방지하기 위해, 아가로 오스 패드는 실리콘 가스켓을 사용하여 밀봉 할 수있다.
- DNA-손상 실험을 위해, 촬상 전에 실온에서 가습 된 용기에 20 분 동안 100 ㎜ MMS를 포함하는 아가로 오스 패드에 고정화 세포를 배양한다.
3. 현미경 데이터 수집 준비
PALM은 탐지 및 하나의 형광 단백질의 정확한 현지화에 의존합니다. 감도와 최적의 맞춤현미경은 데이터 품질에 중요하다. 단일 분자 형광 현미경은 전형적으로 커버 슬립의 표면 위의 얇은 섹션 내의 흥미로운만을 형광체에 의해 신호 대 잡음비를 향상시키기 위해 전체 내부 반사 (TIR) 조명을 사용한다. E. 내부 여기 영상 대장균은 매우 경미 여기 광의 각도를 감소시킴으로써 TIRF 현미경에 달성 될 수 경사 조명 (11)을 필요로한다. PAmCherry 영상이 추가로 405 nm의 photoactivation 레이저와 561 nm의 여기 레이저가 필요합니다. 형광 방출은 114.5 ㎚ / 화소의 화소 길이 초래 배율에서 CCD (EMCCD) 카메라를 승산 전자에 기록된다. 최적의 현지화 정밀도를 들어, 픽셀 크기가 약 너무 많은 화소에 신호를 확산하지 않고 충분한 샘플링을 보장하기 위해 PSF의 표준 편차의 폭과 일치해야합니다. 그림 3 최소한의 PALM 설정의 개략도를 보여줍니다. 영화 1맞춤 현미경 구축 과정의 인상을 준다;. 장비에 대한 자세한 설명은 Uphoff 등 7을 참조하십시오.
- 일상 현미경 정렬을 수행. 405 nm의 목적 앞에 561 nm의 연속파 레이저의 강도를 측정한다. 3.5 mW의 (~ 400 W / cm 2) 10 μW (~ 1 W / ㎠)에 405 nm의 강도에 561 nm의 강도를 조절합니다. 0 ~ 10 μW에서 405 nm의 강도의 점진적인 조정을 허용하는 연속 가변 감광 필터 휠을 사용합니다. 실험 시작 때까지 레이저 조명을 끕니다.
- 현미경 무대에 샘플을 놓고 투과광 현미경 모드 (그림 4A)에 초점 세포를 가져옵니다. EMCCD 카메라 이득은 노출 과다에 의해 카메라의 손상을 방지하기 위해 스위치 오프되어야한다.
- 데이터 크기를 줄이고 카메라 판독 속도를 증가시키기 자른 FOV를 정의.
- 주변 광 및 SWIT에서 샘플을 커버EMCCD 카메라 이득에 채널.
- (0.26 밀리 카메라 판독 시간 포함) 15.26 밀리 초 / 프레임으로 프레임 속도를 설정합니다. 토론 섹션에서 "노출 시간과 여기 강도"를 참조하십시오.
- 어두운 배경 신호 (그림 4B)을 확인하기 위해 카메라 데이터를 표시합니다.
- 561 nm의 레이저에 전환하고 여기 배경 신호 (그림 4C)을 확인.
- POL1-PAmCherry 융합 단백질의 photoactivation의 405 nm의 레이저에 스위치 및 형광 PSFS가 나타날 때까지 강도를 증가시킨다.
- 커버 슬립의 표면 부근에 시료만을 얇은 부분을 조명하기 위하여 여기 빔의 각도를 조정한다.
- 이를 위해, 레이저 빔은 100X NA 1.4의 대물 초점면 (도 3)에 집중된다. 빔에 수직 인 포커싱 렌즈를 변환하는 것은 멀리 아래 각도 대물를 종료 빔을 일으키는 목적의 중심으로부터의 포커스를 이동시킨다.
- 아이형광 강도를 최대화하고 백그라운드 신호를 최소화하기 m. 엄격한 TIR 여기가 커버 슬립 표면의 100 nm의 내 이미지 형광에 최적합니다, 그러나, 영상 DNA-결합 단백질은 E.와 관련된 대장균 핵 양체 0.8 μm의 깊이 조명까지 필요합니다.
4. 데이터 수집
여기에서, 우리는 PALM 영화의 취득 일반 프로토콜을 설명합니다. 동일한 절차에 피해 E. POL1-PAmCherry 융합 단백질을 영상화 적용 대장균 세포와 MMS 연속 DNA 손상 치료 중. 셀 당 다른 분자량 또는 복사 수의 융합 단백질에 대한 방법의 응용 프로그램 (토론 섹션을 참조) 다른 인수 설정이 필요합니다.
- 투과광 현미경 모드에서 세포의보기의 새로운 필드 (FOV)를 찾아 이미지의 초점을 맞 춥니 다. 셀 외곽선 (그림 4A)를 기록하는 카메라 스냅 샷을 가져 가라.
- 주변 광에서 샘플을 커버하고 EMCCD 카메라 이득에 전환합니다.
- 561 nm의 레이저에 스위치 및 데이터 수집을 시작하기 전에 몇 초 동안의 coverslip에 대한 세포 형광도 및 배경 반점을 표백. 세포에 대한 성장과 M9 매체에 몇 군데 아주 작은 형광 배경이 보통이 커버 슬립을 불에 사용하지만, prebleaching하는 등 LB 등 풍부한 성장 매체에있는 세포 이미징을위한 도움이 될 수 있습니다. 강렬한 조명이 너무 prebleaching는 최소한으로 유지해야 세포에 독성이 있습니다.
- 15.26 밀리 초 / 프레임에서 연속 561 nm의 여기에서 PALM 영화의 인수를 시작합니다.
- 405 nm의 레이저를 켜고 서서히 / ㎠ 1 W까지 도달하는 영화의 과정을 통해 강도를 증가시킨다. 세포의 형광도의 원인이 높은 405 nm의 강도를하지 마십시오. 형광 분자의 밀도에주의 - 그것은 낮은 작동 속도를 유지하는 것이 중요합니다 PSFS 분명히이되도록각 프레임 (그림 4D-F)에 격리입니다.
- 10,000 프레임 / 동영상 (셀당 묘화되는 분자의 수에 따라)를 기록; 한 영화는 대개 2-3 분 걸리며 FOV의 크기에 따라서 하드 디스크 공간이 0.5 GB를 필요로한다.
- 여러 FOV의 취득 절차를 반복합니다. 각 FOV가 PAmCherry의 형광이 photoactivated 얻을 수 있기 때문에 한 번 몇 군데와 비가 역적으로 표백 할 수 있습니다.
5. 데이터 분석
자동화 및 강력한 데이터 분석 프레임 워크는 방법의 성능과 효율성을 위해 필수적입니다. 우리는 MATLAB로 작성된 사용자 지정 소프트웨어를 사용합니다.
- 크로커 외. 12에 기재된 알고리즘을 이용하여 지역화 분석을 수행 홀든 외. 13 HoldenI 외. 14 및 Wieser의 외. 15 PSFS는 제 7 화소로 가우시안 커널을 사용하여 대역 통과 필터링 된 이미지에서 식별된다의 직경 (그림 5A). 후보 위치는 백그라운드 신호 (도 5b)의 4.5 배의 표준 편차를 상기 피크 픽셀 강도로 PSFS에 대응한다. 후보 PSF 당 로컬 밝은 픽셀은 타원형 가우스 함수 (그림 5C)를 피팅에 대한 초기 추측 역할을합니다. 무료 맞는 매개 변수는 다음과 같습니다 : X 위치, Y 위치, X 폭, Y, 폭, 회전 각도, 진폭 및 배경 오프셋 (offset). 타원형 가우시안 마스크는 PSF를 흐리게하고 변형 노출 시간 동안 분자를 차지한다.
- 같은 FOV의 투과광 현미경 이미지 상에 PALM 영화의 모든 프레임에서 결과 (X, Y) 버전을 그린다. POL1-PAmCherry의 지역화는 E.의 중심 영역에 나타납니다 대장균 세포 (그림 6A). 많은 현지화 세포의 바깥에 표시하는 경우, 현지화 임계 값을 너무 낮게 설정하거나 샘플 배경 형광 입자를 포함했다.
- 자동화 추적 분석을 위해, 외 보군에서 설명한 알고리즘의 MATLAB 구현 AL. 12 (토론 섹션의 "확산 분석"참조)이 사용될 수있다. 사용자 정의 된 추적 창 내에서 후속 프레임으로 나타나는 위치가 궤적을 형성하기 위해 연결된다. 체류 현지화 동일 창에서 발생하는 경우에, 트랙은 고유 스텝 길이의 합을 최소화하여 할당된다. 단일 입자 추적 데이터로부터 확산 계수를 계산할 때 다양한 고려 사항에 대한 상세한 설명은, Wieser의 외. 15 참조
- 이 알고리즘은 추적 기간 동안 과도 점멸 또는 누락 현지화을 고려하여 메모리 매개 변수를 사용합니다. 여기, 우리는 1 프레임 메모리 매개 변수를 설정, 높은 값은 수명이 긴 어두운 상태로 형광을 추적하는 데 사용할 수 있습니다.
- 다음 교정 단계에 따라 적절한 추적 창을 선택합니다. POL1 위해, 우리는 0.57 μm의 (5 픽셀)를 사용합니다.
- 윈도우 파라미터를 추적의 범위에 대한 추적 알고리즘을 실행. 트랙 (도 6b)을 분할하지 않는 작은 가능한 추적 창을 식별하는 추적 창 함수로서 셀 당 측정 된 트랙의 개수를 계산한다.
- 세포 내 분자 운동의 공간적 분포를 시각화 동일한 FOV의 투과광 현미경 이미지에서 얻어진 트랙 플롯. POL1 트랙은 하나의 세포 (그림 6C-D)에 의해 누출 확산을 표시해야합니다.
- 트랙의 일부가 세포 사이에 십자가에 나타나는 경우이 추적 창이 너무 큰 및 / 또는 photoactivation 속도는 (그림 6E)도 높았다 선택했기 때문에 별도의 분자가 잘못 연결되었습니다 것을 제안합니다.
- 연속 현지화 (도 6F) 사이의 단계 길이의 누적 분포를 플롯. 곡선은 상승하고 충분히 큰 추적 창 원활 포화창을 너무 작게 선정 된 경우 만 차단 가장자리를 보여줍니다.
- POL1의 확산 특성을 분석하기 위해, N 단계의 합계와 각 트랙 연속 현지화 간의 평균 제곱 변위 (MSD))를 계산한다 :
MSD = 1 / (N-1) Σ I = 1 N-1 (x +1 - X I) 2 + (Y +1 - y를 I) 2.
만 MSD 값의 통계적 불확실성을 줄이기 위해 최소 4 단계 (N ≥ 5 현지화)과 추적 (가) 있습니다. - 여러 프레임 (그림 6G)에 변위를 계산하여 지연 시간의 범위에서 MSD 값의 곡선을 그린다. MSD 곡선의 형태는 관찰 된 분자 운동 (그림 6H)을 분류하는 데 도움이 될 수 있습니다.
- MSD에서 트랙 당 겉보기 확산 계수 D의 *를 계산
D * = MSD / (4의 Δt) - LOC 2 /의 Δt σ.
두 번째 tERM은 (Wieser의 등. 15 참조, 여기 σ의 LOC = 40 nm의의 Δt = 15.26 밀리 초)을 추정 현지화 에러를 수정합니다. - FOV (그림 7A)에있는 모든 트랙에서 측정 된 D의 * 값의 히스토그램을 그린다.
- 트랙 당 측정 D * 값을 기반으로 염색체에 결합 나타나는 개별적인 POL1 분자를 식별한다. 바인딩의 인구 분리 (중심 날카로운 분포를 D * 0 ~ 2 ㎛ / 초)와 D * <0.15 μm의 2 / 초 임계 값을 설정하여 자유롭게 확산 분자 (넓은 분포가 D를 중심으로 * ~ 0.9 μm의 2 / 초) ( 도 7a 및 7D)의 빨간색 막대.
- 손상되지 않은 세포 (도 7a-C) 및 MMS (그림 7D-E)와 DNA-손상의 치료에서 세포의 현지화, 추적 및 POL1에 대한 확산 분석을 수행. 바운드 트랙의 비율은 DN의 직접적인 양적 측정을 제공합니다생체 내에서 POL1의 복구 활동.
Representative Results
생체 내에서 단백질-DNA 상호 작용을 연구하기 위하여 추적 photoactivated 단일 분자의 개념은도 1에 도시되어있다. PAmCherry 융합 단백질은 살아있는 E.에서 감지 시 셀당 미만 분자의 주파수에서 405 nm의 광으로 확률 적으로 단일 분자 photoactivating 의해 순차적으로 대장균 세포. 활성화 된 분자가 연속 561 nm의 여기에서 몇 군데 있습니다. 세포의 분자 운동은 돌이킬 수없는 광표백 때까지 일련의 프레임에 가까운 현지화를 연결하여 추적 할 수 있습니다. DNA-결합 단백질의 확산이 염색체를 바인딩시 감속되어 있으므로, D * 트랙 당 수득 명백한 확산 계수를 직접 개별 단백질-DNA 상호 작용에보고한다.
그림 2는 라이브 E.에 POL1-PAmCherry 융합 단백질의 photoactivation을 보여줍니다 대장균 세포. O 405 nm의 강도의 영향N 형광 분자의 농도는도 4에서 볼 수있다. 밀도가 단독으로 405 nm의 강도에 의해서가 아니라 추가로 정품 인증에 사용할 수있는 분자의 수에 의해 결정되지 않습니다, 나머지 분자의 풀은 PALM 영화의 과정을 통해 고갈된다.
지역화 분석은도 5에 도시 된 바와 같이 PALM 동영상의 각 프레임에 대해 수행된다. 우리는 살아있는 세포에서 수정 된 세포 또는 결합 분자의 움직 분자를 사용하여 현지화 정도를 측정 하였다. 우리의 인수 설정은 이론적 인 예측 3 계약, σ의 LOC = 40 nm의 현지화 정밀도를했다.
얻어진 POL1 현지화 광범위 E.의 공간적 조직 recapitulating, 셀의 중앙 영역 (도 6a)을 점유 대장균은 7 핵 양체. POL1의 대다수는 DIF 디스플레이가 손상되지 않은 세포에서 트랙도 6c에 도시 된 바와 같이 융합. 일반적인 세포는 E. 당 약 400 POL1 분자의 카피 수와 일치 수백 POL1 트랙 (그림 6D)를 포함 . 대장균 전지 (1)는도 6b 및도 6E-F는 적합한 추적 윈도우 파라미터 선택에 대한 지침을 제공한다 - 트래킹 윈도우가 너무 크면, 다른 분자가 잘못 트랙에 링크 될 가능성이 있으며 트래킹 윈도우가 너무 작은 경우, 트랙 더 이상 단계를 분할됩니다. POL1에 대한 MSD 곡선은 셀 감금 (그림 6 세대)로 인해 더 이상 지연 시간에 짧은 지연 시간과 포화에 선형 적으로 상승한다. 분자 운동의 종류 MSD 분석에 의해 식별 될 수있다. 감독 운동은 포물선을 제공, 브라운 운동은 직선 특징, 제한 확산 곡선은 고원에 도달, 움직 입자 MSD 곡선의 오프셋 (offset)는 L를 나타냅니다ocalization 불확실성 (그림 6H). 단일 입자 추적 및 문제 해결 팁에 대한 자세한 정보는 Arnauld 등. 16에서 찾을 수 있습니다
우리는 이전에 외인성 DNA 알킬화 손상 7에 응답 POL1의 DNA 수리 활동을 측정하는 방법을 적용했다. POL1의 D * 히스토그램 분자 (도 7a-C)을 확산의 지배적 인 인구를 보여줍니다 손상되지 않은 세포에서 추적합니다. 2.7 % 바운드 POL1 분자의 작은 부분은 가능성이 지체 가닥 복제 및 내인성 DNA 손상의 복구에 참여하고있다. 연속 100 ㎜ MMS 손상에서, 13.8 % (그림 7D)에 D * 0 ~ 2 ㎛ / 초 증가와 트랙의 인구. 이러한 트랙은 염기 절제 복구 통로의 일부로서 단일 뉴클레오티드 차이를 보충하는 DNA 수리 및 합성을 수행 개별 POL1 분자를 나타낸다. 바운드 트랙의 위치는 개개의 위치를 표시DNA 손상과 복구 사이트 (그림 7E-F).
그림 1. 방법의 그래픽 표현. (A)의 형광 단백질 PAmCherry는 405 nm의 광 조사에 의해 초기 상태로부터 비 형광 photoactivated 수있다. 밝은 상태는 561 nm에서 흥분과 비가 역적으로 형광 표백제까지 600 nm의 주위에 형광을 방출한다. (B) photoactivation 속도를 제어하는 것은 허용 영상 만 언제든지 셀 당 하나의 확률 적으로 활성화 PAmCherry 융합 단백질 어두운 상태로 남아 아직 활성화되지 않았거나 이미 표백 된 분자의 임의의 큰 수영장이있다. (C) 형광성 분자의 위치는 절연 PSF과 TR의 중심으로부터 판단photobleaching에까지 몇 프레임에 acked. 많은 분자의 (D)는 트랙 순차적으로 기록된다. (EF)은 염색체 표적 서열 또는 구조를 DNA-결합 단백질의 상호 작용은 랜덤 확산 움직임을 정지. 바운드 및 언 바운드 분자는 D * 하나의 트랙에서 추출 겉보기 확산 계수에 의해 구별된다. 결합 된 분자의 결과로 일부는 생체 내에서 DNA-결합 단백질의 활동에 대한 정량적 인 측정을 제공합니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 라이브 E.의 POL1-PAmCherry의 Photoactivation 대장균 세포. 스케일 바 : 1 μm의. 회로도는 각 패널 아래에 표시됩니다. ( A) 아가로 오스 패드에 고정 된 세포의 광학 현미경 이미지를 전송된다. (B) 하나의 셀에 하나의 PAmCherry의 형광을 Phototactivating. (C) 높은 photoactivation 속도는 형광 분자의 수를 증가시킨다. (D) PALM 영화에서 통합 PAmCherry 형광. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. photoactivating 및 이미징 PAmCherry 융합 단백질에 대한 최소한의 PALM 설정의 도식 D1 :. 다이크로 익 미러 (예를 들어 550 nm의 긴 패스). D2 : 다이크로 익 미러 (예를 들어 570 nm의 긴 패스). L1 : 시준 렌즈. L2 : TIR 렌즈. L3 : 튜브 렌즈.1177/51177fig3highres.jpg "대상 ="_blank "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. . 15.26 밀리 초 / 프레임 스케일 바있는 PALM 영화 대표 이미지 : 1 μm의. (A) 아가로 오스 패드에 고정 된 세포의 가벼운 이미지를 전송된다. (B) 레이저와 EMCCD 카메라에서 측정 어두운 배경 이미지가 꺼져. photoactivation 전에 연속 561 nm의 여기에서 (C) 흥분 배경 이미지입니다. (DF) 증가 405 nm의 강도는 지속적으로 561 nm의 여기에서 몇 군데 PAmCherry 높은 photoactivation 환율로 연결됩니다. 박스 영역은 다음과 확대 표시됩니다. (D) 낮은 405 nm의 강도 (<1 μW) 활성 FOV 당 거의 형광 분자를. (E) 중간 (405)현지화 및 추적 분석을위한 좋은 PSF 밀도 nm의 강도 (~ 2 μW) photoactivation 결과. (F) 높은 405 nm의 강도 (~ 10 μW)는 현지화 및 추적 분석을 가린다 일부 셀에 하나 이상의 형광 분자를 활성화합니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 지역화 분석의 그림입니다. 스케일 바 : 1 μm의 (A) 밴드 패스 필터링이 가짜 픽셀 노이즈를 제거하고 FOV에 걸쳐 강도 그라데이션을 평면화합니다.. (B) 후보 PSFS는 위양성 및 위음성 탐지를 최소화하도록 선택된다 사용자 정의 임계 값에 기초하여 상기 필터링 된 이미지에서 식별된다. threshoLD는 배경 표준 편차 (신호 대 잡음비, SNR)에 의해 분할 후보 화소의 최소 강도에 대응한다. (C)가 임계치 이차원 타원형 가우시안 적합을 위해 초기 위치 파악 추측 (오렌지 크로스) 역할을 전달 로컬 밝은 화소. 스케일 바 : 0.5 μm의. 그 결과 최고 해상도의 현지화 (블루 크로스) σ의 LOC의 평균 밀도가 = 40 nm의은. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
.. 추적 분석 그림 6 그림 스케일 바 : 1 μm의. (A) 예를 들어 셀에 POL1-PAmCherry의 모든 감지 현지화. (B) 트랙 번호 감지트래킹 윈도우의 함수로서 예시적인 셀 ED. 작은 추적 창은 트랙의 높은 숫자를 인공적에 이르게 분자 궤도를 분할. 점선은 추적 창 매개 변수 (0.57 μM, 5 픽셀)에 대한 우리의 선택을 나타냅니다 -이 단계의 전체 분포를 감지하고 그대로 다른 분자의 궤적을 유지하는 사이 좋은 타협을 제공합니다. 단일 POL1-PAmCherry 분자의 (C) 예 트랙. (D) 임의의 색상으로 표시된 모든 측정 트랙. 추적 창을 선택하면 (E) 추적 아티팩트 (여기서는 0.8 μM, 12 픽셀) 또는 프레임 당 PSFS의 밀도가 너무 높은 너무 크다. 추적 창에 대한 단계의 길이 (F) 누적 분포 : 0.34 μM (3 픽셀, 빨간 선), 0.57 μM (5 픽셀, 파란 선), 0.80 μm의 (7 픽셀, 녹색 선). 0.34 μm의 추적 창을 0.34 μm의 이상 단계를 차단합니다 어느 명확하게단계의 전체 분포를 자릅니다. 0.80 μm의 추적 창처럼 0.57 μm의 추적 창 단계의 거의 같은 분포를 감지합니다. (G) MSD 곡선은 POL1의 제한 확산을 보여줍니다. 감독 운동, 브라운 운동, 제한된 확산 및 부동 입자 (H) 도식 MSD 곡선. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7. 라이브 E.에 POL1의 DNA 수리 활동의 직접 측정 . 대장균 세포 스케일 바 : 1 μm의. (A) 손상되지 않은 세포의 FOV (N = 4,162 트랙)의 4 이상의 단계의 모든 트랙에 대한 명백한 확산 계수 D의 *의 히스토그램. B로 분류 분자의 인구 ound 빨간색으로 강조 표시됩니다. POL1-PAmCherry의 (BC) 트랙은 투과광 현미경 이미지에 표시됩니다. 자신의 확산 계수에 따라 결합으로 분류 된 트랙이 빨간색으로 표시됩니다. (D) * D (N = 2,128 트랙)을 묘화 전에 100 ㎜ MMS로 아가로 오스 패드에 고정하고 20 분 동안 배양 한 세포에서 측정 POL1 트랙위한 히스토그램. DNA 수리에 종사하는 결합 분자의 인구는 빨간색으로 표시됩니다. (EF) POL1-PAmCherry 빨간색 단일 POL1의 DNA 수리 이벤트의 흔적을 보여주는 투과광 현미경 이미지를 추적합니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 1. 맞춤 PALM 설정을 구축.JoVE_Uphoff_Movie1.avi "대상 ="_blank "> 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
우리는 실험의 성공을 위해 몇 가지 주요 고려 사항에 대해 설명합니다.
어워드 및 형광 융합 단백질의 발현 : 광활성 및 광전 환성 형광 단백질 (17)의 큰 팔레트가있다. 특정 선택은 현미경의 특성, 사용 가능한 특히 레이저와 필터에 따라 달라집니다. 405 ㎚, 561 ㎚의 조합은 일반적인 광활성 형광 단백질에 이상적입니다. 우리는 단량체 때문에 PAmCherry 6을 선택하고 셀의 집계를 보여 주었다. 또한, 비가역 photoactivation는 셀 당 단백질의 카피 수를 측정 할 수있는 활성화 된 형광체의 수를 카운트한다. 대신 플라스미드에서 융합 단백질을 발현 제외한 야생형 유전자좌 융합 단백질을 코딩하는 유전자의 염색체 삽입을 선호한다. 이 형광을했습니다와 관심의 단백질의 완전한 교체를 보장합니다rsion 및 야생형 발현 수준을 유지.
Photoactivation 레이트 : 이것은 평균적으로 셀 당보다 작은 분자는 동영상의 모든 프레임에서 형광 상태로되도록 photoactivation 속도를 조절하는 것이 중요하다. 이것은 405 nm의 강도에 의존하고 분자수가 활성화하는 왼쪽. 매우 낮은 영상 밀도에서, 그러나, 모든 분자는 영화가 끝나기 전에 이미지를 만들거나 매우 긴 영화를 취득해야합니다. 영화 당 기록 된 프레임의 수는 융합 세포 당 단백질과 사용 여기 조건에서 PAmCherry의 평균 photobleaching에 일생 일대의 카피 수에 따라 달라집니다. POL1의 카피 수는 ~ 400 분자 / 셀 1과 지수 광표백 수명 분포의 평균값은 1 ~ 4의 범위였다. 점차적으로 405 nm의 강도를 증가시킴으로써, 활성화 균등 영화의 10,000 프레임을 통해 배포됩니다. 따라서 각 셀은 occup이다PSFS 10,000 프레임의 동영상에서 추적 합병증이 거의 중복을 보장합니다 ~ 1,600 프레임의 총에 형광 분자에 의해 IED.
노출 시간과 여기 강도는 : 제일 중요 한건, 노출 시간은 약간의 모션 블러와 함께 날카로운 PSFS을 관찰하기에 충분히 짧게 할 필요가있다. 그러나, 프레임 레이트가 지역화 불확도 넘어 연속 프레임 간의 관찰 분자 운동을 수득하도록 선택되어야하고, 그렇지 않으면 결정적인 광자 트랙 오버 샘플링에 의해 낭비된다. 언 바운드 분자의 운동은 현지화 불확실성으로 인해 결합 분자의 겉보기 운동에서 명확히 구별로 충분히 긴 시간 간격으로 샘플링해야합니다. 노출 시간이 설정되면, PSF 강도가 조정되어야한다. PSF의 국산화 정도는 프레임의 지속 기간 동안 검출 된 광자의 수에 따라 증가한다. 고등 여진 강도는 광자 방출 속도를 증가 BU또한 t 광표백 레이트 및 백그라운드 신호. 원하는 현지화 정밀도를 제공하는 가장 자극 강도를 사용합니다. POL1-PAmCherry 위해 우리는 15.26 밀리 초 / 프레임과 3.5 mW의 561 nm의 여기 (400 W / cm 2)를 선택했다. 그것은 (Uphoff 외. 7에서 부가 정보를 참조) 데이터 수집 전후 세포 성장 및 형태를 모니터링하여 특정 촬상 조건 세포 생존을 확인하는 것이 중요하다.
POL1 생체 7 갭 DNA 기판에 1 ~ 2 초 바인딩 시간을 나타내고, 따라서 우리는 분자의 대부분은 트랙의 전체 기간 동안 바운드 또는 언 바운드 상태가 될 것으로 예상된다. 염색체 사이트는 세포질에있는 POL1 확산 (1 ~ 2 ㎛보다 확산 계수에게 크기 이하의 몇 배 (~ 10 -5 ~ 2 ㎛ / 초, 엘모어 등. 18)이 있기 때문에 바인딩 분자는 기본적으로 고정되어 나타납니다
확산 분석 : 명백한 확산 계수 D의 *는 개별 트랙의 MSD로부터 계산되어, 통계적 에러를 줄이기 위해 4 단계 (5 프레임)의 최소 이상의 평균. 그 ~ 분자의 75 %가 설명하는 영상 조건보다 5 프레임 내에서 표백합니다. 이러한 짧은 트랙은 바운드 및 언 바운드 분자를 구별 할 수있는 충분한 통계적 확실성을 제공하지 않습니다. 그러나, 단백질의 활성을보고 바운드 및 언 바운드 분자의 상대적인 분획 분석 트랙들의 총 수와 무관하다.
불확실성이 분자 (15)의 각 현지화 명백한 임의의 단계를 추가하기 때문에 그것은 D의 *의 계산에서 PSF 현지화 오류 (σ의 LOC)을 설명하는 데 유용합니다.
바인딩 및 확산 분자의 분류를 개선하기 위해, 우리는 D의 * 봇을 계산하는 것이 좋습니다두 프레임의 시간 동안 단일 단계 변위 및 변위로부터 H. 그것은 두 개의 D * 임계 값을 설정하는 것이 가능합니다 : D의 * (15 밀리 초) <0.15 μm의 2 / 초와 D의 * (30 밀리 초) <0.075 μm의 2 / 초.
D의 *가 노출 시간 동안 인해 확산에 치우침 트랙과 운동의 휴대 제한에 의해 영향을받는 겉보기 확산 계수합니다. 정확한 공정한 확산 계수를 추출하기 위해서는, 스토캐스틱 브라운 운동 모델 5,7에 근거 시뮬레이션 데이터에 관찰 동작과 비교하는 것이 유용 입증되었다. 시뮬레이션 된 데이터는 데이터 분석 절차를 테스트하는데 사용될 수있다.
이 방법의 응용 가능성 : 우리는 염색체에 결합시 단백질의 이동성의 변화에 의해 생체 내에서 단백질-DNA 상호 작용을 시각화하고 정량화하기위한 일반적인 방법을 설명했다. DNA 또는의 활동수리에 관련된 RNA 결합 단백질은, 복제, 전사, 염색체의 유지 보수, 따라서 광학 회절 한계 이하의 공간 해상도를 가진 단일 세포 수준에서 실시간으로 따라 할 수 있습니다. Photoactivated 단일 분자 추적 셀 당 몇 표지 분자로 제한하는 종래의 추적 방법을 확장합니다. 생체 분자의 확산을 측정하는 다른 방법은 (FRAP)를 광표백 후 형광 복구합니다. FRAP 큰 세포에서 해외 확산 특성을 측정하는데 매우 유용하지만, 특히 작은 박테리아 세포에 대해, 공간적으로 서로 다른 환경에서 서로 다른 이동성을 가진 여러 분자 종을 해결하는 능력이 제한된다.
우리는 DNA 결합 활동과 E. 다른 단백질의 범위의 세포 내 현지화를 측정하기 위해 추적 photoactivated 단일 분자를 적용한 콜라이 POL1, DNA 리가 아제, FIS 단백질, DNA 등중합 효소 III 7뿐만 아니라 염색체 단백질 MukB, E, 및 F (19)의 구조 유지. 우리는 방법은 또한 다른 세포 유형에 적용 할 수 예상된다.
Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해가없는 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 지역화 소프트웨어에 대한 맞춤 현미경과 시머 홀든의 건설에 대한 도움말 저스틴 Pinkney 요하네스 홀바인을 인정합니다. 로드리고 레예스 - Lamothe는 E.를 제공하기위한 감사합니다 대장균 균주. 연구는 유럽위원회 (European Commission) 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 그랜트 FP7/2007-2013의 건강 F4-2008-201418, 영국 생물 공학 및 생물 과학 연구 협의회 부여 BB/H01795X/1 및 ANK에 유럽 연구위원회 그랜트 261227에 의해 투자되었다. DJS는 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 프로그램 그랜트 WT083469에 의해 투자되었다. SU는 매스 웍스의 박사 친교에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a PAmCherry DNA-binding fusion protein | created by Lambda-Red recombination | ||
| MEM amino acids | Invitrogen | 11130-051 | minimal medium supplement |
| MEM vitamins | Invitrogen | 11120-052 | minimal medium supplement |
| Agarose | BioRad | 161-3100 | certified molecular biology grade |
| Microscope coverslips No 1.5 thickness | Menzel | BB024060SC | remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1 hr |
| Methyl methanesulfonate (MMS) | Sigma-Aldrich | 129925 | CAUTION: toxic |
| PALM setup | home-built | described in Uphoff et al.7 | |
| MATLAB | MathWorks | for data analysis and visualization | |
| Localization software | custom-written, available online | http://www.physics.ox.ac.uk/Users/kapanidis/Group/Main.Software.html | MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. Cite Holden et al.13 if used in publication. |
| Tracking software | available online | http://physics.georgetown.edu/matlab/ | MATLAB implementation by Blair and Dufresne. Cite Crocker & Grier12 if used in publication. |
References
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