Ett ägg-i-mask (EIW)-analys är en användbar metod för att kvantifiera äggläggande beteende. Förändringar i äggläggningen kan vara en beteendegensvar av modellen organismen<em> Caenorhabditis elegans</em> Att potentiellt skadliga miljö-ämnen såsom de som produceras av patogena bakterier.
C. elegans äggläggning beteende påverkas av miljö-signaler såsom osmolaritet 1 och vibrationer 2. I total avsaknad av mat C. elegans upphör också äggläggningen och behålla befruktade ägg i sin livmoder 3. Däremot är effekten av olika källor av mat, speciellt patogena bakterier och särskilt Enterococcus faecalis, på äggläggning beteende inte väl karakteriserade. Ägget-in-masken (EIW)-analys är ett användbart verktyg för att kvantifiera effekterna av olika typer av bakterier, i det här fallet E. faecalis, på äggläggning beteende.
EIW analyser involverar räkna antalet ägg som kvarhålles i uterus hos C. elegans 4. Den EIW analysen involverar blekning iscensatt, gravid vuxen C. elegans för att ta bort nagelbanden och separera de balanserade ägg från djur. Före blekning, är maskar utsätts för bakterier (eller någon typ av miljö-cue) Under en bestämd tidsperiod. Efter blekning, är en mycket lätt kunna räkna antalet ägg som behålls inne i livmodern av maskar. I denna analys, en kvantifierbar ökning ägg kvarhållande efter E. faecalis exponering kan lätt mätas. Den EIW-analysen är en beteendevetenskaplig analys som kan användas för att screena för potentiellt sjukdomsframkallande bakterier eller förekomsten av miljögifter. Dessutom kan EIW analysen vara ett verktyg för att screena för läkemedel som påverkar signalsubstansen signalering eftersom äggläggning beteende moduleras av signalsubstanser som serotonin och acetylkolin 5-9.
Caenorhabditis elegans, en mikroskopisk, fritt levande rundmask, är en modell organism som traditionellt används för att studera utvecklings-och cell signalering processer på grund av dess transparenta anatomi, väl karakteriserad utveckling, fullt sekvenserat genomet, kort generationstid-tid, och genetisk homologi till människor . På senare tid, C. elegans har blivit en modell organism inom miljötoxikologi och medfödd immunitet 10, 11.
Dessa självbefruktande hermafroditiska maskar blir könsmogna inom två till tre dagar efter kläckningen ur ägget. Under sin livscykel, C. elegans passerar fyra larvstadier (L1-L4), före vuxen ålder. Ett isolerat hermafrodit kan producera i genomsnitt 300 avkommor inom tre dagar från topp fruktsamhet. I reproduktivt mogen C. elegans hermafroditer är befruktade ägg kvar i livmodern under flera timmar innan de läggs. Dennormal antal ägg lagrade i livmodern vid en viss tidpunkt (under topp fruktsamhet) är mellan tio och femton 12. Antalet ägg i livmodern är en funktion av både hastigheten av äggproduktion och hastigheten för äggläggning. Befruktade ägg ut från livmodern genom sammandragning av sexton vulva muskler arrangerade kring öppnandet av vulva 13. Hermafrodit-specifika motorneurons (HSN: s) och VC motorneurons synaps på vulva muskler påverkar muskelsammandragning och därmed äggläggande beteende 5,7,13,14. Utvisning av ägg från livmodern uppstår på grund av samordnade aktiviteten av nervceller och muskler.
Lab kulturer av C. elegans är oftast upp på en diet av nonpathogenic Escherichia coli OP50. I den naturliga miljön, C. elegans kommer i kontakt med en mängd olika livsmedel källor, såsom patogena bakterier, som kan vara potentiellt skadliga. När de utsätts för skadliga ämnen imiljön, C. elegans behåller äggen tills miljön blir mer gynnsam. Förmodligen ägg kvarhållande är ett försök att skydda sin avkomma.
I detta ägg i masken (EIW)-analys, C. elegans utsätts för potentiellt patogena bakterier, Enterococcus faecalis, som finns i miljön. Exponering för patogena former av E. faecalis kan orsaka ihållande tarminfektion och med död i C. elegans 15. Exponering för andra former av patogena bakterier har visats påverka ägg kvarhållande 16,17, men effekten inte kvantifierades. Dessutom, effekten av milt patogena stammar av E. faecalis har stammar som inte är omedelbart dödande, på äggläggning beteende inte studerats.
EIW analyser involverar räkna antalet ägg som kvarhålles i uterus hos C. elegans 4. Även om C. elegansär transparent, kan äggen samlas i livmodern vara svåra att kvantifiera i ett intakt djur. Den EIW analysen involverar blekning gravid vuxen C. elegans som exponerats för bakterien under en bestämd tidsperiod. Den blekmedel upplöser yttre nagelband lämnar äggen bakom. Äggen är brytningsindex för effekterna av blekmedel på grund av närvaron av en skyddande äggskal. Efter blekning, är en mycket lätt kunna räkna antalet ägg frigörs från livmodern av maskarna vid blekning.
Analysen som beskrivs är en enkel, billig och snabb metod för att kvantifiera antalet ägg i livmodern på en gång, och därmed kvantifiera effekterna av E. faecalis på ägg retention. Denna analys kan användas för att kvantifiera effekten av andra typer av bakterier, miljögifter eller läkemedel på ägg retention. Denna analys har också potential att användas som en skärm för bakteriell patogenicitet.
De mest kritiska stegen i framgångsrikt utföra denna analys är följande: 1) med användning av väl-matade lager av C. elegans, 2) odling enstaka typer av bakterier på assayplattan, 3) korrekt identifiera iscensatt L4 maskar för exponering för E. faecalis, 4) att hålla exponeringstiden till E. faecalis genomgående i alla studier och 5) blekning tiden bör inte överstiga tio minuter för att förhindra ägget sönderfall.
För denna analys är det viktigt …
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka juni Middleton för tillförsel E. faecalis-stammar och för vägledning med bakteriekultur. C. elegans lämnades av CGC, som finansieras av NIH Office of Programs forskningsinfrastruktur (P40 OD010440).
Agar, ultrapure | Affymetrix | 10906 | |
Bacto Peptone | Becton Dickinson | 211677 | |
Bacto Tryptone | Becton Dickinson | 211705 | |
Brain Heart Infusion dehydrated medium | Carolina Biological Supply | 781781 | |
C. elegans, N2 strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
Culture plates for C. elegans | Tritech Research Inc. | T3308 | |
Culture plates for E. faecalis | Fisher Scientific-Fisherbrand | 875713 | |
E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
E. faecalis strains | provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci | ||
by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth; | |||
all strains grew at 44.5 ºC and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars (arabinose, mannitol, methyl-α-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed presumptive identification of all E. faecalis strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux). |
|||
Microscope | Motic | SMZ 168B | any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient |
Streptomycin sulfate | Fisher BioReagents | BP910-50 | |
Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco | Becton Dickinson | 236950 | |
Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL | Becton Dickinson | 211768 | |
Yeast extract | Acros | 61180-1000 |