단일 분자 추적과 함께 Photoactivated 현지화 현미경 (PALM)은 허용 라이브 대장균 세포에서 단백질-DNA 상호 작용의 직접 관찰 및 정량화.
단백질-DNA 상호 작용은 많은 기본적인 세포 과정의 핵심이다. 예를 들어, DNA 복제, 전사, 보수, 및 염색체 조직 체외 실험은 DNA-결합 단백질의 여러 유형의 기능에 대한 상세한 모델을 생성하도록 도왔다. 특정 DNA 구조 나 서열을 인식하는 DNA-결합 단백질에 의해 규율, 아직 , 살아있는 세포의 복잡한 환경에서 이러한 프로세스와 조직의 정확한 메커니즘은 훨씬 덜 이해 남아있다. 우리는 최근에 Photoactivated 현지화 현미경 단일 분자 추적과 결합 (PALM)를 사용하여 라이브 대장균 세포에서 DNA 수리 활동을 정량화하는 방법을 소개했다. 우리의 일반적인 방법은 염색체와 연결시 하나의 단백질의 이동성의 변화에 의해 개인의 DNA 결합 이벤트를 식별합니다. 결합 된 분자의 일부는 단백질 행위에 대해 직접 정량적 측정을 제공합니다단일 세포 수준에서의 ivity 및 기판 또는 결합 부위의 풍요 로움. 여기서는 방법의 개념을 설명하고, 샘플 준비, 데이터 수집 및 데이터 분석 절차를 보여준다.
이 프로토콜은 대장균 살아있는 세포에서 단백질-DNA 상호 작용의 직접적인 측정을 설명한다. 그것은 염색체 (도 1)로 결합 기술은 단일 형광 표지 된 단백질의 확산 계수의 변화를 이용한다. 우리는 DNA 중합 효소 지체 가닥 복제 및 절단 수리 경로 1의 DNA 갭을 채우는 I (POL1), 원형 DNA 결합 단백질을 사용하는 방법을 보여주기 위해.
슈퍼 해상도의 형광 현미경의 출현은 나노 미터 해상도의 세포에서 분자 구조의 시각화를 가능하게한다. Photoactivated 현지화 현미경 (PALM)는 형광 상태 (그림 2)에 초기 암 상태에서 활성화 할 수있는 형광 단백질을 사용합니다. 남은 모든 표지 분자의 서브 세트를 독립적으로 t, 순차적 인 방식으로 자신의 위치를 결정하기 위하여 임의의 시간에 활성화 될그는 샘플 2에 표시된 분자의 농도를 총. 분자 당 국산화 정도는 주로 형광 포인트 확산 함수 (PSF)의 크기에 따라, 수집 된 광자의 수 및 배경 신호 3. 이 방법의 대부분의 응용 프로그램은 세포 구조의 개선 된 시각화에 초점을 맞 춥니 다. 추적 PALM은 단일 분자와 결합 할 수있는 실현 4 직접 살아있는 세포의 표지 단백질의 임의의 숫자의 움직임에 따라 새로운 길을 열었습니다. 향상된 감도와 형광 현미경의 시간 해상도는 이제 세균 세포질 5에서 하나의 확산 형광 단백질의 추적을 할 수 있습니다.
여기, 우리는 PAmCherry, 비가 역적으로 405 nm의 빛 6 조사에 형광 상태로 초기 비 형광 상태에서 변환하는 설계 형광 단백질을 사용합니다. 활성화 PAmCherry의 형광 이미지 될 수 있습니다561 nm의 여기 및 photobleaching에까지 여러 프레임에 대해 추적에 의해 개발. 우리는 POL1 및 PAmCherry의 융합 단백질을 사용하여 단일의 과도 DNA-결합 이벤트를 식별하는 방법의 능력을 보여준다. 메틸 메탄 (MMS)와 세포 치료는베이스 절단 수리 효소에 의해 갭 DNA 기판으로 설정되어 DNA 메틸화 파손의 원인이됩니다. 우리의 방법은 MMS 손상 7에 대한 응답으로 단일 POL1 분자의 결합 분명히 보여줍니다.
우리는 실험의 성공을 위해 몇 가지 주요 고려 사항에 대해 설명합니다.
어워드 및 형광 융합 단백질의 발현 : 광활성 및 광전 환성 형광 단백질 (17)의 큰 팔레트가있다. 특정 선택은 현미경의 특성, 사용 가능한 특히 레이저와 필터에 따라 달라집니다. 405 ㎚, 561 ㎚의 조합은 일반적인 광활성 형광 단백질에 이상적입니다. 우리는 단량체 때문에 PAmCherry 6을 선택하고 셀의 집계를 보여 주었다. 또한, 비가역 photoactivation는 셀 당 단백질의 카피 수를 측정 할 수있는 활성화 된 형광체의 수를 카운트한다. 대신 플라스미드에서 융합 단백질을 발현 제외한 야생형 유전자좌 융합 단백질을 코딩하는 유전자의 염색체 삽입을 선호한다. 이 형광을했습니다와 관심의 단백질의 완전한 교체를 보장합니다rsion 및 야생형 발현 수준을 유지.
Photoactivation 레이트 : 이것은 평균적으로 셀 당보다 작은 분자는 동영상의 모든 프레임에서 형광 상태로되도록 photoactivation 속도를 조절하는 것이 중요하다. 이것은 405 nm의 강도에 의존하고 분자수가 활성화하는 왼쪽. 매우 낮은 영상 밀도에서, 그러나, 모든 분자는 영화가 끝나기 전에 이미지를 만들거나 매우 긴 영화를 취득해야합니다. 영화 당 기록 된 프레임의 수는 융합 세포 당 단백질과 사용 여기 조건에서 PAmCherry의 평균 photobleaching에 일생 일대의 카피 수에 따라 달라집니다. POL1의 카피 수는 ~ 400 분자 / 셀 1과 지수 광표백 수명 분포의 평균값은 1 ~ 4의 범위였다. 점차적으로 405 nm의 강도를 증가시킴으로써, 활성화 균등 영화의 10,000 프레임을 통해 배포됩니다. 따라서 각 셀은 occup이다PSFS 10,000 프레임의 동영상에서 추적 합병증이 거의 중복을 보장합니다 ~ 1,600 프레임의 총에 형광 분자에 의해 IED.
노출 시간과 여기 강도는 : 제일 중요 한건, 노출 시간은 약간의 모션 블러와 함께 날카로운 PSFS을 관찰하기에 충분히 짧게 할 필요가있다. 그러나, 프레임 레이트가 지역화 불확도 넘어 연속 프레임 간의 관찰 분자 운동을 수득하도록 선택되어야하고, 그렇지 않으면 결정적인 광자 트랙 오버 샘플링에 의해 낭비된다. 언 바운드 분자의 운동은 현지화 불확실성으로 인해 결합 분자의 겉보기 운동에서 명확히 구별로 충분히 긴 시간 간격으로 샘플링해야합니다. 노출 시간이 설정되면, PSF 강도가 조정되어야한다. PSF의 국산화 정도는 프레임의 지속 기간 동안 검출 된 광자의 수에 따라 증가한다. 고등 여진 강도는 광자 방출 속도를 증가 BU또한 t 광표백 레이트 및 백그라운드 신호. 원하는 현지화 정밀도를 제공하는 가장 자극 강도를 사용합니다. POL1-PAmCherry 위해 우리는 15.26 밀리 초 / 프레임과 3.5 mW의 561 nm의 여기 (400 W / cm 2)를 선택했다. 그것은 (Uphoff 외. 7에서 부가 정보를 참조) 데이터 수집 전후 세포 성장 및 형태를 모니터링하여 특정 촬상 조건 세포 생존을 확인하는 것이 중요하다.
POL1 생체 7 갭 DNA 기판에 1 ~ 2 초 바인딩 시간을 나타내고, 따라서 우리는 분자의 대부분은 트랙의 전체 기간 동안 바운드 또는 언 바운드 상태가 될 것으로 예상된다. 염색체 사이트는 세포질에있는 POL1 확산 (1 ~ 2 ㎛보다 확산 계수에게 크기 이하의 몇 배 (~ 10 -5 ~ 2 ㎛ / 초, 엘모어 등. 18)이 있기 때문에 바인딩 분자는 기본적으로 고정되어 나타납니다 </s위로> / 초).
확산 분석 : 명백한 확산 계수 D의 *는 개별 트랙의 MSD로부터 계산되어, 통계적 에러를 줄이기 위해 4 단계 (5 프레임)의 최소 이상의 평균. 그 ~ 분자의 75 %가 설명하는 영상 조건보다 5 프레임 내에서 표백합니다. 이러한 짧은 트랙은 바운드 및 언 바운드 분자를 구별 할 수있는 충분한 통계적 확실성을 제공하지 않습니다. 그러나, 단백질의 활성을보고 바운드 및 언 바운드 분자의 상대적인 분획 분석 트랙들의 총 수와 무관하다.
불확실성이 분자 (15)의 각 현지화 명백한 임의의 단계를 추가하기 때문에 그것은 D의 *의 계산에서 PSF 현지화 오류 (σ의 LOC)을 설명하는 데 유용합니다.
바인딩 및 확산 분자의 분류를 개선하기 위해, 우리는 D의 * 봇을 계산하는 것이 좋습니다두 프레임의 시간 동안 단일 단계 변위 및 변위로부터 H. 그것은 두 개의 D * 임계 값을 설정하는 것이 가능합니다 : D의 * (15 밀리 초) <0.15 μm의 2 / 초와 D의 * (30 밀리 초) <0.075 μm의 2 / 초.
D의 *가 노출 시간 동안 인해 확산에 치우침 트랙과 운동의 휴대 제한에 의해 영향을받는 겉보기 확산 계수합니다. 정확한 공정한 확산 계수를 추출하기 위해서는, 스토캐스틱 브라운 운동 모델 5,7에 근거 시뮬레이션 데이터에 관찰 동작과 비교하는 것이 유용 입증되었다. 시뮬레이션 된 데이터는 데이터 분석 절차를 테스트하는데 사용될 수있다.
이 방법의 응용 가능성 : 우리는 염색체에 결합시 단백질의 이동성의 변화에 의해 생체 내에서 단백질-DNA 상호 작용을 시각화하고 정량화하기위한 일반적인 방법을 설명했다. DNA 또는의 활동수리에 관련된 RNA 결합 단백질은, 복제, 전사, 염색체의 유지 보수, 따라서 광학 회절 한계 이하의 공간 해상도를 가진 단일 세포 수준에서 실시간으로 따라 할 수 있습니다. Photoactivated 단일 분자 추적 셀 당 몇 표지 분자로 제한하는 종래의 추적 방법을 확장합니다. 생체 분자의 확산을 측정하는 다른 방법은 (FRAP)를 광표백 후 형광 복구합니다. FRAP 큰 세포에서 해외 확산 특성을 측정하는데 매우 유용하지만, 특히 작은 박테리아 세포에 대해, 공간적으로 서로 다른 환경에서 서로 다른 이동성을 가진 여러 분자 종을 해결하는 능력이 제한된다.
우리는 DNA 결합 활동과 E. 다른 단백질의 범위의 세포 내 현지화를 측정하기 위해 추적 photoactivated 단일 분자를 적용한 콜라이 POL1, DNA 리가 아제, FIS 단백질, DNA 등중합 효소 III 7뿐만 아니라 염색체 단백질 MukB, E, 및 F (19)의 구조 유지. 우리는 방법은 또한 다른 세포 유형에 적용 할 수 예상된다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 지역화 소프트웨어에 대한 맞춤 현미경과 시머 홀든의 건설에 대한 도움말 저스틴 Pinkney 요하네스 홀바인을 인정합니다. 로드리고 레예스 – Lamothe는 E.를 제공하기위한 감사합니다 대장균 균주. 연구는 유럽위원회 (European Commission) 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 그랜트 FP7/2007-2013의 건강 F4-2008-201418, 영국 생물 공학 및 생물 과학 연구 협의회 부여 BB/H01795X/1 및 ANK에 유럽 연구위원회 그랜트 261227에 의해 투자되었다. DJS는 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 프로그램 그랜트 WT083469에 의해 투자되었다. SU는 매스 웍스의 박사 친교에 의해 지원되었다.
E.coli strain carrying a chromosomal insertion for a PAmCherry DNA-binding fusion protein | created by Lambda-Red recombination | ||
MEM amino acids | Invitrogen | 11130-051 | minimal medium supplement |
MEM vitamins | Invitrogen | 11120-052 | minimal medium supplement |
Agarose | BioRad | 161-3100 | certified molecular biology grade |
Microscope coverslips No 1.5 thickness | Menzel | BB024060SC | remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1h |
Methyl methanesulfonate (MMS) | Sigma-Aldrich | 129925 | CAUTION: toxic |
PALM setup | home-built | described in Uphoff et al. 2013 | |
MATLAB | MathWorks | for data analysis and visualization | |
Localization software | custom-written, available online | http://www.physics.ox.ac.uk/Users/kapanidis/Group/Main.Software.html | MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. Cite Holden et al. 2010 if used in publication. |
Tracking software | available online | http://physics.georgetown.edu/matlab/ | MATLAB implementation by Blair and Dufresne. Cite Crocker & Grier 1996 if used in publication. |