Microscopía de localización fotoactivado (PALM) combinada con el seguimiento de una sola molécula permite la observación directa y la cuantificación de la proteína-DNA en células de E. coli vivas de Escherichia.
Proteína-DNA están en el corazón de muchos procesos celulares fundamentales. Por ejemplo, la replicación del ADN, transcripción, reparación y organización de los cromosomas se rigen por las proteínas de unión al ADN que reconocen estructuras o secuencias específicas de ADN. Experimentos in vitro han ayudado a generar modelos detallados para la función de muchos tipos de proteínas de unión al ADN, sin embargo, , los mecanismos exactos de estos procesos y su organización en el complejo entorno de la célula viva siguen siendo mucho menos comprendidos. Recientemente hemos introducido un método para cuantificar las actividades de reparación del ADN en células de Escherichia coli en vivo usando fotoactivado Localización Microscopía (PALM) combinada con el seguimiento de una sola molécula. Nuestro enfoque general identifica los eventos de unión al ADN individuales por el cambio en la movilidad de una sola proteína en asociación con el cromosoma. La fracción de moléculas ligadas proporciona una medida cuantitativa directa para el acto de proteínasividad y abundancia de sustratos o sitios de unión a nivel de una sola célula. A continuación, describimos el concepto del método y demostrar la preparación de muestras, adquisición de datos, y los procedimientos de análisis de datos.
Este protocolo describe la medición directa de la proteína-DNA en células de Escherichia coli que viven. La técnica utiliza el cambio en el coeficiente de difusión de una sola proteína marcada con fluorescencia ya que se une el cromosoma (Figura 1). Para demostrar el método que utilizamos ADN polimerasa, una proteína de unión al ADN prototípico I (Pol1) que llena las lagunas de ADN en la replicación del filamento de revestimiento y las vías de reparación por escisión de 1.
El advenimiento de la microscopía de fluorescencia de super-resolución permite la visualización de estructuras moleculares en las células con resolución nanométrica. Fotoactivado Localización Microscopía (PALM) emplea las proteínas fluorescentes que se pueden activar desde un estado oscuro inicial a un estado fluorescente (Figura 2). Sólo un subconjunto de todas las moléculas marcadas se activa en cualquier momento para determinar sus posiciones de una manera secuencial, de forma independiente de Tque suman concentración de moléculas marcadas en la muestra 2. La precisión de localización por molécula depende principalmente del tamaño de la Función Point Spread fluorescente (PSF), el número de fotones recogidos, y la señal de fondo 3. Muchas aplicaciones de este método se centran en la mejora de la visualización de las estructuras celulares. La realización que Palm se puede combinar con una sola molécula de seguimiento de 4 abierto nuevas vías para seguir directamente el movimiento de un número arbitrario de proteínas marcadas en las células vivas. Aumento de la sensibilidad y la resolución temporal de los microscopios de fluorescencia ahora permiten el seguimiento de las proteínas fluorescentes difunden individuales en el citoplasma bacteriano 5.
Aquí, utilizamos PAmCherry, una proteína fluorescente ingeniería que convierte irreversiblemente desde un estado inicial no fluorescente a un estado fluorescente tras la irradiación con 405 nm de luz 6. Fluoróforos PAmCherry activados pueden ser imagend por excitación a 561 nm y un seguimiento durante varias tramas hasta photobleaching. Se demuestra la capacidad del método para identificar eventos de unión al ADN transitorias de proteínas individuales utilizando una fusión de Pol1 y PAmCherry. El tratamiento de células con metil metanosulfonato (MMS) causa daño metilación del ADN que se convirtió en sustratos de ADN con huecos por las enzimas de reparación de base-escisión. Nuestro método muestra la unión de moléculas individuales POL1 claro en respuesta al daño MMS 7.
Discutimos varias consideraciones clave para el éxito del experimento.
La elección y la expresión de la proteína de fusión de fluorescencia: Hay una gran gama de colores de las proteínas fluorescentes fotoactivables y photoswitchable 17. La elección concreta depende de las características de microscopio, en particular los láseres y filtros disponibles. La combinación de 405 nm y 561 nm es ideal para las proteínas fluorescentes fotoactivables comunes. Elegimos PAmCherry 6 porque es monomérica y no mostró la agregación de las células. Además, la fotoactivación irreversibles permite contar el número de fluoróforos activados para medir el número de copias de proteína por célula. En lugar de expresar la proteína de fusión a partir de un plásmido, se prefiere la inserción cromosómica del gen que codifica para la proteína de fusión en el locus de tipo salvaje. Esto asegura la sustitución completa de la proteína de interés con el fluorescente versión y mantener el nivel de expresión de tipo salvaje.
Tasa Fotoactivación: Es importante ajustar la tasa de fotoactivación de tal manera que, en promedio, menos de una molécula por célula se encuentra en el estado fluorescente en cualquier fotograma de la película. Esto depende de la intensidad de 405 nm y el número de moléculas de izquierda a ser activado. A densidades muy bajas de imagen, sin embargo, no todas las moléculas serán fotografiadas antes del final de la película o películas muy largas tienen que ser adquiridos. El número de fotogramas grabados por película depende del número de copias de proteínas de fusión por célula y la media photobleaching curso de la vida de PAmCherry en las condiciones de excitación utilizadas. El número de copias de Pol1 es ~ 400 moléculas / célula 1 y el valor medio de la distribución de tiempo de vida fotoblanqueo exponencial fue ~ 4 marcos. Mediante el aumento de la intensidad 405 nm gradualmente, la activación se distribuye uniformemente sobre las 10.000 tramas de la película. Por lo tanto, cada celda es occupied por moléculas fluorescentes para un total de ~ 1600 marcos, asegurando poco solapamiento de PSF y complicaciones de seguimiento en una película de 10.000 marcos.
Tiempo de exposición y de excitación intensidades: Ante todo, los tiempos de exposición deben ser lo suficientemente corto para observar PSFs nítidas con poco movimiento borrosa. Sin embargo, se debe elegir la velocidad de fotogramas para producir el movimiento molecular observable entre cuadros sucesivos más allá de la incertidumbre de localización, de lo contrario los fotones cruciales se desperdician por sobremuestreo de la pista. El movimiento de las moléculas no unidas deben tomarse muestras a intervalos de tiempo suficientemente largo para ser claramente distinguible del movimiento aparente de moléculas unidas debido a la incertidumbre en la localización. Cuando se ajusta el tiempo de exposición, la intensidad PSF se debe ajustar. La precisión de la localización de un PSF aumenta con el número de fotones detectados durante la duración de una trama. Intensidades de excitación más altos aumentan los bu tasa por emisión de fotónt también la tasa fotoblanqueo y la señal de fondo. Utilice la intensidad de excitación más bajo que le da la precisión de localización deseada. Para Pol1-PAmCherry elegimos 15,26 ms / frame y 3,5 mW 561 nm de excitación (400 W / cm 2). Es importante para confirmar la viabilidad celular de las condiciones de formación de imágenes particulares mediante el control de crecimiento celular y la morfología antes y después de la adquisición de datos (ver Información Suplementaria en Uphoff et al. 7).
Pol1 exhibe un tiempo de unión de ~ 2 seg a un sustrato de ADN con huecos in vivo 7; por lo tanto, se espera que la mayoría de las moléculas a ser ya sea en el estado unido o no unido para toda la duración de una pista. Moléculas unidas aparecerá esencialmente inmóvil porque los sitios cromosómicos tienen un coeficiente de difusión de varios órdenes de magnitud inferior (~ 10 -5 m 2 / seg, Elmore et al. 18) de Pol1 difusión en el citoplasma (~ 1 m 2 </sarriba> / seg).
Análisis Difusión: El coeficiente de difusión aparente D * se calcula a partir del MSD de pistas individuales, como promedio durante un mínimo de 4 pasos (5 fotogramas) para reducir el error estadístico. Tenga en cuenta que ~ 75% de las moléculas de blanquear en menos de 5 cuadros para las condiciones de formación de imágenes descritos. Tales pistas cortas no proporcionan suficiente certeza estadística de distinguir moléculas dependientes e independientes. Sin embargo, las fracciones relativas de las moléculas dependientes e independientes que informan sobre la actividad de la proteína son independientes del número total de temas analizados.
Es útil para tener en cuenta el error de localización fibras discontinuas de poliéster (loc σ) en el cálculo de D *, porque la incertidumbre añade un paso aleatorio evidente para cada localización de una molécula de 15.
Para mejorar la clasificación de moléculas enlazadas y se difunden, se recomienda calcular D * both partir de los desplazamientos de un solo paso y los desplazamientos más el tiempo de dos tramas. A continuación, es posible establecer dos umbrales separados D *: D * (15 ms) <0,15 m 2 / s, y D * (30 ms) <0,075 m 2 / s.
Tenga en cuenta que D * es un coeficiente de difusión aparente que se ve afectada por el confinamiento celular de las pistas y el movimiento de desenfoque debido a la difusión durante el tiempo de exposición. Para extraer precisos coeficientes de difusión imparciales, que ha demostrado ser útil para comparar el movimiento observado a los datos simulados en función de un modelo estocástico browniano movimiento 5,7. Simulación de datos también pueden ser utilizados para probar los procedimientos de análisis de datos.
Las aplicaciones potenciales de este método: Se describen un enfoque general para la visualización y la cuantificación de las interacciones proteína-DNA in vivo por el cambio en la movilidad de una proteína tras la unión al cromosoma. Las actividades de ADN-oProteínas de unión de ARN-implicadas en la reparación, la replicación, la transcripción, y el mantenimiento de cromosomas por lo tanto pueden ser seguidos en tiempo real a nivel de una sola célula con una resolución espacial por debajo del límite de difracción óptica. Fotoactivado seguimiento de una sola molécula se extiende métodos de seguimiento convencionales que están restringidos a unas pocas moléculas marcadas por célula. Un método alternativo que mide la difusión molecular in vivo es la fluorescencia de recuperación después de photobleaching (FRAP). Mientras FRAP es muy útil para medir las características globales de difusión en células grandes, que se limita en su capacidad para resolver varias especies moleculares con diferentes movilidades en un entorno espacialmente heterogénea, especialmente para las pequeñas células bacterianas.
Hemos aplicado fotoactivado sola molécula de seguimiento para medir las actividades de unión al ADN y localizaciones subcelulares de una gama de diferentes proteínas en E. coli incluyendo Pol1, ADN ligasa, proteína Fis, DNApolimerasa III 7, así como el mantenimiento estructural de proteínas Cromosomas MukB, E, y F 19. Anticipamos que el método también se puede adaptar a otros tipos de células.
The authors have nothing to disclose.
Reconocemos Justin Pinkney y Johannes Hohlbein para ayudar con la construcción del microscopio a medida y Seamus Holden para la localización de software. Rodrigo Reyes-Lamothe se dio las gracias por proporcionar el E. coli cepa. La investigación fue financiada por el Séptimo Programa Marco Europeo Comisión del Programa Beca FP7/2007-2013 SALUD-F4-2008 a 201.418, Reino Unido Biotecnología y Ciencias Biológicas de Investigación Beca BB/H01795X/1, y el Consejo Europeo de Investigación Beca 261.227 a ANK. DJS fue financiado por una subvención WT083469 Programa de Wellcome Trust. SU fue apoyado por una beca de doctorado MathWorks.
E.coli strain carrying a chromosomal insertion for a PAmCherry DNA-binding fusion protein | created by Lambda-Red recombination | ||
MEM amino acids | Invitrogen | 11130-051 | minimal medium supplement |
MEM vitamins | Invitrogen | 11120-052 | minimal medium supplement |
Agarose | BioRad | 161-3100 | certified molecular biology grade |
Microscope coverslips No 1.5 thickness | Menzel | BB024060SC | remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1h |
Methyl methanesulfonate (MMS) | Sigma-Aldrich | 129925 | CAUTION: toxic |
PALM setup | home-built | described in Uphoff et al. 2013 | |
MATLAB | MathWorks | for data analysis and visualization | |
Localization software | custom-written, available online | http://www.physics.ox.ac.uk/Users/kapanidis/Group/Main.Software.html | MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. Cite Holden et al. 2010 if used in publication. |
Tracking software | available online | http://physics.georgetown.edu/matlab/ | MATLAB implementation by Blair and Dufresne. Cite Crocker & Grier 1996 if used in publication. |