Photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM) kombinerat med enda molekyl spårning möjliggör direkt observation och kvantifiering av protein-DNA interaktioner i levande Escherichia coli-celler.
Protein-DNA-interaktioner är i centrum för många fundamentala cellulära processer. Till exempel är DNA-replikation, transkription, reparation och kromosomorganisation styrs av DNA-bindande proteiner som känner igen specifika DNA-strukturer eller sekvenser. In vitro-försök har bidragit till att skapa detaljerade modeller för funktionen av många typer av DNA-bindande proteiner, men ändå , de exakta mekanismerna i dessa processer och sin organisation i den komplexa miljö i den levande cellen förblir mycket mindre förstås. Vi introducerade nyligen en metod för att kvantifiera DNA-reparationsverksamhet i levande Escherichia coli-celler med hjälp av fotoaktiverad Lokalisering Mikroskopi (PALM) kombinerat med enda molekyl spårning. Vår allmänna inställning identifierar enskilda DNA-bindande arrangemang av förändringen av rörligheten för ett enda protein på association med kromosomen. Fraktionen av bundna molekyler ger en direkt kvantitativt mått för proteinet ageraivity och förekomst av substrat eller bindningsställen vid encelliga nivå. Här beskriver vi konceptet av metoden och demonstrera provberedning, datainsamling, och förfaranden för dataanalys.
Detta protokoll beskriver en direkt mätning av protein-DNA-interaktioner i levande Escherichia coli-celler. Tekniken utnyttjar förändring av diffusionskoefficienten för ett enda fluorescensmärkt protein såsom det binder kromosomen (fig 1). För att demonstrera den metod vi använder DNA-polymeras I (Pol1), en prototypisk DNA-bindande protein som fyller DNA-luckor i eftersläpande sträng replikering och excision reparationsvägar 1.
Tillkomsten av super-upplösning fluorescensmikroskopi möjliggör visualisering av molekylära strukturer i celler med nanometerupplösning. Photoactivated Localization Mikroskopi (PALM) använder fluorescerande proteiner som kan aktiveras från ett initialt mörkt tillstånd till ett fluorescerande tillstånd (Figur 2). Endast en del av alla märkta molekyler aktiveras när som helst för att bestämma sina positioner på ett sekventiellt sätt, oberoende av than total koncentration av märkta molekyler i provet 2. Lokaliseringen precision per molekyl beror huvudsakligen på storleken av det fluorescerande punktspridningsfunktion (PSF), antal insamlade fotoner, och bakgrundssignalen 3. Många tillämpningar av denna metod fokuserar på förbättrad visualisering av cellstrukturer. Insikten att PALM kan kombineras med enda molekyl spårning 4 öppnat nya vägar för att direkt följa rörelsen av godtyckliga antal märkta proteiner i levande celler. Ökad känslighet och tidsmässig upplösning av fluorescens mikroskop tillåter nu spårning av enstaka diffuse fluorescerande proteiner i bakterie cytoplasman 5.
Här använder vi PAmCherry, ett manipulerat fluorescerande protein som oåterkalleligt konverterar från ett initialt icke-fluorescerande tillstånd till ett fluorescerande tillstånd vid bestrålning med 405 nm ljus 6. Aktiverat PAmCherry fluoroforer kan vara bildd genom excitation vid 561 nm och spåras i flera ramar till fotoblekning. Vi visar förmågan av metoden för att identifiera övergående DNA-bindande arrangemang av enstaka proteiner med hjälp av en fusion av Pol1 och PAmCherry. Behandling av celler med metylmetansulfonat (MMS) orsakar DNA-metylering skada som förvandlas till gapped DNA-substrat från bas-excision reparation enzymer. Vår metod visar tydlig bindning av enskilda Pol1 molekyler som svar på MMS skada 7.
Vi diskuterar flera viktiga faktorer för att lyckas med experimentet.
Val och uttryck av den fluorescerande fusionsprotein: Det finns en stor palett av fotoaktiverbara och photoswitchable fluorescerande proteiner 17. Det specifika valet beror på egenskaperna mikroskop, särskilt laser och filter tillgängliga. Kombinationen av 405 nm och 561 nm är idealisk för vanliga fotoaktiverbara fluorescerande proteiner. Vi valde PAmCherry 6 eftersom den är monomera och visade ingen aggregation i cellerna. Vidare tillåter irreversibla fotoaktivering räkna antalet aktiverade fluoroforer för att mäta protein kopietal per cell. I stället för att uttrycka fusionsproteinet från en plasmid, vi föredrar kromosomal infogning av genen som kodar för fusionsproteinet på vildtyp-lokuset. Detta garanterar fullständig ersättning av proteinet av intresse med den fluorescerande version och upprätthållande av vildtyp expressionsnivån.
Fotoaktivering kurs: Det är viktigt att justera fotoaktivering hastighet så att mindre än en molekyl per cell i genomsnitt är i fluorescerande tillstånd i varje bildruta i filmen. Detta beror på 405 nm intensitet och antalet molekyler kvar för att aktiveras. Vid mycket låga avbildnings tätheter, dock inte alla molekyler kommer att avbildas före slutet av filmen eller mycket långa filmer måste förvärvas. Antalet bilder som spelas in per filmen beror på antalet kopior av fusionsproteiner per cell och den genomsnittliga fotoblekning livstid PAmCherry vid exciteringsbetingelserna. Kopietalet av Pol1 är ~ 400 molekyler / cell 1 och medelvärdet av den exponentiella fotoblekning livstid fördelningen var ~ 4 ramar. Genom att öka 405 nm intensiteten gradvis, är aktiveringen jämnt fördelade över 10.000 bildrutor i filmen. Därför är varje cell Occupied av fluorescerande molekyler för totalt ~ 1.600 ramar, säkerställa liten överlappning av vävda och spårning komplikationer i en film på 10.000 ramar.
Exponeringstid och excitation intensiteter: Främst, exponeringstider måste vara tillräckligt kort för att observera skarpa PSFS med lite rörelseoskärpa. Emellertid bör ramhastigheten väljas att ge observerbara molekylär rörelse mellan successiva ramar bortom lokalisering osäkerhet, annars avgörande fotoner spillo genom översampling spåret. Rörelsen av obundna molekyler måste samplas med tillräckligt långa tidsintervall som tydligt skiljer sig från den skenbara rörelse bundna molekyler på grund av lokaliseringsosäkerhet. När exponeringstiden är inställd, skall PSF intensitet justeras. Lokaliseringen precisionen hos en PSF ökar med antalet fotoner som detekteras över varaktigheten av en ram. Högre exciteringsintensitet ökar fotonemission ränta but även fotoblekning hastighet och bakgrundssignalen. Använd lägsta exciteringsintensitet som ger önskad lokalisering precision. För Pol1-PAmCherry valde vi 15,26 ms / ram och 3,5 mW 561 nm excitation (400 W / cm 2). Det är viktigt att bekräfta cellviabiliteten för de speciella avbildningsförhållanden genom att övervaka celltillväxt och morfologi före och efter datainsamling (se kompletterande information i Uphoff et al. 7).
Pol1 uppvisar en bindande tid för ~ 2 sek till ett gap DNA-substrat in vivo 7 och därför förväntar vi oss de flesta molekyler som antingen i bunden eller obunden tillstånd för hela den tid som ett spår. Bundna molekyler uppträder i huvudsak orörliga eftersom kromosom webbplatser har en diffusionskoefficient flera tiopotenser lägre (~ 10 -5 ìm 2 / sek, Elmore et al. 18) än Pol1 diffusion i cytoplasman (~ 1 mm 2 </supp> / sek).
Diffusion Analys: Den skenbara diffusionskoefficienten D * beräknas från MSD för enskilda spår, medelvärde över minst 4 steg (5 ramar) för att minska den statistiska fel. Observera att ~ 75% av molekylerna blekmedel inom mindre än fem bildrutor för avbildnings förhållanden som beskrivs. Sådana korta spår ger inte tillräcklig statistisk säkerhet att skilja bundna och obundna molekyler. Emellertid är de relativa fraktionerna av bundna och obundna molekyler som rapporterar på proteinaktivitet är oberoende av det totala antalet spår som analyserats.
Det är lämpligt att ta hänsyn till PSF lokaliseringsfelet (σ loc) vid beräkningen av D * på grund av att osäkerheten adderar en skenbar slump steg till varje lokalisering av en molekyl 15.
För att förbättra klassificeringen av bundna och sprida molekyler, rekommenderar vi att beräkna D * both från enkelstegs förskjutningar och förskjutningarna över tiden för två ramar. Det är då möjligt att ställa in två separata D * trösklar: D * (15 ms) <0,15 ìm 2 / sek och D * (30 ms) <0,075 ìm 2 / sek.
Observera att D * är en skenbar diffusionskoefficient som påverkas av cell inneslutning av spåren och för rörelseoskärpa grund av diffusion under exponeringstiden. För att extrahera exakta objektiva diffusionskoefficienter, har det visat sig vara användbart för att jämföra den observerade rörelsen till simulerade data baserat på en stokastisk Brownsk rörelse modell 5,7. Simulerade data kan också användas för att testa rutiner dataanalys.
Potentiella tillämpningar av denna metod: Vi beskrev en allmän strategi för att visualisera och kvantifiera protein-DNA-interaktioner in vivo genom att förändringen i mobilitet för ett protein vid bindning till kromosomen. Verksamheten i DNA-ellerRNA-bindande proteiner som är inblandade i reparation, replikation, transkription, och kromosom underhåll kan således följas i realtid vid encelliga nivå med en rumsupplösning under den optiska diffraktionsgränsen. Photoactivated enda molekyl spårning förlänger konventionella spårningsmetoder som är begränsade till ett fåtal märkta molekyler per cell. En alternativ metod som mäter molekylär diffusion in vivo är Fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP). Medan FRAP är mycket användbar för att mäta globala spridningsegenskaper i stora celler, är den begränsad i sin förmåga att lösa flera molekylslag med olika rörligheter i ett rumsligt heterogen miljö, särskilt för små bakterieceller.
Vi har tillämpat photoactivated enda molekyl spårning för att mäta DNA-bindande aktiviteter och subcellulära lokaliseringar av en rad olika proteiner i E. coli inklusive Pol1, DNA-ligas, Fis-protein, DNA-polymeras III 7, samt struktur Underhåll av kromosomer proteiner MukB, E, och F 19. Vi räknar med att metoden kan även anpassas till andra celltyper.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner Justin Pinkney och Johannes Hohlbein för hjälp med konstruktionen av den beställda mikroskop och Seamus Holden för lokalisering programvara. Rodrigo Reyes-Lamothe är tackade för att tillhandahålla E. coli-stam. Forskningen har finansierats av Europeiska kommissionen sjunde ramprogram Grant FP7/2007-2013 HEALTH-F4-2008 till 201.418, Storbritannien bioteknik och Biological Sciences Research Council Grant BB/H01795X/1, och det europeiska forskningsrådet Grant 261.227 till ANK. DJS betalades av en Wellcome Trust Program Grant WT083469. SU fick stöd av ett MathWorks doktorandtjänst.
E.coli strain carrying a chromosomal insertion for a PAmCherry DNA-binding fusion protein | created by Lambda-Red recombination | ||
MEM amino acids | Invitrogen | 11130-051 | minimal medium supplement |
MEM vitamins | Invitrogen | 11120-052 | minimal medium supplement |
Agarose | BioRad | 161-3100 | certified molecular biology grade |
Microscope coverslips No 1.5 thickness | Menzel | BB024060SC | remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1h |
Methyl methanesulfonate (MMS) | Sigma-Aldrich | 129925 | CAUTION: toxic |
PALM setup | home-built | described in Uphoff et al. 2013 | |
MATLAB | MathWorks | for data analysis and visualization | |
Localization software | custom-written, available online | http://www.physics.ox.ac.uk/Users/kapanidis/Group/Main.Software.html | MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. Cite Holden et al. 2010 if used in publication. |
Tracking software | available online | http://physics.georgetown.edu/matlab/ | MATLAB implementation by Blair and Dufresne. Cite Crocker & Grier 1996 if used in publication. |