Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

قياس آثار البكتيريا على doi: 10.3791/51203 Published: October 22, 2013

Summary

بيضة في ودودة (EIW) الاختبار هو طريقة مفيدة لتحديد وضع البيض السلوك. يمكن إجراء تعديلات في وضع البيض يكون ردا السلوكية للكائن نموذج

Abstract

يتأثر C. ايليجانس سلوك وضع البيض من قبل العظة البيئية مثل الأسمولية 1 والاهتزاز 2. في غياب الأغذية C. وقف ايليجانس أيضا وضع البيض والاحتفاظ البويضات المخصبة في الرحم بهم 3. ومع ذلك، فإن تأثير مصادر مختلفة من المواد الغذائية، وخصوصا البكتيريا المسببة للأمراض وخاصة المعوية البرازية، على سلوك وضع البيض لا تتميز بشكل جيد. البيضة في ودودة (EIW) الاختبار هو أداة مفيدة لقياس الآثار المترتبة على أنواع مختلفة من البكتيريا، في هذه الحالة E. البرازية، على سلوك وضع البيض.

المقايسات EIW تنطوي على إحصاء عدد البيض الاحتفاظ بها في رحم C. ايليجانس 4. مقايسة EIW ينطوي تبيض نظموا، حامل الكبار C. ايليجانس لإزالة إهاب وفصل البيض المدورة من الحيوان. قبل التبييض، ويتعرضون للبكتيريا والديدان (أو أي نوع من جديلة البيئية) لفترة محددة من الزمن. بعد التبييض، واحد هو بسهولة جدا قادرة على الاعتماد على عدد من البيض الاحتفاظ داخل الرحم من الديدان. في هذا الاختبار، زيادة قابلة للقياس الكمي في الاحتفاظ البيض بعد E. التعرض البرازية يمكن قياسها بسهولة. مقايسة EIW هو فحص السلوكية التي يمكن استخدامها للكشف عن الجراثيم المحرضة أو وجود السموم البيئية. وبالإضافة إلى ذلك، قد يكون مقايسة EIW أداة للكشف عن الأدوية التي تؤثر على الموصلات العصبية مما يشير السلوك منذ وضع البيض هو عن طريق التضمين الناقلات العصبية مثل السيروتونين وأستيل كولين 5-9.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

انواع معينة ايليجانس، وهو المجهرية، الدودة التي تعيش بحرية، هو كائن نموذج يستخدم تقليديا لدراسة العمليات التنموية وخلية يشير بسبب التشريح مهامها بشفافية، وتنمية تتميز بشكل جيد، تماما التسلسل الجينوم، وباختصار جيل من الوقت، والتماثل الجيني للبشر . وفي الآونة الأخيرة، C. أصبح ايليجانس كائن نموذج في مجال علم السموم البيئية والمناعة الفطرية 10، 11.

هذه الديدان خنثوي التسميد الذاتي تصبح ناضجة جنسيا في غضون 2-3 أيام من الفقس من البيض. خلال دورة حياتها، C. ايليجانس يمر عبر أربع مراحل اليرقات (L1-L4)، قبل أن تصل إلى سن البلوغ. واحدة معزولة خنثى يمكن أن تنتج، في المتوسط، 300 ذرية في غضون ثلاثة أيام من ذروة الخصوبة. في التناسل ناضجة C. ايليجانس المخنثين، يتم الاحتفاظ البويضات المخصبة داخل الرحم لعدة ساعات قبل أن يوضع. الالعدد الطبيعي من البيض المخزنة في الرحم في أي وقت واحد (خلال ذروة الخصوبة) ما بين عشرة وخمسة عشر 12. عدد البيض في الرحم هي وظيفة كل من معدل إنتاج البيض ومعدل وضع البيض. يتم طرد البويضات المخصبة من الرحم عن طريق تقلص عضلات ستة عشر فرجي رتبت حول فتحة الفرج 13. motorneurons خنثى محددة (في HSN) وmotorneurons VC المشبك على عضلات فرجي التي تؤثر على انقباض العضلات وبالتالي وضع البيض السلوك 5،7،13،14. طرد البيض من الرحم يحدث نتيجة لنشاط منسقة من الخلايا العصبية والعضلات.

الثقافات مختبر C. عادة ما تثار ايليجانس على نظام غذائي من غير ممرض الإشريكية القولونية OP50. في البيئة الطبيعية، C. ايليجانس تتلامس مع مجموعة متنوعة من مصادر الغذاء، مثل البكتيريا المسببة للأمراض، التي يمكن أن تكون ضارة. عندما تتعرض لمواد ضارة فيالبيئة، C. ايليجانس الاحتفاظ البيض حتى يصبح بيئة أكثر ملاءمة. يفترض هذا احتباس البيض هو محاولة لحماية ذريتها.

في هذه البيضة في دودة (EIW) مقايسة، C. ويتعرض ايليجانس للبكتيريا المسببة للأمراض محتملة، المكورات المعوية البرازية، وهي موجودة في البيئة. التعرض لأشكال المسببة للأمراض من E. البرازية يمكن أن يسبب عدوى معوية الثابتة وحتى الموت في C. ايليجانس 15. وقد ثبت أن التعرض لأشكال أخرى من أشكال البكتيريا المسببة للأمراض تؤثر على البيض الاحتفاظ 16،17، ومع ذلك لم يكن كميا تأثير. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تأثير المسببة للأمراض أقل ما يقال سلالات E. البرازية، لم تدرس السلالات التي ليست قاتلة على الفور، على سلوك وضع البيض.

المقايسات EIW تنطوي على إحصاء عدد البيض الاحتفاظ بها في رحم C. ايليجانس 4. على الرغم من C. ايليجانستتسم بالشفافية، ويمكن البيض تتراكم في الرحم يكون من الصعب تحديد في حيوان سليمة. ينطوي على فحص EIW تبيض حامل الكبار C. ايليجانس التي تعرضت للبكتيريا لفترة محددة من الزمن. الحل التبييض يذوب إهاب الخارجي تاركا وراء البيض. البيض هي الانكسار لآثار التبييض بسبب وجود قشر البيض واقية. بعد التبييض، واحد هو بسهولة جدا قادرة على الاعتماد على عدد البيض التي صدرت من الرحم من الديدان على التبييض.

مقايسة وصف هو وسيلة بسيطة وغير مكلفة، وسريعة لتحديد عدد البيض في الرحم في وقت واحد، وبالتالي تحديد آثار E. البرازية على الاحتفاظ البيض. هذا الاختبار يمكن أن تستخدم لقياس تأثير أنواع أخرى من البكتيريا، والسموم البيئية أو المخدرات على الاحتفاظ البيض. يحتوي هذا الاختبار أيضا على إمكانية استخدامها كشاشة للالمرضية البكتيرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1) إعداد وسائط النمو الخيطية (NGM)

  1. لجعل 50 لوحات، إضافة 1.5 غرام كلوريد الصوديوم، 8.5 غرام عالى النقاء آجار، و1.25 ز ببتون إلى Lflask 1.
  2. أضف 487.5 مل من DH 2 O إلى القارورة. دوامة بلطف لمزج وتغطية افتتاح قارورة مع قطعة من رقائق الألومنيوم.
  3. تعقيم الحل عن طريق التعقيم في الظروف القياسية (121 رطل، 120 ° C، 20 دقيقة).
  4. يسمح الحل لتبرد إلى 45 درجة مئوية في حمام مائي.
  5. إلى الحل، إضافة التالية بالترتيب: 500 ميكرولتر من الكولسترول 5 ملغ / مل محلول المخزون (الذائبة في الايثانول)، 500 ميكرولتر 1 M و CaCl 500 ميكرولتر 1 M MgSO و 12.5 مل KPO 4 العازلة (54.15 ز KH 2 PO 4 و 17.8 ز K 2 هبو 4 في 500 مل من DH 2 O) كما هو موضح في 18.
  6. استخدام ماصات معقمة، إضافة 10 مل من محلول أجار لكل 60 مم البوليسترين طبق بيتري. السماح لوسائل الإعلام لترسيخ في درجة حرارة الغرفة overnآيت.

2) إعداد مرق B E. وسائل الإعلام القولونية

  1. خمسة لجعل 100 مل الثقافات، إضافة 5.0 غرام من Bacto تريبتون، 2.5 غرام خلاصة الخميرة، 5.0 غرام كلوريد الصوديوم إلى دورق.
  2. إضافة عقيمة، الماء المقطر إلى الحجم النهائي من 500 مل. الحرارة الحل على طبق ساخن، مع التحريك، إلى أن حلت المواد المذابة.
  3. صب 100 مل من مرق B إلى خمس زجاجات (200 مل على الأقل حجم).
  4. تعقيم بواسطة التعقيم الحلول في الظروف القياسية (121 رطل، 120 ° C، 20 دقيقة).
  5. تسمح B مرق لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.

3) البذر C. لوحات صيانة ايليجانس

  1. بعد السماح لوحات NGM حتى يجف في درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوع واحد على الأقل، تطعيم واحدة 100 مل B ثقافة مرق مع عدد قليل من مستعمرات E. القولونية (OP50).
  2. تنمو E. ثقافة القولونية عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
  3. ماصة اثنين واحد قطرات (ما يقرب من 10081؛ ل) من OP50 الثقافة على مركز كل لوحة NGM. وعادة ما تكون مكدسة لوحات من جانب غطاء فوق. عندما pipetting ل(البذر)، تبدأ من قبل pipetting الثقافة على لوحة في أسفل كومة. العمل طريقك كل المكدس. ليس محاولة لنقل لوحات بعد البذر، لأنه من المهم أن الثقافة لا يحصل أيضا على مقربة من حواف اللوحة.
  4. السماح لوحات المصنف لتجف في درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوع واحد على الأقل قبل استخدام.
  5. يتم تخزين لوحات المصنف (مقلوب) في حاويات من البلاستيك مختوم في درجة حرارة الغرفة.

4) الحفاظ على C. ايليجانس سلالات

  1. للحفاظ على تغذية جيدة C. الأسهم ايليجانس، استخدم دودة اختيار لنقل ثلاثة L4s أو البالغين حامل إلى جديد، المصنف NGM لوحة كل 3-4 أيام.
  2. لوحات مخزن (مقلوب) يفضل أن يكون داخل حاضنة عند 15-22 درجة مئوية. تم تخزين الثقافات في المقايسات وصفها في 20 ° C. C. التنمية ايليجانس هو درجة الحرارة التي تعتمد على. كما maintenaNCE ارتفاع درجات الحرارة، والوقت بين مراحل النمو النقصان.

5) إعداد آجار الصويا زيتية (TSA) E. البرازية الثقافة وسائل الإعلام

  1. لجعل 50 لوحات، وقياس 500 مل من العقيمة، الماء المقطر في دورق وتقديمهم ليغلي، مع التحريك، على موقد.
  2. إضافة 20 غرام من مسحوق TSA أجار إلى قارورة والسماح حل حل.
  3. تعقيم بواسطة التعقيم الحلول في الظروف القياسية (121 رطل، 120 ° C، 20 دقيقة).
  4. يسمح الحل لتبرد إلى 45 درجة مئوية في حمام مائي.
  5. استخدام ماصات معقمة، إضافة 10 مل من محلول أجار لكل 60 مم البوليسترين طبق بيتري. السماح لوسائل الإعلام لترسيخ في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.

6) إعداد مرق الصويا زيتية (TSB) E. البرازية الثقافة وسائل الإعلام

  1. لجعل 250 أنابيب والثقافة، وقياس 500 مل من العقيمة، الماء المقطر في دورق ودافئة على موقد مع التحريك. إضافة 15 غرام من مسحوق أجار TSB إلى قارورة والسماح للمسحوق حل.
  2. تعقيم بواسطة التعقيم الحلول في الظروف القياسية (121 رطل، 120 ° C، 20 دقيقة).
  3. يسمح حل لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة، ثم ماصة 2 مل إلى العقيمة، 5 مل أنابيب الاختبار.

7) إعداد الدماغ القلب تسريب (BHI) وسائل الاعلام، مع الستربتوميسين، لE. البرازية الثقافة

  1. قياس 500 مل من العقيمة، الماء المقطر في دورق وتقديمهم ليغلي، مع التحريك، على موقد.
  2. إضافة 26 غرام من BHI متوسطة إلى القارورة والسماح للحل حل.
  3. تعقيم بواسطة التعقيم الحلول في الظروف القياسية (121 رطل، 120 ° C، 20 دقيقة).
  4. يسمح حل لتبرد إلى 45 درجة مئوية في حمام مائي.
  5. باستخدام تقنية معقمة، إضافة 0.5 مل من 10 ملغ / مل الستربتوميسين حل الأوراق المالية ودوامة لخلط.
  6. إضافة 10 مل من محلول لكل 60 مم البوليسترين طبق بيتري.

8) المحافظة على E. البرازية سلالات

  1. للحفاظ على E. الأسهم البرازية، استخدم حلقة عقيمة إلى خط المستعمرات الفردية على لوحات أجار الصويا زيتية منفصلة (TSA).
  2. تنمو الثقافات عند 37 درجة مئوية خلال الليل. لوحات مخزن (مقلوب) في كيس مختوم أو مربع في درجة حرارة الغرفة لعدة أسابيع.

9) إعداد E. لوحات البرازية لEIW الفحص

  1. تطعيم 2 مل ثقافة TSB مع مستعمرة من E. البرازية واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  2. ماصة 20 ميكرولتر من E. ثقافة البرازية على وسط المعدة لوحة بهي، الستربتوميسين، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.

10) إعداد E. لوحات القولونية لEIW الفحص (لوحات التحكم)

  1. تطعيم 100 مل B-إخوانهثقافة ال مع مستعمرة من E. القولونية OP50 واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية
  2. ماصة 20 ميكرولتر من ثقافة OP50 على مركز لوحة NGM غير المصنف والسماح لوحات المصنف لتجف في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.

11) بيضة في الفحص دودة

  1. اختيار 15-20 نظموا-L4 C. ايليجانس (الشكل 1) على وسط الحديقة من البكتيريا على استعداد BHI-بكتيريا E.- البرازية لوحة. يجب الحرص على عدم نقل الكثير من OP50 إلى لوحة بهي. اختيار نفس العدد من L4s إلى عنصر تحكم NGM-OP50 لوحة.
  2. احتضان لوحات لمدة 40 ساعة عند 20 درجة مئوية.
  3. إعداد 20٪ محلول التبييض. خلط مواد التبييض التجارية (6.0٪ هيبوكلوريت الصوديوم) مع حجم مناسب من الماء المقطر.
  4. إضافة 10 قطرات ميكرولتر من محلول التبييض لعشرة مواقع متميزة على غطاء من البلاستيك (من دودة أو لوحة البكتيرية).
  5. باستخدام معول دودة، دودة نقل واحدة في كل قطرة التبييض. بلطف دوامة غيض مناختيار في قطيرة التبييض للتأكد من وغسلها الدودة قبالة نهاية المعول (تأكيد عن طريق عرض قطيرة تحت المجهر تشريح).
  6. السماح للبشرة حل لحوالي 10 دقيقة أو حتى انفجر الديدان مفتوحة، طرد البيض (الشكل 2). يجب الحرص على عدم نقل البيض من لوحة.
  7. باستخدام مجهر تشريح، عد البيض في كل قطرة من التبييض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

هذا الاختبار يسمح احد لتحديد عدد البيض المدورة ضمن C. ايليجانس بعد التعرض لE. البرازية. نظمت L4 تعرضوا الديدان (التي تتميز مساحة شفافة فوق الفرج، والشكل 1) إلى E. البرازية من خلال مرحلة البلوغ. بعد أربعين ساعة من التعرض للE. البرازية، وتبيض تم تنفيذها. كما تفككت بشرة في الحبرية التبييض، أصبحت أكثر وضوحا البيض (الشكل 2). وكان كميا عدد البيض الاحتفاظ بسهولة عن طريق عد أثناء عرض تحت مجهر تشريح.

تم الإبقاء على المزيد من البيض في وجود E. سلالات البرازية اختبار، بالمقارنة مع E. القولونية OP50 الضوابط (الشكل 3). هناك بعض التباين في التأثير من أي سلالة واحدة من E. البرازية على الديدان الفردية، كما يرى من أشرطة الخطأ. ومع ذلك، فإن تأثير سلالات E. البرازية على الاحتفاظ بيضة داخللا تختلف السكان من الديدان بشكل كبير من الضوابط. درجة الاحتفاظ البيض التي تسببها سلالات مختلفة من E. قد تختلف أيضا البرازية التي تم اختبارها. قد يكون راجعا إلى التعبير عن عوامل الفوعة مختلفة في كل سلالة هذا التأثير متنوعة.

الشكل 1
الشكل 1. تحديد L4 نظموا C. ايليجانس. A. L4 مرحلة C. ايليجانس اليرقات هي أكبر الحالي اليرقات على لوحات فقط أقصر قليلا في طول من الديدان البالغة. L4s هي أرق من البالغين كذلك، ونظرا لعدم وجود البيض المدورة (التي تجعل الديدان البالغة أوسع قليلا). B. بعد تحديد تلك اليرقات التي هي أقصر قليلا من الكبار، L4-نظموا C. ويتم تحديد مزيد من ايليجانس بواسطة أخف وزنا بقعة نصف القمر يقع فيالأوسط من الجسم (النصال أسود). هذه البقعة مرئيا في أصغر اليرقات (L2 ومراحل L3)، ولكن تغيب في البالغين. وقد اتخذت جميع الصور من الديدان على لوحات NGM، مع كاميرا محمولة لمجهر تشريح (التكبير 40X 50X وعن ألف وباء، على التوالي). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الشكل 2
الشكل 2. محلول التبييض يذوب C. ايليجانس بشرة مع مرور الوقت. يتم وضع دودة الكبار نظموا في قطرة من محلول التبييض (A). على مدى خمس إلى عشر دقائق، وبشرة من دودة يبدأ بحل (BF). لأن معظم بشرة يذوب، البيض تصبح مرئية (F الأسهم السوداء). مخازن الدهون داخل المرض دودة س تذوب ببطء في التبييض، وتبقى مرئية (F، السهام الرمادي). وقد اتخذت جميع الصور من الديدان على لوحات NGM، مع كاميرا محمولة لمجهر تشريح (40X). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الشكل (3)
الشكل (3). بعض E. سلالات البرازية تسبب زيادة احتباس البيض بعد 40 ساعة من التعرض. الديدان تتعرض لاثنين من ستة E. وأظهرت سلالات البرازية (الحانات البرتقالي) زيادة مستوى الاحتفاظ البيض مقارنة الديدان غذت E. القولونية (OP50) سلالة تحكم (أشرطة زرقاء). غذيت عشر الديدان كل سلالة بكتيرية في كل محاكمة. وقد أجريت التجارب في ثلاث نسخ في أيام مختلفة. * يشير P <0.05 (اختبار t للطالب)."> اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الخطوات الأكثر أهمية في أداء هذا الاختبار بنجاح هي: 1) باستخدام مخزونات تغذية جيدة من C. ايليجانس، 2) زراعة أنواع من البكتيريا واحدة على لوحة فحص، 3) تحديد بدقة نظموا L4 الديدان التعرض للE. البرازية، 4) حفظ الوقت التعرض لE. البرازية متناسقة عبر جميع المحاكمات و5) تبيض الوقت يجب أن لا تتجاوز عشر دقائق لمنع تفكك البيض.

لهذا الاختبار من المهم لاختيار صحي، والديدان التي تتغذى بشكل جيد. المجاعة الأمهات يمكن أن تؤثر على الخصوبة والنمو من ذرية 19،20، وبالتالي فإنه من المهم أن الديدان قد تم تغذية جيدة لعدة أجيال قبل تنفيذ هذا الاختبار. ويحتفظ الأسهم جيدا تغذية الديدان بسهولة ببساطة عن طريق نقل بعض الديدان البالغة لالمصنفة جديدة NGM لوحة كل 2-3 أيام. يومين قبل الفحص أيام، يجب وضع الديدان البالغة على العشب الطازجة من OP50 من أجل الحصول على ما يكفي من L4 ذرية المتاحة للمقايسة.

<فئة P = "jove_content"> ومن المهم أيضا أن لوحات مقايسة EIW تعزيز نمو فقط نوع واحد من البكتيريا. E. كانت تزرع سلالات البرازية على لوحات بهي. تمت إضافة الستربتوميسين إلى لوحات لتحديد ضد E. القولونية OP50، والتي يتم نقلها مع L4 الديدان كما يتم نقلها من لوحات NGM صيانة لوحات الفحص. ينمو OP50 أيضا على لوحات بهي. إذا لم تكن محددة ضد، C. سوف ايليجانس تتغذى على نوعين من البكتيريا (إي كولاي E. البرازية و)، في حين على لوحات بهي. سلالات من E. البرازية المستخدمة في هذا الاختبار هي مقاوما للستربتومايسين. إذا تم استخدام أنواع مختلفة من البكتيريا لهذا الاختبار، والمضادات الحيوية المختلفة، وسائل الإعلام والثقافة ربما مختلفة، ويجب أن تستخدم لتحديد للبكتيريا الاختيار وضد E. القولونية OP50.

اختيار بدقة نظموا الديدان لهذا الاختبار هو أمر حاسم لعدة أسباب. أولا، من المهم أن تعول الاحتفاظ البيض خلال ر انه الوقت من إنتاج البيض / زرع في C. التسميد عن النفس ايليجانس. يحدث إنتاج البيض فقط خلال الأيام الخمسة الأولى من C. ايليجانس مرحلة البلوغ (وتبلغ ذروتها حوالي 40 ساعة بعد L4) وسرعان ما ينخفض ​​بعد ذلك 4،21. الديدان البالغة تعيش لمدة متوسطها 2-3 أسابيع، والكثير من الديدان البالغة تعيش لمدة أسبوع على الأقل في حين لا تنتج البويضات المخصبة. وبالتالي، فمن المهم للتأكد من أن فحص EIW لم يتم تنفيذ على الديدان البالغة من العمر unstaged غير معروف.

والسبب الثاني أنه من المهم لاستخدام نظم الحيوانات في مقايسة EIW ذلك هو أن الوقت في التنمية الذي تعرضوا الديدان للبكتيريا، السم أو الدواء لرقابة مشددة. ثقافات C. وعادة ما تكون متزامنة ايليجانس في البيضة، L1 أو L4 مراحل. تم استخدام مرحلة L4 لهذا الاختبار بسبب القلق من أن يعد التعرض لE. سوف يؤدي البرازية في الفتك قبل أن يصبح الديدان البالغين حامل.

خيمة "> وتترك مدة من الديدان الوقت في محلول التبييض المهم أيضا مراقبة. الديدان يجب أن يحل عادة في أقل من عشر دقائق، على الرغم من أن هذه المرة لا تختلف من دودة إلى دودة. تذاب في نهاية المطاف البيض المخصب من قبل التبييض، ولكن العملية أبطأ من لبشرة بسبب وجود قشر البيض واقية. سوف تبدأ قشرة البيضة إلى أن تحل من قبل التبييض إذا ما تركت في حل لمدة أطول من 10-15 دقيقة.

يعكس الاحتفاظ البيض التوازن بين إنتاج البيض ووضع البيض. مقايسة EIW وحده لا يميز ما إذا كان عدد البيض الاحتفاظ بها في الرحم ويرجع ذلك إلى إحداث تغييرات في إنتاج البيض أو زرع البويضة. هذا هو مصدر قلق خصوصا إذا الديدان تعامل مع سلالة بكتيرية أو سموم الاحتفاظ البيض أقل من تلك الموجودة في السيطرة على المجموعة. في هذه الحالات خاصة، ينبغي أن يتم حجم الحضنة متابعة الفحص. حجم المقايسات الحضنة تحديد عدد البيض الذي تضعه على الإنجاب مدى الحياة 4 الدودة E. سوف البرازية العمل على زيادة إنتاج البيض، فمن المعقول أن نفترض أن أي زيادة في احتباس البيض بعد التعرض لE. البرازية (كما رأينا في الشكل 3) هو نتيجة لانخفاض سلوك وضع البيض.

مقايسة EIW أيضا لا تحدد الآلية التي البكتيريا قد يغير الاحتفاظ البيض. فمن الممكن أن C. ايليجانس قد تحتفظ البيض لأن البكتيريا المسببة للأمراض يؤثر على التغذية عن طريق استعمار في وتسد فتحة الفم أو لأنها مصدر الغذاء الفقراء. ومن الممكن أيضا أن البكتيريا قد استعمار ومنع افتتاح فرجي، أو تؤثر على وظيفة الخلايا في نظام وضع البيض. هناك حاجة إلى مزيد من التحليل لتحديد الآلية التي مبادرة الخوذ البيضاءيتم تبديل CH البيض الاحتفاظ بهم.

هذا الاختبار EIW يمكن تعديلها بسهولة لتحديد الآثار المترتبة على أنواع عديدة من المركبات على الاحتفاظ البيض. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الاختبار هو بسيط بما فيه الكفاية التي يمكن إدراجها قبل أن تتحول إلى شاشة لتحديد الجينات، إما في المضيف (C. ايليجانس) أو الممرض (E. البرازية)، اللازمة لتأثير العوامل المسببة للأمراض. ويمكن أيضا فحص EIW أن تستخدم للكشف عن الجينات اللازمة لتنظيم وضع البيض نفسها. C. ايليجانس سلوك وضع البيض هو عن طريق التضمين الناقلات العصبية مثل السيروتونين وأستيل كولين 5-9، ويتطلب هذا النشاط المنسق لعدة الخلايا العصبية ومجموعات العضلات 12. وكانت فحوصات EIW والاستمرار في استخدامها لتحديد الجينات مهمة لناقل عصبي إشارات و / أو نشاط العضلات. المقايسات EIW توفير الكمية بدلا من النوعية، وتحليل لC. هامة ايليجانس السلوك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر يونيو ميدلتون لتوريد E. سلالات البرازية وللتوجيه مع ثقافة البكتيريا. C. وقدمت ايليجانس من قبل CGC، الذي يتم تمويله من قبل المعاهد الوطنية للصحة مكتب برامج البنية الأساسية للبحوث (P40 OD010440).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar, ultrapure Affymetrix 10906
Bacto Peptone Becton Dickinson 211677
Bacto Tryptone Becton Dickinson 211705
Brain Heart Infusion dehydrated medium Carolina Biological Supply 781781
C. elegans, N2 strain Caenorhabditis Genetics Center http://www.cbs.umn.edu/cgc
Cholesterol Alfa Aesar A11470
Culture plates for C. elegans Tritech Research Inc. T3308
Culture plates for E. faecalis Fisher Scientific-Fisherbrand 875713
E. coli (OP50) Caenorhabditis Genetics Center http://www.cbs.umn.edu/cgc
E. faecalis strains provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci
by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth;

all strains grew at 44.5 ºC and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars (arabinose, mannitol, methyl-α-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed presumptive identification of all E. faecalis strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux).

Microscope Motic SMZ 168B any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient
Streptomycin sulfate Fisher BioReagents BP910-50
Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco Becton Dickinson 236950
Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL Becton Dickinson 211768
Yeast extract Acros 61180-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Horvitz, H. R., Chalfie, M., Trent, C., Sulston, J. E., Evans, P. D. Serotonin and octopamine in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 216, 1012-1014 (1982).
  2. Sawin, E. R. Genetic and cellular analysis of modulated behaviors in Caenorhabditis elegans [dissertation]. Massachusetts Institute of Technology. Cambridge, MA. (1996).
  3. Trent, C. Genetic and behavioral studies of the egg-laying system of Caenorhabditis elegans [dissertation]. Massachusetts Institute of Technology. Cambridge, MA. (1982).
  4. Chase, D. L., Koelle, M. R. Genetic analysis of RGS protein function in Caenorhabditis elegans. Methods Enzymol. 389, 305-320 (2004).
  5. Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 104, 619-647 (1983).
  6. Weinshenker, D., Garriga, G., Thomas, J. H. Genetic and pharmacological analysis of neurotransmitters controlling egg laying in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 15, 6975-6985 (1995).
  7. Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans. Neuron. 21, 203-214 (1998).
  8. Bany, A., Dong, M., Koelle, M. R. Genetic and cellular basis for acetylcholine inhibition of Caenorhabditis elegans egg-laying behavior. J. Neurosci. 23, 8060-8069 (2003).
  9. Dempsey, C. M., Mackenzie, S. M., Gargus, A., Blanco, G., Sze, J. Y. Serotonin (5HT), fluoxetine, imipramine and dopamine target distinct 5HT receptor signaling to modulate Caenorhabditis elegans egg-laying behavior. Genetics. 169, 1425-1436 (2005).
  10. Leung, M. C., Williams, P. L., Bennedetto, A., Au, C., Helmcke, K. J., Aschner, M., Meyer, J. N. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicol. Sci. 106, 5-28 (2008).
  11. Mylonakis, E., Aballay, A. Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions. Infect. Immun. 73, 3833-3841 (2005).
  12. Schafer, W. R. WormBook. WormBook. (2005).
  13. White, J., Southgate, E., Thomson, N., Brenner, S. The structure of the Caenorhabditis elegans nervous system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314, 1-340 (1986).
  14. Desai, C., Garriga, G., McIntire, S. L., Horvitz, H. R. A genetic pathway for the development of the Caenorhabditis elegans HSN motor neurons. Nature. 336, 638-646 (1988).
  15. Garsin, D. A., Sifri, C. D., Mylonakis, E., Qin, X., Singh, K. V., Murray, B. E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. A simple model host for identifying Gram-positive virulence factors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10892-10897 (2001).
  16. Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. A. Salmonella typhmurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans. Curr. Biol. 10, 1539-1542 (2000).
  17. O'Quinn, A. L., Wiegand, E. M., Jeddeloh, J. A. Burkholderia pseudomallei kills the nematode Caenorhabditis elegans using an endotoxin-mediated paralysis. Cell. Microbiol. 3, 381-393 (2001).
  18. Brenner, S. Genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  19. Harvey, S. C., Shorto, A., Orbidans, H. E. Quantitative genetic analysis of life- history traits of Caenorhabditis elegans in stressful environments. BMC Evol. Biol. 8, 15 (2008).
  20. Harvey, S. C., Orbidans, H. E. All eggs are not equal: the maternal environment affects progeny reproduction and developmental fate in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 6, e25840 (2011).
  21. Klass MR, Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mech. Ageing. Dev. 6, 413-429 (1977).
قياس آثار البكتيريا على<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; السلوك باستخدام مقايسة الاحتفاظ البيض
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gardner, M., Rosell, M., Myers, E. M. Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay. J. Vis. Exp. (80), e51203, doi:10.3791/51203 (2013).More

Gardner, M., Rosell, M., Myers, E. M. Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay. J. Vis. Exp. (80), e51203, doi:10.3791/51203 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter