Visualisierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in der lebenden Bakterienzellen Verwendung Photoactivated Einzelmolekül-Tracking

Summary

Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM), kombiniert mit Einzelmolekül-Tracking ermöglicht die direkte Beobachtung und Quantifizierung von DNA-Protein-Interaktionen in lebenden Escherichia coli-Zellen.

Abstract

Protein-DNA-Wechselwirkungen sind im Herzen der vielen grundlegenden zellulären Prozesse. Zum Beispiel werden DNA-Replikation, Transkription, Reparatur und Chromosomenorganisation von DNA-bindenden Proteinen, die spezifische DNA-Sequenzen erkennen, Strukturen oder geregelt. In-vitro-Experimente haben dazu beigetragen, detaillierte Modelle für die Funktion von vielen Arten von DNA-bindenden Proteinen zu erzeugen, dennoch Die genauen Mechanismen dieser Prozesse und deren Organisation in der komplexen Umgebung der lebenden Zelle noch weit weniger verstanden. Wir vor kurzem eine Methode zur Quantifizierung von DNA-Reparaturaktivitäten im Live Escherichia coli Zellen unter Verwendung von Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM), kombiniert mit Einzelmolekül-Tracking-Systems. Unsere allgemeine Ansatz identifiziert einzelnen DNA-Bindungsereignisse durch die Änderung der Mobilität eines einzelnen Proteins bei der Assoziation mit dem Chromosom. Der Anteil an gebundenen Molekülen eine direkte quantitative Maß für das Protein Aktduktivität und Fülle von Substraten oder Bindungsstellen auf der Ebene einzelner Zellen. Hier beschreiben wir das Konzept des Verfahrens und zeigen die Probenvorbereitung, Datenerfassungs-und Datenanalyseverfahren.

Introduction

Dieses Protokoll beschreibt die direkte Messung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in lebenden Escherichia-coli-Zellen. Die Technik nutzt die Änderung der Diffusionskoeffizient einer einzigen fluoreszenzmarkierten Proteins, wie es das Chromosom (Fig. 1) bindet. Um die Methode, die wir verwenden, DNA-Polymerase I (Pol1), eine prototypische DNA-bindendes Protein, das DNA-Lücken in rückständigen Strang Replikation und Exzision Reparaturwege ¹ füllt demonstrieren.

Das Aufkommen der Super-Resolution-Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die Visualisierung molekularer Strukturen in Zellen mit Nanometer-Auflösung. Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) beschäftigt fluoreszierende Proteine, die von einem Anfangszustand in einen dunklen fluoreszierenden Zustand (Abbildung 2) aktiviert werden kann. Nur eine Teilmenge aller markierten Molekülen ist zu jeder Zeit aktiviert werden, um ihre Positionen in einer sequentiellen Art und Weise unabhängig von t zu bestimmen,er Gesamtkonzentration der markierten Moleküle in der Probe ^2. Die Lokalisierungsgenauigkeit pro Molekül hängt hauptsächlich von der Größe des fluoreszierenden Point Spread Function (PSF), die Anzahl der gesammelten Photonen, und das Hintergrundsignal ^3. Viele Anwendungen dieser Verfahren konzentrieren sich auf die verbesserte Visualisierung von Zellstrukturen. Die Erkenntnis, dass PALM mit Einzelmolekül-Tracking kombiniert werden ⁴ neue Wege eröffnet, um die Bewegung der eine beliebige Anzahl von markierten Proteinen in lebenden Zellen direkt zu folgen. Erhöhte Empfindlichkeit und zeitliche Auflösung der Fluoreszenz-Mikroskope erlauben nun Verfolgung der einzelnen Streu fluoreszierende Proteine ​​im bakteriellen Zytoplasma ^5.

Hier beschäftigen wir PAmCherry, eine gentechnisch fluoreszierenden Protein, das irreversibel wandelt von einem Anfangs nicht-fluoreszierenden Zustand in einen fluoreszierenden Zustand bei Bestrahlung mit 405-nm-Licht ^6. Aktiviert PAmCherry Fluorophore Bild seind durch Anregung bei 561 nm und für mehrere Frames verfolgt, bis Bleichen. Wir zeigen die Fähigkeit des Verfahrens, um transiente DNA-Bindungsereignisse einzelner Proteine ​​zu identifizieren mit einer Fusion von Pol1 und PAmCherry. Behandlung der Zellen mit Methylmethansulfonat (MMS) verursacht Schäden, DNA-Methylierung in DNA-Substrate gapped durch Basen Exzisions-Reparatur-Enzyme aktiviert wird. Unsere Methode zeigt deutliche Bindung von Einzel Pol1 Moleküle in Reaktion auf MMS Schaden ^7.

Protocol

1. Zellkultur

Verwenden Sie sterile Kulturgefäße und Pipettenspitzen. Die E. coli-Stamms AB1157 polA-PAmCherry trägt eine C-terminale Fusion PAmCherry Pol1. Die Fusion wurde in der nativen chromosomale Lage durch den Austausch des Wildtyp-Gen mit Lambda-Red-Rekombination wie in Datsenko et al eingefügt. ⁸ Funktionalität des Fusionsproteins wurde bestätigt, wie durch zelluläre Wachstumsraten und Sensibilität für die DNA-schädigenden Mittel Methyl beurteilt Methansulfonat (MMS). Mehr Informationen über Bau der Zellstamm in Uphoff et al. ⁷ zu finden, Datsenko et al. ⁸ und Reyes-Lamothe et al. ⁹ Zellkulturen werden in M9-Minimalmedium gezüchtet, um Autofluoreszenz zu verringern und zu vermeiden Hintergrund Partikel auf dem Objektträger. Alternativ kann eine nährstoffreiche definierten Medium ¹⁰ verwendet werden.

1. Streak die E. coli-Stamm AB1157 polA-PAmCherry aus einem gefrorenen Glycerin Lager auf einem Luria Broth (LB) Agarose-Platte mit selektiven Antibiotika (hier 25 ug / ml Kanamycin) und bei 37 ° C über Nacht.
2. Impfen eine 5 ml LB-Kultur aus einer einzigen Zellkolonie und wachsen bei 37 ° C bei 220 rpm für 3 h Schütteln.
3. Verdünnte die Kultur 1:10.000 in 5 ml Minimalmedium (M9-Medium, MEM + Aminosäuren Prolin, MEM-Vitamine, 0,2% Glycerin) und bei 37 ° C unter Schütteln bei 220 UpM über Nacht.
4. Am folgenden Morgen, messen Sie die optische Dichte (OD) mit einem Spektralphotometer und verdünnte die Kultur in 5 ml frischem Minimalmedium OD 0,025. Wachsen für 2 Stunden bei 37 ° C unter Schütteln bei 220 rpm bis frühen exponentiellen Phase (OD 0,1).
5. Konzentrat 1 ml der Zellen in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen durch Zentrifugation bei 2.300 × g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet in 20 ul restliches Medium und Wirbel.

2. Objektträger PreparatIon

1. Bereiten Sie eine 1,5%-Nieder Fluoreszenz Agarose-Lösung in dH ₂ O. Verwenden Sie eine Mikrowelle, um die Agarose zu schmelzen, bis die Lösung klar ist. Mischungs 500 ul der geschmolzenen Agarose-Lösung mit 500 ul 2x Minimalmedium durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren ein paar Mal.
2. Verbreiten Sie die Agarose-Lösung gleichmäßig auf die Mitte eines Mikroskopdeckglas (Nein 1.5 Dicke). Das muss schnell geschehen, bevor die Agarose kühlt, Vermeidung von Blasen.
3. Glätten Sie das Pad mit einem zweiten Deckglas (Nein 1.5 Dicke). Um die Hintergrund-Fluoreszenz-Partikel zu entfernen, Deckgläser wurden in einem Ofen bei 500 ° C für 1 Stunde gebrannt. Verbrannt Deck kann Wochen bei Raumtemperatur in Aluminiumfolie abgedeckt gelagert werden.
4. Für die DNA-Schäden Experimente, bereiten eine Agarose-Pad, die 100 mM MMS. Die nächsten Schritte in den Schritten 2.1-2.3, sondern fügen 8,3 ul MMS 500 &mgr; l M9-Medium vor dem Mischen mit 500 ul 1,5% geschmolzener Agarose, für eine Endkonzentration von 100 mM MMS. (Achtung! MMS ist giftig und erbgutverändernde und muss mit Handschuhen, Maske, Schutzbrille und Labormantel behandelt werden).
5. Entfernen Sie die obere Folie aus dem Pad und fügen 1 ul konzentrierte Zellsuspension auf dem Pad. Immobilisieren die Zellen durch Abdecken der Unterlage mit einem unbenutzten verbrannt Deckglas (Dicke Nein 1.5, passend zu den Mikroskop-Objektiv-Spezifikation) und durch Drücken ganz sanft auf der Folie. Zellen sollten innerhalb von 45 min der Immobilisierung vor den Agarose-Pad trocknet abgebildet werden. Um bei längeren Trocknungsversuche zu verhindern, können Agarose-Pads mit Silikondichtungen abgedichtet werden.
6. Für DNA-Schädigung Experimenten inkubiert Zellen auf dem Agarose-Pad, enthaltend 100 mM MMS für 20 min in einer Feuchtekammer bei Raumtemperatur vor der Abbildung immobilisiert.

3. Vorbereiten Mikroskopie Datenerfassung

PALM beruht auf der Erkennung und genaue Lokalisation von einzelnen fluoreszierenden Proteinen. Die Empfindlichkeit und optimale Ausrichtungdas Mikroskop ist entscheidend für die Qualität der Daten. Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskope verwenden typischerweise Total Internal Reflection (TIR) ​​Beleuchtung, um das Signal-zu-Rausch-Verhältnis durch spannende Fluorophore nur in einer dünnen Abschnitt über dem Deckglas Oberfläche zu verbessern. Hier Bildgebung innerhalb E. coli erfordert hoch schiefe Beleuchtung ^11, die auf einem TIRF Mikroskop leicht abnehm den Winkel des Anregungslicht erreicht wird. PAmCherry Bildgebung erfordert ferner eine 405 nm Laserphotoaktivierung und 561 nm Anregungslaser. Die Fluoreszenzemission wird auf einem Elektronenvervielfachungs CCD (EMCCD)-Kamera mit einer Vergrößerung, was zu einer Pixellänge von 114,5 nm / Pixel aufgezeichnet. Für eine optimale Lokalisierungsgenauigkeit, sollte die Pixelgröße etwa die Standardabweichung Breite der PSF entsprechen, um eine ausreichende Probennahme, ohne sich das Signal über zu viele Pixel zu gewährleisten. 3 zeigt eine schematische Darstellung einer minimalen PALM-Setup. Movie-1vermittelt einen Eindruck von der maßgeschneiderte Mikroskop Bauprozess, siehe Uphoff et al ⁷ für eine detaillierte Beschreibung des Instruments..

1. Darstellende Routinemikroskop Ausrichtung. Messung der 405 nm und 561 nm kontinuierliche Laser-Intensitäten vor dem Ziel. Einstellen der Intensität 561 nm bis 3,5 mW (~ 400 W / cm ²⁾ und 405 nm, Intensität 10 uW (~ 1 W / cm ^2). Verwenden Sie einen stufenlos variablen Graufilter Rad, das allmähliche Anpassung von 405 nm Intensität 0-10 uW ermöglicht. Abschalten der Laserbeleuchtung bis zum Beginn des Experiments.
2. Legen Sie die Probe auf dem Mikroskop Bühne und bringen die Zellen in den Fokus in Durchlichtmikroskopie-Modus (4A). Die EM-CCD Kameraverstärkung muss abgeschaltet werden, um Schäden an der Kamera durch Überbelichtung zu verhindern.
3. Definieren Sie eine beschnitten FOV zu Datengröße zu reduzieren und die Kamera Auslesegeschwindigkeit.
4. Decken Sie die Probe aus Umgebungslicht und der Schweizch auf der EM-CCD-Kamera zu gewinnen.
5. Stellen Sie die Bildrate auf 15,26 ms / frame (einschließlich 0,26 ms Kamera Auslesen). Siehe "Belichtungszeit und Anregungsintensitäten" in der Diskussionsabschnitt.
6. Anzeige der Kameradaten, um die dunkle Hintergrundsignal (4B) zu überprüfen.
7. Schalten Sie die 561-nm-Laser und überprüfen Sie die Anregung Hintergrundsignal (4C).
8. Schalten Sie die 405-nm-Laser für die Photoaktivierung der Pol1 PAmCherry-Fusionsproteine ​​und die Intensität, bis Fluoreszenz PSFs angezeigt.
9. Stellen Sie den Winkel des Anregungsstrahls nur eine dünne Schnitt der Probe in der Nähe der Deckfläche zu beleuchten.
   1. Zu diesem Zweck wird der Laserstrahl in der hinteren Brennebene einer 100X NA 1,4 Objektiv (3) fokussiert. Übersetzen der Fokussierungslinse senkrecht zum Strahl bewegt den Fokus weg von der Mitte der Objektiv wodurch der Strahl auf das Ziel unter einem Winkel verlassen.
   2. Aim, um die Fluoreszenzintensität zu maximieren und das Hintergrundsignal zu minimieren. Beachten Sie, dass strenge TIR-Anregung ist optimal, um Bild Fluorophore innerhalb von 100 nm von der Deckfläche, die Abbildung jedoch DNA-Bindeproteine ​​mit der E. zugehörigen coli Nucleoid erfordert tiefere Ausleuchtung bis 0,8 um.

4. Datenerfassung

Hier beschreiben wir die allgemeine Protokoll für die Übernahme eines PALM Film. Das gleiche Verfahren gilt für die Abbildung Pol1 PAmCherry-Fusionsproteine ​​in E. unbeschädigt coli-Zellen und DNA-Schäden unter Dauerbehandlung mit MMS. Die Anwendung der Methode zur Fusionsproteine ​​unterschiedlichen Molekulargewichts oder Kopienzahl pro Zelle unterschiedliche Einstellungen erfordern Akquisition (siehe Diskussion Abschnitt).

1. Suchen Sie eine neue Sichtfeld (FOV) von Zellen in Durchlichtmikroskopie-Modus und Fokus, das Bild. Nehmen Sie eine Kamera Momentaufnahme, um die Zelle Konturen (Abbildung 4A) aufzeichnen.
2. Decken Sie die Probe aus Umgebungslicht und schalten Sie die Kamera EMCCD Gewinn.
3. Schalten Sie die 561-nm-Laser und bleichen die zelluläre Autofluoreszenz-und Hintergrund-Spots auf dem Deckglas für ein paar Sekunden, bevor die Datenerfassung. Für Zellen gezüchtet und in M9-Medium abgebildet und Verwendung verbrannt Deckgläser gibt es in der Regel sehr wenig Fluoreszenzhintergrund, aber Vorbleichen nützlich sein könnte für Bildgebung von Zellen in einem reichen Wachstumsmedium wie LB sein. Beachten Sie, dass intensive Beleuchtung ist toxisch für Zellen, so Vorbleichen sollte auf einem Minimum gehalten werden.
4. Starten Sie den Erwerb eines PALM Film unter Dauer 561 nm Anregung bei 15,26 ms / frame.
5. Schalten Sie die 405-nm-Laser und nach und nach die Intensität im Laufe des Films zu erhöhen, die bis zu 1 W / cm ^2. Vermeiden Sie höhere Intensitäten 405 nm, die zelluläre Autofluoreszenz führen. Achten Sie auf die Dichte von fluoreszierenden Molekülen - es ist wichtig, um Aktivierungsraten niedrig zu halten, so dass PSFs sind deutlichisoliert in jedem Rahmen (Fig. 4D-F).
6. Aufzeichnen 10.000 Frames / Film (abhängig von der Anzahl der Moleküle pro Zelle abgebildet werden), ein Film dauert typischerweise 2-3 Minuten und erfordert 0,5-1 GB Festplatte in Abhängigkeit von der Größe des FOV.
7. Wiederholen Sie die Aufnahme für mehrere FOV. Beachten Sie, dass jedes FOV kann nur einmal abgebildet werden, weil PAmCherry Fluorophore bekommen photo und irreversibel gebleicht.

5. Datenanalyse

Eine automatisierte und robuste Datenanalyserahmen ist für die Leistung und Effizienz der Methode. Wir verwenden eigene Software in MATLAB geschrieben.

1. Führen die Analyse unter Verwendung von Lokalisierungs in Crocker et al. ¹² beschriebenen Algorithmen, Holden et al. ^13, HoldenI et al. ¹⁴ und Wieser et al. PSF ¹⁵ werden zunächst in einem Bandpass-gefilterten Bildes mit einem Gauß-Kern mit 7 Pixel identifizierts Messer (5A). Kandidatenpositionen entsprechen PSFs Spitzenpixelintensitäten über das 4,5-fache der Standardabweichung des Hintergrundsignals (Fig. 5B). Die lokal hellste Pixel pro Kandidat PSF dient als Startwert für die Montage einer elliptischen Gauß-Funktion (Abbildung 5C). Die freien Anpassungsparameter sind: X-Position, Y-Position, Breite x-, y-Breite, Drehwinkel, Amplitude und Offset-Hintergrund. Die elliptische Gauß-Maske macht Molekül während der Belichtungszeit, die Unschärfen und verformt die PSF.
2. Zeichnen Sie die resultierende (x, y) Lokalisierungen aus allen Rahmen der PALM-Film auf die Durchlichtmikroskopie Bild der gleichen Sichtfeld. Lokalisierungen Pol1-PAmCherry sollte im mittleren Bereich des E. erscheint coli-Zellen (Fig. 6A). Wenn viele Lokalisierungen außerhalb der Zellen erscheinen, wurde die Lokalisierung Schwelle zu niedrig eingestellt oder die Probe enthielt Hintergrund fluoreszierende Partikel.
3. Für automatisierte Tracking-Analyse, die MATLAB-Implementierung des in Crocker et al beschriebenen Algorithmus. ¹² kann verwendet werden (siehe "Diffusion-Analyse" in der Diskussion Abschnitt). Positionen, die in den nachfolgenden Frames innerhalb einer benutzerdefinierten Verfolgungsfenster sind verbunden, um eine Bahn zu bilden. In dem Fall, dass mehrere Lokalisierungen im selben Fenster auftreten, werden Spuren eindeutig durch Minimierung der Summe der Schrittlängen zugeordnet. Für eine ausführliche Diskussion der verschiedenen Aspekte bei der Berechnung der Diffusionskoeffizienten von Ein-Teilchen-Tracking-Daten finden Sie Wieser et al. ^15.
   1. Der Algorithmus verwendet eine Speicherparameter für transiente Blinken oder verpasste Lokalisierungen während einer Spur Konto. Hier stellen wir die Erinnerung Parameter auf 1 Frame, höhere Werte können für die Verfolgung Fluorophore mit langlebigen Dunkelzuständen verwendet werden.
   2. Wählen eines geeigneten Verfolgungsfenster auf der Grundlage der folgenden Kalibrierungsschritte. Für Pol1, verwenden wir 0,57 um (5 Punkte).
   3. Führen Sie den Tracking-Algorithmus für eine Reihe von Tracking-Fenster-Parameter. Berechnung der Anzahl der Spuren pro Zelle gemessen als Funktion der Verfolgungsfenster, um die kleinstmögliche Spur Fenster nicht spaltet Spuren (Fig. 6B) zu identifizieren.
   4. Plotten der resultierenden Spuren auf der Durchlichtmikroskopie Bild des gleichen FOV um die räumliche Verteilung der Molekülbewegung in den Zellen sichtbar zu machen. Pol1 Titel sollte Diffusion in einzelnen Zellen (6C-D) beschränkt anzuzeigen.
   5. Wenn eine Fraktion von Spuren zwischen den Zellen zu überqueren erscheint dies legt nahe, dass getrennte Moleküle irrtümlich verbunden, da die Verfolgungsfenster zu groß und / oder die Photogeschwindigkeit zu hoch war (Fig. 6E) gewählt.
   6. Zeichnen Sie die kumulative Verteilung der Schrittlängen zwischen aufeinander folgenden Lokalisierungen (6F). Die Kurve steigt und sättigt reibungslos für hinreichend große Tracking-Fensterzeigt aber eine Grenzkante, wenn das Fenster zu klein gewählt.
4. Um die Diffusionseigenschaften von Pol1 analysieren, berechnen Sie die mittlere quadratische Verschiebung (MSD) zwischen aufeinander folgenden Lokalisierungen für jeden Track mit insgesamt N Schritte):
   MSD = 1 / (N-1) Σ _{i = 1} ^N-1 (X _{i +1} - x _i) ² + (y _{i +1} - y _i) ^2.
   Nehmen Sie nur Tracks mit mindestens 4 Stufen (N ≥ 5 Lokalisierungen), die statistische Unsicherheit in den MSD-Werte zu reduzieren.
5. Zeichnen Sie eine Kurve der MSD-Werte über einen Bereich von Latenzzeiten durch Berechnung Verschiebungen über mehrere Frames (6G). Die Form des MSD-Kurve kann helfen, die beobachteten Molekülbewegung (6H) zu klassifizieren.
6. Berechnen Sie den scheinbaren Diffusionskoeffizienten D * pro Spur von der MSD:
   D * = MSD / (4 At) - σ _loc ² / At.
   Das zweite term korrigiert die geschätzte Fehlerlokalisierung (hier σ _loc = 40 nm und At = 15,26 ms, siehe Wieser et al. ^15).
7. Zeichnen Sie ein Histogramm der gemessenen D *-Werte von allen Spuren in der FOV (7A).
8. Identifizieren einzelner Pol1 Moleküle, die das Chromosom der Grundlage der gemessenen D *-Wert pro Spur gebunden erscheinen. Trennen Sie die Populationen der gebundenen (scharfe Verteilung zentriert D * ~ 0 um ² / sec) und frei diffundierenden Moleküle (breite Verteilung bei D zentriert * ~ 0,9 um ² / sec), indem Sie einen Schwellenwert D * <0,15 um ² / sec ( rote Balken in den 7A und 7D).
9. Führen Sie die Lokalisierung, Tracking, Analyse und Verbreitung für Pol1 in unbeschädigte Zellen (7A-C) und in Zellen unter DNA-Schäden, die Behandlung mit MMS (7D-E). Der Anteil an gebundenem Spuren eine direkte quantitative Messung der DNEine Reparatur Aktivität Pol1 in vivo.

Representative Results

Das Konzept der photoEinzelMolekül Verfolgung, um Protein-DNA-Wechselwirkungen in vivo zu untersuchen, ist in Fig. 1 dargestellt. PAmCherry Fusionsproteinen in lebenden E. erkannt coli-Zellen in einer sequentiellen Weise durch Photoaktivierung einzelne Moleküle stochastisch mit 405 nm Licht bei einer Frequenz von weniger als ein Molekül pro Zelle zu einem Zeitpunkt. Aktivmoleküle unter Dauer 561 nm Anregung abgebildet. Molekularbewegung in der Zelle kann durch Verbinden der Nähe Lokalisierungen in einer Reihe von Rahmen, bis irreversible Photobleichen verfolgt werden. Da die Diffusion von DNA-bindenden Proteinen basiert auf der Bindung des Chromosoms verlangsamt, der scheinbare Diffusionskoeffizient D * pro Spur erhalten direkt berichtet über einzelne Protein-DNA-Wechselwirkungen.

Abbildung 2 zeigt die Photoaktivierung Pol1 PAmCherry-Fusionsproteinen in lebenden E. coli-Zellen. Der Einfluss der 405 nm Intensität on die Dichte der fluoreszierenden Moleküle in der Fig. 4 gesehen werden. Beachten Sie, dass die Dichte nicht allein durch die 405 nm Intensität, sondern zusätzlich durch die Anzahl der Moleküle, die zur Aktivierung zur Verfügung stehen bestimmt, der Pool der verbleibenden Moleküle innerhalb eines PALM Film erschöpft.

Lokalisierungs Analyse wird für jeden Rahmen eines PALM Film, wie in Fig. 5 dargestellt ausgeführt. Wir maßen die Lokalisierungsgenauigkeit mit unbeweglichen Moleküle in Zellen oder Fest gebundene Moleküle in lebenden Zellen. Unsere Akquisitions Einstellungen gab eine Lokalisierungsgenauigkeit von σ _loc = 40 nm, in Übereinstimmung mit der theoretischen Vorhersage ^3.

Die resultierenden Pol1 Lokalisierungen besetzen den zentralen Bereich der Zelle (Fig. 6A), breit rekapituliert die räumliche Organisation des E. coli Nucleoid ^7. Die Mehrheit der Pol1 Tracks in unbeschädigten Zellen zeigen verFusions wie in Fig. 6C gezeigt. Eine typische Zelle mehrere hundert Pol1 Spuren (Fig. 6D), die mit der Kopienzahl von etwa 400 Moleküle pro Pol1 E. enthält . coli Zelle ¹ 6B und 6E-F geben Hinweise auf die Wahl eines geeigneten Tracking-Parameter-Fenster - wenn die Tracking-Fenster zu groß ist, sind verschiedene Moleküle wahrscheinlicher zu werden fälschlicherweise zu einer Spur verbunden, und wenn die Verfolgungsfenster zu klein ist, Titeln mit mehr Schritte aufgeteilt werden. Der MSD-Kurve für Pol1 steigt linear für kurze Verzögerungszeiten und sättigt bei längeren Verzögerungszeiten durch Zellhaft (6G). Verschiedene Arten der Molekularbewegung durch MSD-Analyse identifiziert werden. Regie Bewegung gibt eine parabolische Kurve; Brownsche Bewegung wird durch eine gerade Linie gekennzeichnet, die engen Diffusionskurve ein Plateau erreicht; ein Versatz der MSD-Kurve für immobile Partikel stellt die localization Unsicherheit (6H). Weitere Informationen auf Einzelpartikelverfolgung und Tipps zur Fehlerbehebung in Arnauld et al. ¹⁶ zu finden

Wir haben vorher die Methode angewandt, um die DNA-Reparaturaktivität von Pol1 in Reaktion auf exogene DNA-Alkylierung Schaden ⁷ zu messen. Die D * Histogramm Pol1 Tracks in unbeschädigten Zellen zeigt einen dominanten Bevölkerung diffundieren Moleküle (7A-C). Ein kleiner Anteil von 2,7% gebundenes Pol1 Moleküle wahrscheinlich in rückständigen Strang Replikation und Reparatur von endogenen DNA-Schäden beteiligt. Im Dauer 100 mM MMS Schäden, die Bevölkerung von Tracks mit D * ~ 0 um ² / sec erhöht sich auf 13,8% (Abbildung 7D). Diese Spuren stellen einzelne Moleküle Pol1 Durchführung der DNA-Reparatursynthese zu Single-Nukleotid-Lücken als Teil der Basis-Exzisionsreparatur Weg zu füllen. Die Positionen der gebundenen Spuren zeigen die Standorte der einzelnenDNA-Schäden und Reparaturstellen (7E-F).

Fig. 1 ist. Grafische Darstellung der Methode. (A) Das fluoreszierende Protein PAmCherry kann aus einer anfänglichen nicht-fluoreszierenden Zustand bei Bestrahlung mit 405-nm-Licht photoaktiviert werden. Die hellen Zustand ist bei 561 nm angeregt und emittiert Fluoreszenz um 600 nm bis die Fluorophor Bleich irreversibel. (B) Steuerung der Photoaktivierung Rate ermöglicht die Abbildung nur eine einzige stochastisch aktiviert PAmCherry Fusionsprotein pro Zelle zu jeder Zeit während der beliebig großen Pool von Molekülen, die noch nicht in einem Dunkelzustand aktiviert wurden oder bereits gebleicht bleibt. (C) Die Position des fluoreszierenden Moleküls von der Mitte des isolierten PSF und trfür mehrere Frames acked bis Bleichen. (D) Tracks vieler Moleküle werden in sequentieller Weise aufgezeichnet. (EF) Die Wechselwirkung von einem DNA-bindenden Protein mit einer chromosomalen Ziel-Sequenz oder Struktur hält den Zufallsdiffusionsbewegung. Gebundenen und ungebundenen Moleküle werden von der scheinbaren Diffusionskoeffizienten D * von Einzelspuren extrahiert aus. Der resultierende Anteil an gebundenen Molekülen gibt ein quantitatives Maß für die Aktivität eines DNA-bindenden Proteins in vivo. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

2. Photoaktivierung von Pol1-PAmCherry live E. coli-Zellen. Maßstabsbalken: 1 um. Schaltpläne sind unter jedem Panel angezeigt. ( A) Lichtmikroskopische Aufnahme von Zellen auf einem Agarose-Pad immobilisiert übertragen. (B) Phototactivating eine einzige PAmCherry Fluorophor in einer Zelle. (C) eine höhere Photogeschwindigkeit erhöht die Anzahl der Fluoreszenzmoleküle. (D) Integrierte PAmCherry Fluoreszenz von einem Palm-Film. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

3. Schematische Darstellung einer minimalen PALM-Setup zur Photoaktivierung und Imaging PAmCherry Fusionsproteine ​​D1:. Dichroitische Spiegel (z. B. 550 nm Langpass). D2: Der dichroitische Spiegel (z. B. 570 nm Langpass). L1: Kollimatorlinse. L2: TIR-Linse. L3: Tube-Objektiv.1177/51177fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

4. Repräsentative Bilder von einem Film mit PALM 15.26 ms / frame Maßstabsbalken:. 1 um. (A) Lichtbild von Zellen auf einem Agarose-Pad immobilisiert übertragen. (B) Dunkler Hintergrund Bild gemessen an der EM-CCD-Kamera mit der Laser abgeschaltet. (C) Die Anregung Hintergrundbild unter Dauer 561 nm Anregung, bevor die Photoaktivierung. (DF) Erhöhte Intensität 405 nm führt zu höheren Raten von Photo PAmCherry, unter Dauer 561 nm Anregung abgebildet. Die eingerahmten Flächen sind unten vergrößert dargestellt. (D) Nieder 405 nm Intensität (<1 uW) Aktiv sehr wenige fluoreszierende Moleküle pro FOV. (E) Medium 405nm Intensität (~ 2 uW) Photoaktivierung führt zu einer guten PSF Dichte für die Lokalisierung und Tracking-Analyse. (F) Höhere 405 nm Intensität (~ 10 uW) aktiviert mehr als einem fluoreszierenden Molekül in einigen Zellen, die die Lokalisierung und Tracking-Analyse verdeckt. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

5. Illustration des Lokalisierungsanalyse. Maßstabsbalken: 1 um (A) Band-Pass-Filtern entfernt störende Pixelrauschen und flacht Intensitätsgradienten über das FOV.. (B) Bewerber PSFs werden in der gefilterten Bildes basierend auf einer benutzerdefinierten Schwelle, die gewählt wird, um falsch-positive und falsch-negative Erkennungen zu minimieren, identifiziert. Die threshoLD entspricht der minimalen Intensität eines Kandidatenpixel geteilt durch die Hintergrund-Standardabweichung (Signal-zu-Rausch-Verhältnis, SNR). (C) Die lokal hellste Pixel, die die Schwelle dient als Ausgangs Lokalisierung Vermutung (orange Kreuz) für einen zweidimensionalen elliptischen Gauß-Passform geht. Maßstabsbalken: 0,5 um. Die daraus resultierende Super-Resolution-Lokalisierung (blaues Kreuz) eine durchschnittliche Genauigkeit von σ _loc = 40 nm. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

.. Abbildung 6 Abbildung der Tracking-Analyse Maßstabsbalken: 1 um. (A) Alle erkannten Lokalisationen Pol1-PAmCherry in einem Beispiel Zelle. (B) Anzahl der Spuren erkennened im Beispiel Zelle als Funktion des Spurfenster. Kleine Tracking-Fenster unterteilt Molekül Trajektorien, die zu hohe Anzahl an Titeln Artefakt führt. Die gestrichelte Linie zeigt unsere Wahl für den Tracking-Parameter-Fenster (0,57 um, 5 Punkte) - das gibt einen guten Kompromiss zwischen Erfassung der Vollausschüttung von Schritten und halten die Bahnen der verschiedenen Moleküle intakt. (C) Beispiel einer einzelnen Spur Pol1 PAmCherry-Molekül. (D) Alle in zufälligen Farben gezeigt, gemessen Spuren. (E)-Tracking-Artefakte, wenn die Tracking-Fenster zu groß gewählt (hier 0,8 um 7 Pixel) ist oder die Dichte des PSFs pro Frame zu hoch. (F) Kumulative Verteilungen der Schrittlängen für das Tracking-Fenster: 0,34 um (3 Pixel, rote Linie), 0,57 um (5 Pixel, blaue Linie), und 0,80 um (7 Pixel, grüne Linie). Beachten Sie, dass die 0,34 um Tracking-Fenster schneidet Schritte länger als 0,34 um was eindeutigschneidet die komplette Distribution von Schritten. Die Tracking-Fenster erkennt 0,57 um fast die gleiche Verteilung von Schritten, ebenso wie die 0,80 um Tracking-Fenster. (G) MSD-Kurve zeigt, beschränkt Diffusion von Pol1. (H) Schematische MSD-Kurven für gerichtete Bewegung, die Brownsche Bewegung, beschränkt Diffusion und immobile Partikel. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Abbildung 7. Direkte Messung des DNA-Reparaturaktivität von Pol1 live E. . coli-Zellen Maßstabsbalken: 1 um. (A) Histogramm der scheinbaren Diffusionskoeffizienten D * für alle Spuren von 4 oder mehr Schritte in einem Sichtfeld von unbeschädigten Zellen (N = 4.162 Spuren). Die Bevölkerung von Molekülen als b eingestuft ound ist rot markiert. (BC) Tracks von Pol1-PAmCherry sind auf einer übertragenen Bildlichtmikroskopie gezeigt. Tracks wie klassifiziert nach ihrer Diffusionskoeffizienten gebunden sind rot dargestellt. (D) D * Histogramm für Pol1 Spuren in Zellen auf einem Agarose immobilisiert Pad mit 100 mM MMS und für 20 min inkubiert, bevor die Abbildung (N = 2.128 Spuren) gemessen. Die Bevölkerung der gebundenen Moleküle der DNA-Reparatur tätig ist rot dargestellt. (EF) Pol1-PAmCherry Spuren auf Mikroskopie-Bild übertragen Licht, die die Spuren der einzelnen Pol1 DNA-Reparatur-Ereignisse in rot. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Film 1. Der Aufbau einer maßgeschneiderten PALM-Setup.JoVE_Uphoff_Movie1.avi "target =" _blank "> Klicken Sie hier, um Video anzusehen.

Discussion

Wir diskutieren verschiedene Schlüsselaspekte für den Erfolg des Experiments.

Wahl und die Expression des fluoreszierenden Fusionsprotein: Es gibt eine große Palette von photoaktivierbaren und photo fluoreszierende Proteine ^​​17. Die spezielle Auswahl richtet sich nach den Mikroskop Eigenschaften, insbesondere der Laser und Filter zur Verfügung. Die Kombination von 405 nm und 561 nm ist für gemeinsame photoaktivierbare fluoreszierende Proteine. Wir haben uns für PAmCherry ^6, weil es ist monomeren und zeigte keine Aggregation in den Zellen. Darüber hinaus ermöglicht irreversible Photo Zählen der Anzahl der aktivierten Fluorophore zu Protein Kopienzahl pro Zelle zu messen. Anstatt das Fusionsprotein aus einem Plasmid exprimiert, bevorzugen wir die chromosomale Insertion des Gens für das Fusionsprotein an der Wildtyp-Locus. Dies gewährleistet eine vollständige Ablösung des Proteins von Interesse mit der Fluoreszenz version und die Aufrechterhaltung der Expressionsniveau Wildtyp.

Photoaktivierung Rate: Es ist wichtig, um die Photoaktivierung Rate, so dass im Durchschnitt weniger als ein Molekül pro Zelle ist in der fluoreszierenden Zustand in jedem Bild des Films anzupassen. Dies hängt von der Intensität 405 nm und die Zahl der Moleküle von links nach aktiviert werden. Bei sehr niedrigen Bilddichten jedoch nicht alle Moleküle wird noch vor Ende des Films abgebildet werden oder sehr lange Filme müssen erworben werden. Die Anzahl der Frames pro Film aufgezeichnet ist abhängig von der Kopienzahl von Fusionsproteinen pro Zelle und die mittlere Lebensdauer der Photobleaching PAmCherry bei den Anregungsbedingungen. Die Kopienzahl ist Pol1 ~ 400 Moleküle / Zelle ¹ und der mittlere Wert der Exponentialfunktion Bleichen Lebensdauerverteilung betrug ~ 4 Rahmen. Durch die Erhöhung der 405 nm Intensität allmählich wird der Aktivierungs gleichmäßig über 10.000 Einzelbilder des Films verteilt sind. Daher ist jede Zelle occupdurch fluoreszierende Moleküle für insgesamt ~ 1.600 Rahmen ied, wodurch kleine Überlappung von PSF-und Spur Komplikationen in einem Film von 10.000 Frames.

Belichtungszeit und Anregungsintensitäten: In erster Linie müssen Belichtungszeiten kurz genug sein, um scharfe PSFs mit wenig Bewegungsunschärfe zu beobachten. Jedoch sollte die Frame-Rate gewählt, um beobachtbare Molekularbewegung zwischen aufeinanderfolgenden Rahmen über die Lokalisierungsunsicherheit zu ergeben, andernfalls entscheidend Photonen werden durch Überabtastung des Spur verschwendet. Die Bewegung des ungebundenen Moleküle müssen ausreichend lange Zeitintervallen abgetastet werden, deutlich von der scheinbaren Bewegung der gebundenen Moleküle aufgrund der Lokalisierungsunsicherheit zu sein. Wenn die Belichtungszeit eingestellt ist, sollte die PSF Intensität eingestellt werden. Die Lokalisierungsgenauigkeit eines PSF mit der Anzahl von Photonen über die Dauer eines Rahmens detektiert wird. Höhere Anregungsintensitäten erhöhen die Photonenemissionsrate but auch die Photobleisatz und Hintergrundsignal. Verwenden Sie die niedrigste Anregungsintensität, die den gewünschten Lokalisierungsgenauigkeit gibt. Für Pol1-PAmCherry haben wir uns für 15.26 ms / Frame und 3,5 mW 561 nm-Anregung (400 W / cm ^2). Es ist wichtig, die Lebensfähigkeit der Zellen für die jeweiligen Aufnahmebedingungen zu bestätigen durch die Überwachung von Zellwachstum und Morphologie vor und nach der Datenerfassung (siehe Zusatzinformationen in Uphoff et al. ^7).

Pol1 zeigt eine verbindliche Zeit von ~ 2 s auf eine Lücken-DNA-Substrat in vivo ^7, wir erwarten daher, dass die Mehrheit der Moleküle für die gesamte Dauer eines Titels entweder im gebundenen oder ungebundenen Zustand. Gebundenen Moleküle erscheinen im Wesentlichen unbeweglich da Chromosom Websites haben eine Diffusionskoeffizienten um mehrere Größenordnungen niedriger ⁽¹⁸ ~ 10 ^-5 um ² / sec, Elmore et al.) Als Pol1 Diffusion in das Zytoplasma (~ 1 um ²

Diffusion-Analyse: Die scheinbare Diffusionskoeffizienten D * wird von der MSD einzelner Spuren berechnet, ein Minimum von 4 Stufen (5 Bilder), gemittelt über die statistischen Fehler zu reduzieren. Beachten Sie, dass ~ 75% der Moleküle Bleichen innerhalb von weniger als 5 Rahmen für den beschriebenen Bilderzeugungsbedingungen. Solche kurzen Tracks bieten keine ausreichende statistische Sicherheit zu gebundenen und ungebundenen Moleküle unterscheiden. Jedoch sind die relativen Anteile von gebundenen und ungebundenen Moleküle, die auf der Proteinaktivität zu berichten, unabhängig von der Gesamtzahl der analysierten Spuren.

Es ist nützlich, um die PSF Lokalisationsfehler (σ _loc) bei der Berechnung der D *-Konto, weil die Unsicherheit fügt ein scheinbares Zufalls Schritt zur Lokalisierung eines jeden Moleküls ^15.

Um die Klassifizierung von gebundenen und diffundierende Moleküle zu verbessern, empfehlen wir die Berechnung D * Both von der Einzelschritt-Bewegungen und Verschiebungen über die Zeit der zwei Rahmen. Es ist dann möglich, zwei getrennte D * Schwellenwerte festlegen: D * (15 ms) <0,15 um ² / s und D * (30 ms) <0,075 um ² / sec.

Beachten Sie, dass D * eine scheinbare Diffusionskoeffizient, der durch Zell Einschluss der Spuren und Bewegungsunschärfe aufgrund der Diffusion während der Belichtungszeit beeinflußt wird. Um genaue unvoreingenommene Diffusionskoeffizienten zu extrahieren, ist es nützlich, um die beobachtete Bewegung simulierten Daten auf der Grundlage einer stochastischen Brownsche Bewegung Modell ^5,7 Vergleichs bewährt. Simulierten Daten können auch verwendet werden, um Datenanalyseverfahren testen.

Mögliche Anwendungen dieser Methode: Wir beschrieben einen allgemeinen Ansatz zur Visualisierung und Quantifizierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in vivo durch die Veränderung in der Mobilität eines Proteins bei Bindung an das Chromosom. Die Aktivitäten der DNA-oderRNA-bindende Proteine ​​in Reparatur beteiligt, Replikation, Transkription und Chromosom Wartung kann somit in Echtzeit auf der Ebene einzelner Zellen mit einer Auflösung unterhalb der optischen Beugungsgrenze einzuhalten. Photoactivated Einzelmolekül-Tracking erweitert herkömmlichen Tracking-Methoden, die auf ein paar markierte Moleküle pro Zelle beschränkt werden. Eine alternative Methode, die molekulare Diffusion in vivo misst ist Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP). Während FRAP ist sehr nützlich zur Messung globaler Diffusionseigenschaften in großen Zellen ist es in seiner Fähigkeit, verschiedene Molekülarten mit unterschiedlichen Mobilitäten in einem räumlich heterogenen Umgebung zu lösen, insbesondere für kleine Bakterienzellen begrenzt.

Wir haben photoEinzelMolekül-Tracking eingesetzt, um DNA-Bindungsaktivitäten und subzellulärer Lokalisierungen aus einer Reihe von verschiedenen Proteinen in E. messen coli einschließlich Pol1, DNA-Ligase, Fis Protein-, DNA^{Polymerase-III-7,} sowie Bauliche Erhaltung von Chromosomen Proteine ​​MukB, E, und F ^19. Wir erwarten, kann das Verfahren auch auf andere Zelltypen angepasst werden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a PAmCherry DNA-binding fusion protein			created by Lambda-Red recombination
MEM amino acids	Invitrogen	11130-051	minimal medium supplement
MEM vitamins	Invitrogen	11120-052	minimal medium supplement
Agarose	BioRad	161-3100	certified molecular biology grade
Microscope coverslips No 1.5 thickness	Menzel	BB024060SC	remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1 hr
Methyl methanesulfonate (MMS)	Sigma-Aldrich	129925	CAUTION: toxic
PALM setup	home-built		described in Uphoff et al.7
MATLAB	MathWorks		for data analysis and visualization
Localization software	custom-written, available online	http://www.physics.ox.ac.uk/Users/kapanidis/Group/Main.Software.html	MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. Cite Holden et al.13 if used in publication.
Tracking software	available online	http://physics.georgetown.edu/matlab/	MATLAB implementation by Blair and Dufresne. Cite Crocker & Grier12 if used in publication.