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Summary
DNabT細胞は、末梢T細胞の中で稀であり;しかし、彼らは、特定の非リンパ組織に豊富に存在する。非リンパ組織からDN T細胞を単離することの難しさを認識病態生理学的有意性を増加させるにもかかわらず、それらの機能解析を妨げる。我々は、マウスの腎臓からの高度に精製されたDN T細胞の単離のための新規なプロトコルを記載している。
Abstract
非リンパ組織から、DN T細胞を単離するための標準的なプロトコルは、さまざまな免疫応答でのますます報告された関与にもかかわらず、現在ありません。 DN T細胞はallotransplants 1-6に免疫および自己免疫応答と寛容の調節に関与しているユニークな免疫細胞型である。 DN T細胞は、しかしながら、末梢血および二次リンパ器官（脾臓およびリンパ節）において稀であるが、正常な腎臓の主要な居住者である。非常に少ない起因周辺での不足への病態生理学的機能7についてはほとんど知られていない。我々は最近、定常状態でおよび虚血再灌流障害時に腎臓8でこの集団の包括的表現型および機能解析を説明した。 DN T細胞機能の分析が大幅に腎臓からのそれらの単離のためのプロトコルを開発することによって強化される。
ここでは、isolatioを可能にする新たなプロトコルを記述マウス腎臓由来の高純度AB CD4 + CD8 + T細胞およびDN T細胞のnである。手短に言えば、我々は、コラゲナーゼを用いて腎組織を消化し、密度勾配によって腎臓単核細胞（KMNC）を単離する。これはKMNCから3％〜70％の造血T細胞を濃縮するために二つのステップが続く。最初のステップは、CD45 +単離キットを使用して、造血細胞の正の選択で構成されています。第二段階において、DN T細胞は負にCD4、CD8、およびMHCクラスIIモノクローナル抗体およびCD1dのα-GalCer類似四量体を用いた非所望の細胞の除去によって単離される。この戦略は、90％以上純粋なDN T細胞の集団をもたらす。 FACS分析に続いて、上述した抗体による表面染色は、純度を確認するために使用される。
Introduction
周辺αβTCR+ CD3 + CD4 - CD8 -ダ ブルネガティブ（DN）T細胞は、明確な表現型を有し、1〜4機能の様々な部分集合に分割される。 DN T細胞は、あまり理解されていますが、ますます異なる疾患モデル4-6の病態生理学的な免疫応答に関与している。
DN T細胞は、ますます様々な免疫および自己免疫応答の調節および同種移植寛容の調節に関与しているユニークな免疫細胞型である。4-6、9彼らは、末梢血および二次リンパ器官（脾臓及びリンパ節ではまれである）。しかし、彼らは正常な腎臓や腸上皮10月12日の主な居住者である。非常に少ないが、定常状態で、そのような腎臓transplに関連した急性腎障害（AKI）のような病理学的条件の下で、腎臓における機能7についてはほとんど知られていないANT。
なぜならalloresponsesを含む免疫応答を調節する上で様々な免疫細胞の複雑な役割のため、各プレイヤーの役割を定義するalloresponsesを理解し、新しい治療法を設計する上で非常に重要です。生理学的および異なる疾患状態の下で腎臓中に存在するDN T細胞の有意な数が指定され、DN T細胞は、移植レシピエントにおける免疫および自己免疫マウスおよびヒトにおける応答、およびalloresponsesの調節に重要な役割を果たしている可能性が高い。まだ散乱証拠かかわら蓄積すると、両方の病原性および免疫抑制機能のDN T細胞を関与しかし、なぜ、どのように特定の有害または抑制機能を発揮し、環境がそれらにどのように影響するかは十分に理解されていない。
により腎臓での少量に、分離する改良された方法が必要である。
Tから、DN T細胞を単離するための標準プロトコルが現在ありません彼は、非リンパ組織。我々のプロトコルは、腎臓からDN T細胞の単離のための新規な方法を記載している;しかしながら、この方法はまた、種々の非リンパ系組織のために使用することができる。
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Protocol
1。楽器の調製、培養培地および試薬
- 楽器：無菌条件下で試薬を準備し、層流フードの下で使用しています。
- ウシ胎児血清5％、炭酸水素塩2.1gを10mlのグルタミン酸、100倍、HEPESを10mg、1mgのピルビン酸ナトリウム及び10mlの100倍のペニシリン/ストレプトマイシンを追加し、RPMI組織培地を1リットル調製する。
注：推奨される組織培養培地、RPMIは、DMEMと交換可能である。 - 5％のコラゲナーゼ "D"溶液（組織培養培地9mlにコラゲナーゼ5mlの「D」）を調製する。
- 三つの異なる濃度でのパーコール溶液を作る：100％、80％および40％であった。以下の濃度を、1サンプルについて計算される。室温でのソリューションにしてください。
- パーコール液（原液から）希釈されていないパーコールの9ミリリットルを追加します。 PBSを10倍の1ミリリットルを加える。
- パーコール液：パーコール100パーセントの8ミリリットルを追加します。 PBS 1Xの2ミリリットルを追加します。
- パーコール液：パーコール80パーセントの4ミリリットルを追加します。 PBS 1Xの4ミリリットルを追加。
- （FACS）のバッファを蛍光活性化細胞選別の1リットルを作る。 5ミリリットルの10％BSA（0.1％BSA）1mlの10％アジ化ナトリウム（0.1％）2mlのEDTA剤は、1×PBSで1000 mlに構成し、追加する。
腎臓消化の2。準備
- 必要な制度の承認を取得した、犠牲と放血マウスを標準的な方法で、現在の規制や動物のケアのガイドラインに従うこと。
- ペントバルビタール（0.07 mg / kg）をして、マウスを麻酔。
- 放血に進みます。
- 手術台上の仰臥位でマウスを置きます。
- 70％エタノールで腹部をスプレーしてください。
- ペトリ皿にコラゲナーゼD溶液10mlを加える。
- 各マウスから両方の腎臓を削除し、カプセル化解除。
- 胸骨からに腹部の皮膚および腹膜を通して正中切開を行うことによってabdomimal空洞を開く恥骨。
- 側に横方向に腸に移動することにより、左の腎臓を公開します。
- 慎重にピンセットで左のカプセルを分離する。
注：カプセルは腎臓の周囲の透明層として表示され、部分的に腎周囲脂肪組織でカバー。 - 外科はさみを使用して椎弓血管を切断することにより、左の腎臓を削除します。
- 右腎に対して同じ手順を繰り返します。
注：右腎より頭蓋正中（小花柄が短い）に近い。
- ペトリ皿に腎臓を置きます。
- 定期的な金属成形ブレードを用いて小片に腎組織（寸法1〜2 mm）をカットします（ 図1）37℃のインキュベーター内で30〜45分間コラゲナーゼ溶液にピースを置きます。
腎臓消化から腎臓単核細胞（KMNC）の3。準備
- 腎臓の細胞懸濁液を得機械的に組織培養培地25ml中にストレーナ（70ミクロン）を用いて再懸濁し、混合組織を破壊することによる消化。
- 細胞懸濁液をペレット化し、4℃で10分間、400×gで遠心する。
- 非常にゆっくりと慎重に、40％パーコール溶液4mlでペレットを再懸濁し、穏やかに転送プラスチックピペットを用いて80％のパーコール溶液4mlに重ねる。これは明らかに、半透明の層によって分離された2つの相をもたらすであろう。一番上の脂質に対応する黄色の層となる。
- ブレーキオフモードで遠心分離して、室温で30分間、1,500×gで遠心分離する。
- 吸引によって、黄色、厚いトップ層（約1〜2 ml）を外します。
- トランスファーピペットで2相の界面からのわずかな白っぽい半透明の層を収集します。非常に慎重に組織培養培地2mlを含有する15ミリリットルの円錐管を減らすこの懸濁液を転送し、その後の全量を13mlの培地を加える15ミリリットル。
- 4℃で10分間400×gで遠心分離
- 培地の1ミリリットルのサンプルを懸濁します。
- 血球計数器でパンブルー排除を用いてKMNCの数をカウントし、腎臓あたりのml当たりKMNCの数字として結果を表現しています。
- 上記のように一度洗う。
造血の4。分離KMNCから（CD45 +）細胞（ステップI）
- ランニング緩衝液90μlの中に10 7に細胞を再懸濁します。
- CD45マイクロビーズを10μlを加え、4℃で15分間インキュベート
- 反応を停止させ、ランニングバッファーの1ミリリットルを追加します。ランニング緩衝液500μlに4℃の再懸濁で10分間400×gで遠心します。
- 磁石で配置することで、磁気カラムを準備し、ランニング緩衝液3mlで洗い流してください。
- 磁気カラムを通して細胞懸濁液をパスし、カラムを通過する非標識細胞を収集します。
- runnの3ミリリットルで細胞を3回洗浄するバッファをING。その後、流出物を収集します。
- セパレータとピペットカラムにランニング緩衝液の5ミリリットルから列を削除し、すぐにラベルされた分を洗い流す。この画分は、CD45 +細胞が含まれています。細胞を数える。
- 腎臓への異なるT細胞サブセットの絶対数を計算するには、フローサイトメトリーによって決定さ陽性細胞の割合（ 図2）によってKMNCの総数を乗算する。
ネガティブ選択によりCD45陽性の準備から、DN T細胞の5。アイソレーション（工程II）
- 以下のビオチン化抗体の各々2.5μlの（0.5 mg / mlの、1.25μgの）追加：抗CD4、抗CD8、抗Fc受容体（CD16/32）を、抗MHCクラスII（IA b）は、抗すべての10 7造血細胞のためのCD1d PBS-57四量体。
- 低温室で30分間細胞をインキュベートします。
- 1ミリリットル抗ビオチンマイクロビーズを追加します。
- 低温室で30分間インキュベートします。
- Tチューブを配置彼は、磁石と枯渇に進みます。
- 血球計数器を用いて陰性画分中のDN T細胞の総数を決定するために、生存細胞を数える。
- 第一ゲートのCD45 +、第2ゲートTCRαβ+：このゲーティング戦略に従うことによって、フローサイトメトリーで、DN T細胞の純度を確認してください。 CD1dの+細胞を除外します。 DN T細胞（ 図3）を識別するためのプロットCD8 +対CD4 +。
- 純度で決まる割合で合計数を掛けます。
注：90％以上純粋なDN T細胞の集団におけるこのプロトコルの結果を用いて。
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Representative Results
野生型C57BL / 6（B6）腎臓は、腎臓あたり約1.5から2.1×10 6の単核細胞が含まれています。約10％未満は、造血CD45 +細胞である。 5％のコラゲナーゼを用いて消化し 、続いて、図1に示すように、腎臓単核細胞（KMNC）の調製のために、腎臓を小片に切断する。
これはKMNC層（図2、左パネル）を収集する密度勾配遠心分離を行うことが続く。 KMNCは、セクション4（ステップI）で説明したように、CD45 +磁気マイクロビーズを使用して正の選択を行った。カラムに結合した細胞を、次いで、FACSによって溶出し、CD45 +について分析した。フローサイトメトリー（図2、中パネル）により分析し、これは、約80から95までパーセントのCD45 +細胞の濃縮をもたらす。濃縮された造血CD45 +細胞のう ち、約40〜60％がTCRαβ+（データ示さず）、約3であった0から60までパーセントは、DN T細胞（図2、右パネル）であった。
CD4 +、CD8 +、MHCクラスII +とビオチン特異的mAbと抗ビオチンマイクロビーズと磁気カラムを使用してCD16/32 +細胞を標識し、削除するには、負の選択に濃縮CD45 +細胞を施す関与最後のステップ。高度に精製された（90から95%）DN T細胞（ 図3）でこの結果。このプロトコルに続いて、それは0.5×10 6造血CD45 +マウス当たり磁気標識細胞（2腎臓）まで得ることができた。
図1、図5％コラゲナーゼ溶液での消化のために腎臓の調製マウス腎臓1〜2程度の小片に切断し、掘るための30分間のコラゲナーゼD 5％溶液中に配置されているestion。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
。腎臓からのCD45 +造血細胞の濃縮については、図2の戦略左：陽性選択によりCD45 +キットを使用して濃縮する前に、腎臓MNCのCD45染色センター ：陽性選択によりCD45 +キットを使用して濃縮した後、腎臓MNCのCD45染色右 。：ゲート付きのCD45 +細胞のT細胞の異なるサブセット間でαβTCR+細胞、CD4＆CD8プロファイルが。 このFiのの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。グレ。
単離されたDN T細胞の図3純度左：ネガティブ選択により孤立腎臓DN T細胞のCD45染色センター ：ネガティブ選択により孤立腎臓DN T細胞のTCRαβ染色右 ：孤立したDN T細胞の中で、CD4＆CD8染色による負の選択。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図4。リンパ精製前の腎臓で。
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Discussion
彼らはそのような自己免疫疾患、癌、移植性、および急性腎障害（AKI）を含む腎臓の原疾患、糸球体腎炎8、13の異なる病態に関与していることから、DN T細胞中の関心が高まっている。したがって、より良好なDN T細胞の病態生理学的機能を理解し、特徴付ける必要がある。しかしながら、現在CD4およびCD8 T細胞と比較して、これらの細胞の機能を理解する上で不足している。主な理由は、二次リンパ器官におけるDN T細胞の不足ひいてはインビトロ分析および養子移入実験のために十分な細胞を得ることが困難である。 DN T細胞は、主に腎臓8などの非リンパ組織に配置されていますが、固形臓器からのそれらの単離のための信頼できる方法がないことは、その機能を調べるための努力を妨げている。したがって、DN T細胞を単離するための我々の新規プロトコル腎臓からのDNはT細胞の機能の研究を促進することが期待される。 DN T細胞は、Fas欠損（lprコマンド）またはFasLの欠損（GLD）マウスにおいて大量にリンパ節に蓄積し、それらは容易にリンパ器官9、14、15から単離することができるが、それでも互いから、これらの細胞を単離する課題のままで組織。
このプロトコルによると、2匹のマウスからの腎臓は、約0.5×10 6造血細胞（CD45 +）と約0.2×10 6 DN T細胞を生成する。この数は、インビトロ培養、機能アッセイおよび/ またはFACS分析で行うのに十分である。 DN T細胞集団の純度はフローサイトメトリーにより確認されなければならない。このプロトコルは、98パーセントほどの純度であることができ、DN T細胞の集団を提供する。このプロトコルは、腎臓からDN T細胞の単離のために設計されているが、このような他の非リンパ系器官からT細胞を単離するために修飾することができる心臓のような、甲状腺など
DN T細胞小集団を表しているので、精製のさらなるラウンドを行うことにより、収率を増加させることが必要な場合がある。しかしながらDN T細胞のより高い数は（より高い0.5×10 6細胞）を必要とする場合、我々は、時間及び試薬コストを低減するために選別分離を行うことをお勧めします。
要するに、このプロトコルは、腎臓からDN T細胞を単離するための新規な方法を記載する。これは、正の選択した後、非所望の細胞集団の枯渇のための負の選択に続いて、工程（消化とKMNCの濃縮を経て）準備で構成されている。従って、単離プロセス中にDN T細胞の最小限の直接操作があった。これは、マウスおよびヒトの末梢血から、従来のT細胞の単離のために使用されるものと同様の二次リンパ器官からDN T細胞の単離のための既存のプロトコルが存在することは注目に値する。
ove_content ">それはいくつかのDN T細胞はのFcR-γを発現することが示されているため、代替オプションはカクテル16、17にCD16/32 +を含めることはありません。、DN T細胞の成功分離は細部に大きな注意が必要です。特に重要な手順は次のとおり組織消化、小片に腎組織の切断、および正しく識別し、密度勾配における光層を回収し全体的に、実際に、いくつかの手先の器用さが数回、所望の結果を達成するために必要とされる。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、NIHのPBS（R 21 AI095484）によってサポートされています。私たちは、CD1dの四量体のために薬価四量体中核施設に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminar flow hood | Baker Company, Inc | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Atmosphere-controlled incubator | Fisher Scientific | (37 °C with 5% CO2) | |
| Analytical flow cytometer | LSR II | ||
| RPMI 1640 | Media Tech | 10-040-CV | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Fetal bovine serum | Corning Cellgro | 35-011-CV | |
| 0.1% sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Buffer phosphate buffered saline (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| PBS 10x | Mediatech | 46-013-CM | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | E1161 | |
| LS columns | MiltenyiBiotec | 130-042-401 | |
| CD45+ microbeads | MiltenyiBiotec | 6.78E-51 | |
| Biotin microbeads | MiltenyiBiotec | 130-090-485 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) PerCP | eBioscience | G1397 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) APC-Cy7 | Biolegend | 103116 | |
| anti-TCR Pacific Blue (ab-chain, clone: H57-597) | Invitrogen | HM3628 | |
| anti-CD4 PE | eBioscience | 12-0043 | |
| anti-CD8 FITC | eBioscience | 8011-0087 | |
| anti-CD4 biotinylated (GK1.5) | BD | 553728 | |
| anti-CD8 biotinylated (clone 53-6.7) | BD | 553029 | |
| anti-MHC class II (I-A b) biotinylated | BD | 553609 | |
| AutoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer | MIlteny I Biotec | 130-091-221 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | 000664 | Kidneys - Lymph Nodes |
| Petri dish | BD Biosciences | 356517 | |
| 70 μm filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Plunger | Or equivalent equipment | ||
| GeneMate Tubes 50 ml | Bioexpress | C-3394-3 | Or equivalent equipment |
| GeneMate Tubes 15 ml | Bioexpress | C-3394-1 | Or equivalent equipment |
| CD1d α-galcer tetramer | NHI |
References
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免疫学、発行87、ダブルネガティブ（DN）αβ、T細胞、CD45 + T細胞の単離、腎リンパ球、非リンパ系組織、T細胞の浄化、虚血灌流障害、急性腎障害、ティッシュ常駐リンパ球、リンパ増殖性疾患、エリテマトーデスループスErratum
Formal Correction: Erratum: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney
Posted by JoVE Editors on 02/10/2016.
Citeable Link.
A correction was made to: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney.
There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:
Samatha Bandapelle
instead of:
Samantha Bandapelle
