Måling Effekter af bakterier på<em> C. Elegans</em> Behavior Ved hjælp af en Egg Retention Assay
Summary
Et æg-i-ormen (EIW)-analysen er en nyttig metode til at kvantificere æglægning adfærd. Ændringer i æglægning kan være en adfærdsmæssig reaktion modelorganismen<em> Caenorhabditis elegans</em> For potentielt skadelige miljømæssige stoffer som dem, der produceres med sygdomsfremkaldende bakterier.
Abstract
C. elegans æglægningen adfærd påvirkes af miljømæssige signaler såsom osmolaritet 1 og vibrationer 2. I det totale fravær af fødevarer C. elegans ophører endvidere æglægning og fastholde befrugtede æg i deres livmoder 3.. Imidlertid er effekten af forskellige kilder til fødevarer, især sygdomsfremkaldende bakterier og især Enterococcus faecalis på æglægning adfærd ikke godt karakteriseret. Ægget-i-ormen (EIW) assay er et nyttigt redskab til at kvantificere effekten af forskellige typer af bakterier, i dette tilfælde E. faecalis på æglægning adfærd.
EIW assays involverer at tælle antallet af æg opbevares i livmoderen hos C. elegans 4.. Den EIW analysen indebærer blegning iscenesat, gravide voksne C. elegans at fjerne neglebånd og adskille de tilbageholdte æg fra dyret. Forud for blegning, er orme udsat for bakterier (eller nogen form for miljømæssig cue) For en bestemt periode. Efter blegning, er en meget let i stand til at tælle antallet af æg tilbageholdt inde i livmoderen af orme. I dette assay, en kvantificerbar stigning i æg tilbageholdelse efter E. faecalis eksponering kan let måles. Den EIW assayet er en adfærdsmæssig assay, som kan anvendes til at screene for potentielt patogene bakterier eller tilstedeværelse af miljøgifte. Derudover kan EIW assayet være et redskab til at screene for lægemidler, der påvirker neurotransmitter signalering da æglægningen adfærd moduleres af neurotransmittere, såsom serotonin og acetylcholin 5-9.
Introduction
Caenorhabditis elegans, en mikroskopisk, fritlevende rundorm, er en model organisme traditionelt anvendes til at studere udviklingsmæssige og celle signaleringsprocesser grund af dens transparente anatomi, velkarakteriseret udvikling, fuldt sekventeret genomet, korte generationstid-tid, og genetisk homologi til mennesker . For nylig C. elegans er blevet en model organisme inden for miljø-toksikologi og medfødte immunitet 10, 11.
Disse selv-gødnings tvekønnede orme bliver kønsmodne inden for to til tre dage efter udrugning fra ægget. I løbet af sin livscyklus, C. elegans passerer gennem fire larvestadier (L1-L4), før de nåede voksenalderen. Man isolerede hermafrodit kan producere i gennemsnit 300 afkom inden for tre dage peak frugtbarhed. I formeringsaktive modne C. elegans hermafroditter er befrugtede æg opbevares i livmoderen i flere timer, før de lægges. Dennormal antal æg gemt i livmoderen på en gang (i højsæsonen frugtbarhed) er mellem ti og femten 12.. Antallet af æg i livmoderen, er en funktion af både hastigheden af ægproduktionen og hastigheden af æglægning. Befrugtede æg udstødes fra livmoderen ved sammentrækning af seksten vulva muskler arrangeret omkring åbningen af vulva 13.. Hermafrodit-specifikke motoriske neuroner (HSN s) og VC motoriske neuroner synapse på vulva muskler påvirker muskel sammentrækning og dermed æglægning adfærd 5,7,13,14. Udvisning af æg fra livmoderen opstår på grund af koordineret aktivitet i neuroner og muskler.
Lab kulturer af C. elegans er typisk rejst på en diæt af patogen Escherichia coli OP50. I det naturlige miljø, C. elegans kommer i kontakt med en række fødevarer kilder, såsom patogene bakterier, kan der være potentielt skadelige. Når de udsættes for skadelige stoffer imiljø, C. elegans bevarer æg indtil miljøet bliver mere gunstige. Formentlig dette æg fastholdelse er et forsøg på at beskytte deres afkom.
I dette æg i ormen (EIW) assay, C. elegans udsættes for potentielt patogene bakterier, Enterococcus faecalis, som findes i miljøet. Udsættelse for patogene former af E. faecalis kan forårsage vedvarende tarminfektioner og endda død i C. elegans 15.. Eksponering for andre former for patogene bakterier har vist sig at påvirke æg tilbageholdelse 16,17, men effekten var ikke kvantificeret. Derudover stammer virkningen af mildt patogene E. faecalis, har stammer, der ikke umiddelbart dødelig på æglægning adfærd ikke blevet undersøgt.
EIW assays involverer at tælle antallet af æg opbevares i livmoderen hos C. elegans 4.. Selvom C. eleganser gennemsigtige, kan æg ophobes i livmoderen være svært at kvantificere i en intakt dyr. Den EIW analysen indebærer blegning gravide voksne C. elegans, der blev udsat for bakterier i en bestemt periode. Blegemiddelopløsningen opløser ydre kutikula forlader æggene bag. Æggene er refraktiv til virkningerne af blegemiddel på grund af tilstedeværelsen af en beskyttende æggeskal. Efter blegning, er en meget let i stand til at tælle antallet af æg, der frigives fra livmoderen af ormene ved blegning.
Den beskrevne assay er en enkel, billig og hurtig metode til at kvantificere antallet af æg i livmoderen på én gang, og dermed kvantificere virkningerne af E. faecalis på æg tilbageholdelse. Denne analyse kan anvendes til at kvantificere effekten af andre typer af bakterier, miljømæssige toksiner eller narkotika på æg fastholdelse. Dette assay har også potentiale til at blive brugt som en skærm for bakteriel patogenicitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mest kritiske trin i vellykket udførelse dette assay, er: 1) ved hjælp velnærede lagre af C. elegans, 2) dyrkning single typer bakterier på assaypladen, 3) præcist at identificere trinvis L4 orme for eksponering E. faecalis, 4) at holde eksponeringen tid til E. faecalis konsistente på tværs af alle prøvelser og 5) blegning tid, bør ikke overstige ti minutter for at forhindre ægget disintegration.
Til dette assay er det vigtigt at vælge sunde, velnære…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke juni Middleton til forsyning E. faecalis stammer og vejledning med bakterier kultur. C. elegans blev leveret af CGC, som er finansieret af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materials
| Agar, ultrapure | Affymetrix | 10906 | |
| Bacto Peptone | Becton Dickinson | 211677 | |
| Bacto Tryptone | Becton Dickinson | 211705 | |
| Brain Heart Infusion dehydrated medium | Carolina Biological Supply | 781781 | |
| C. elegans, N2 strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
| Culture plates for C. elegans | Tritech Research Inc. | T3308 | |
| Culture plates for E. faecalis | Fisher Scientific-Fisherbrand | 875713 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| E. faecalis strains | provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci | ||
| by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth; | |||
|
all strains grew at 44.5 ºC and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars (arabinose, mannitol, methyl-α-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed presumptive identification of all E. faecalis strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux). |
|||
| Microscope | Motic | SMZ 168B | any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient |
| Streptomycin sulfate | Fisher BioReagents | BP910-50 | |
| Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco | Becton Dickinson | 236950 | |
| Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL | Becton Dickinson | 211768 | |
| Yeast extract | Acros | 61180-1000 |
References
- Horvitz, H. R., Chalfie, M., Trent, C., Sulston, J. E., Evans, P. D. Serotonin and octopamine in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 216, 1012-1014 (1982).
- Sawin, E. R. . Genetic and cellular analysis of modulated behaviors in Caenorhabditis elegans [dissertation]. , (1996).
- Trent, C. . Genetic and behavioral studies of the egg-laying system of Caenorhabditis elegans [dissertation]. , (1982).
- Chase, D. L., Koelle, M. R. Genetic analysis of RGS protein function in Caenorhabditis elegans. Methods Enzymol. 389, 305-320 (2004).
- Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 104, 619-647 (1983).
- Weinshenker, D., Garriga, G., Thomas, J. H. Genetic and pharmacological analysis of neurotransmitters controlling egg laying in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 15, 6975-6985 (1995).
- Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans. Neuron. 21, 203-214 (1998).
- Bany, A., Dong, M., Koelle, M. R. Genetic and cellular basis for acetylcholine inhibition of Caenorhabditis elegans egg-laying behavior. J. Neurosci. 23, 8060-8069 (2003).
- Dempsey, C. M., Mackenzie, S. M., Gargus, A., Blanco, G., Sze, J. Y. Serotonin (5HT), fluoxetine, imipramine and dopamine target distinct 5HT receptor signaling to modulate Caenorhabditis elegans egg-laying behavior. Genetics. 169, 1425-1436 (2005).
- Leung, M. C., Williams, P. L., Bennedetto, A., Au, C., Helmcke, K. J., Aschner, M., Meyer, J. N. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicol. Sci. 106, 5-28 (2008).
- Mylonakis, E., Aballay, A. Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions. Infect. Immun. 73, 3833-3841 (2005).
- Schafer, W. R. . WormBook. , (2005).
- White, J., Southgate, E., Thomson, N., Brenner, S. The structure of the Caenorhabditis elegans nervous system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314, 1-340 (1986).
- Desai, C., Garriga, G., McIntire, S. L., Horvitz, H. R. A genetic pathway for the development of the Caenorhabditis elegans HSN motor neurons. Nature. 336, 638-646 (1988).
- Garsin, D. A., Sifri, C. D., Mylonakis, E., Qin, X., Singh, K. V., Murray, B. E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. A simple model host for identifying Gram-positive virulence factors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10892-10897 (2001).
- Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. A. Salmonella typhmurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans. Curr. Biol. 10, 1539-1542 (2000).
- O’Quinn, A. L., Wiegand, E. M., Jeddeloh, J. A. Burkholderia pseudomallei kills the nematode Caenorhabditis elegans using an endotoxin-mediated paralysis. Cell. Microbiol. 3, 381-393 (2001).
- Brenner, S. Genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Harvey, S. C., Shorto, A., Orbidans, H. E. Quantitative genetic analysis of life- history traits of Caenorhabditis elegans in stressful environments. BMC Evol. Biol. 8, 15 (2008).
- Harvey, S. C., Orbidans, H. E. All eggs are not equal: the maternal environment affects progeny reproduction and developmental fate in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 6, e25840 (2011).
- Klass MR, . Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mech. Ageing. Dev. 6, 413-429 (1977).
