Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Het meten van de effecten van bacteriën op doi: 10.3791/51203 Published: October 22, 2013

Summary

Een ei-in-worm (EIW) test is een handige methode om eierleggende gedrag te kwantificeren. Veranderingen in eileg kan een gedragsmatige reactie van het modelorganisme zijn

Abstract

C. elegans eileg gedrag wordt beïnvloed door omgevingsfactoren zoals osmolariteit 1 en trillingen 2. Bij totale afwezigheid van voedsel C. elegans ook ophouden eileg en behouden van bevruchte eieren in hun baarmoeder 3. Echter, het effect van verschillende voedingsbronnen name pathogene bacteriën en bijzonder Enterococcus faecalis, on leg gedrag niet goed gekarakteriseerd. De ei-in-worm (EIW) test is een nuttig hulpmiddel om de effecten van verschillende soorten bacteriën kwantificeren, in casu E. faecalis, on leg gedrag.

EIW assays omvatten het tellen van het aantal eieren in de baarmoeder van C. behouden elegans 4. De EIW bepaling omvat bleken opgevoerd, zwangere volwassen C. elegans om de cuticula te verwijderen en scheiden de ingehouden eieren van het dier. Voorafgaand aan bleken, zijn wormen worden blootgesteld aan bacteriën (of een soort van milieu-cue) Voor een vaste periode van tijd. Na bleken, is erg gemakkelijk in staat om het aantal in de baarmoeder van de wormen behouden tellen van eieren. In deze assay, een kwantificeerbare toename ei retentie na E. faecalis belichting kan gemakkelijk worden gemeten. De EIW assay is een gedrags-test die kan worden gebruikt om te screenen op potentieel pathogene bacteriën en de aanwezigheid van giftige stoffen. Daarnaast kan de EIW assay een middel voor het screenen op geneesmiddelen die neurotransmitter beïnvloeden signalering sinds leg gedrag wordt gemoduleerd door neurotransmitters als serotonine en acetylcholine 5-9 zijn.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Caenorhabditis elegans, een microscopische, vrij levende rondworm, een modelorganisme traditioneel gebruikt ontwikkelings-en cel signalerende processen, omdat de transparante anatomie, goed gekarakteriseerde ontwikkeling volledig gesequenced genoom korte generatietijd-tijd en genetische homologie onderzoek bij de mens . Recenter C. elegans is een modelorganisme op het gebied van milieu-toxicologie en aangeboren immuniteit 10, 11.

Deze zelfbemestende hermafrodiete wormen worden geslachtsrijp binnen twee tot drie dagen van het uitbroeden van het ei. Tijdens zijn levenscyclus, C. elegans doorloopt vier larvale stadia (L1-L4), vóór het bereiken van de volwassenheid. Een geïsoleerde hermafrodiet kan produceren, gemiddeld, 300 nakomelingen binnen drie dagen van de piek vruchtbaarheid. In reproductively mature C. elegans hermafrodieten, worden bevruchte eitjes in de baarmoeder behouden voor enkele uren voordat ze gelegd. Denormale aantal eieren opgeslagen in de baarmoeder op een bepaald moment (tijdens de piek vruchtbaarheid) is tussen de tien en vijftien 12. Het aantal eieren in de baarmoeder is een functie van zowel de snelheid van de eierproductie en de snelheid van de eileg. Bevruchte eitjes worden uitgestoten uit de baarmoeder van de samentrekking van zestien vulval spieren rond de opening van de vulva 13. Hermafrodiet-specifieke motorneurons (HSN) en VC motorneurons synaps op vulval spieren die samentrekken van de spieren en dus eierleggende gedrag 5,7,13,14. Uitwijzing van eieren in de baarmoeder optreedt als gevolg van gecoördineerde aktiviteit van neuronen en spieren.

Lab culturen van C. elegans zijn meestal opgegroeid op een dieet van pathogene Escherichia coli OP50. In de natuurlijke omgeving, C. elegans in contact komen met een verscheidenheid van voedselbronnen, zoals pathogene bacteriën, die potentieel schadelijke. Bij blootstelling aan schadelijke stoffen inmilieu, C. elegans behouden eieren totdat het klimaat gunstiger wordt. Vermoedelijk dit ei retentie is een poging om hun nageslacht te beschermen.

In dit ei in worm (EIW) assay, C. elegans worden blootgesteld aan de potentieel pathogene bacteriën, Enterococcus faecalis, die in het milieu. Blootstelling aan pathogene vormen van E. faecalis kan blijvende darminfectie en zelfs de dood veroorzaken in C. elegans 15. Blootstelling aan andere vormen van pathogene bacteriën is aangetoond ei retentie 16,17 beïnvloeden, maar het effect is niet gekwantificeerd. Bovendien, het effect van licht pathogene stammen van E. faecalis, heeft stammen die niet direct dodelijk, op eileg gedrag niet onderzocht.

EIW assays omvatten het tellen van het aantal eieren in de baarmoeder van C. behouden elegans 4. Hoewel C. eleganstransparant zijn, kunnen eieren ophopen in de baarmoeder moeilijk te kwantificeren in een intact dier. De EIW bepaling omvat bleken zwangere volwassen C. elegans die werden blootgesteld aan bacteriën voor een vaste periode van tijd. De bleekoplossing lost de buitenste cuticula verlaten de eieren achteren. De eieren zijn refractieve om de effecten van bleekmiddel door de aanwezigheid van een beschermende eierschaal. Na bleken, is erg gemakkelijk in staat om het aantal eieren vrijgemaakt uit de baarmoeder van de wormen na bleken tellen.

De beschreven test is een eenvoudige, goedkope en snelle methode om het aantal eieren in de baarmoeder te kwantificeren in een keer, en daarmee de effecten van E. kwantificeren faecalis op ei-retentie. Deze test kan worden gebruikt om het effect van andere soorten bacteriën, giftige stoffen of geneesmiddelen op ei retentie kwantificeren. Deze test heeft ook het potentieel om te worden gebruikt als scherm voor bacteriële pathogeniciteit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1) Voorbereiding van Nematoden Groei Media (NGM)

  1. Tot 50 platen te maken, voeg 1,5 g NaCl, 8,5 g Ultrapure Agar, en 1,25 g pepton een 1 Lflask.
  2. Voeg 487,5 ml dH 2 O aan kolf. Roer voorzichtig te mengen en te dekken opening van kolf met een stuk aluminiumfolie.
  3. Steriliseren van de oplossing in de autoclaaf bij standaard condities (121 psi, 120 ° C, 20 min).
  4. Laat de oplossing in een waterbad te koelen tot 45 ° C.
  5. Aan de oplossing, voeg de volgende in volgorde: 500 ul cholesterol van een 5 mg / ml stockoplossing (opgelost in ethanol), 500 pi 1 M CaCl2, 500 pi 1 M MgSO4, en 12,5 ml KPO 4 buffer (54.15 g KH 2PO 4 en 17,8 g K 2 HPO 4 in 500 ml dH 2 O) zoals beschreven in 18.
  6. Met steriele pipetten, voeg 10 ml agar oplossing voor elke 60 mm polystyreen petrischaal. Laat het materiaal stollen bij kamertemperatuur overnechts.

2) Bereiding van B Broth E. coli Media

  1. Om vijf 100 ml culturen te maken, voeg 5,0 g Bacto Trypton, 2,5 g gistextract, 5,0 g NaCl in een bekerglas.
  2. Voeg steriel gedestilleerd water tot een eindvolume van 500 ml. Verwarm de oplossing op een hete plaat, al roerend, totdat de opgeloste stoffen zijn opgelost.
  3. Giet 100 ml B bouillon in vijf glazen flessen (minimaal volume 200 ml).
  4. Steriliseren van de oplossingen in autoclaaf bij standaard condities (121 psi, 120 ° C, 20 minuten).
  5. Laat B bouillon afkoelen tot kamertemperatuur vóór gebruik.

3) Zaaien C. elegans Onderhoud Plates

  1. Nadat men NGM platen drogen bij kamertemperatuur gedurende ten minste een week Inoculeer een 100 ml B bouillonkweek met enkele kolonies van E. coli (OP50).
  2. Groeien E. coli cultuur bij 37 ° C gedurende de nacht.
  3. Pipet een-twee druppels (ongeveer 10081; l) van OP50 cultuur op het midden van elk NGM plaat. Platen zijn meestal gestapeld deksel naar boven. Bij het pipetteren (zaaien), eerst pipetteren de cultuur op de plaat aan de onderzijde van de stapel. Werk je weg omhoog elke stapel. Probeer de platen bewegen na het uitzaaien, omdat het belangrijk is dat de cultuur niet te dicht bij de randen van de plaat te krijgen.
  4. Laat de gezaaide platen gedroogd bij kamertemperatuur gedurende ten minste een week voor gebruik.
  5. Gezaaide platen worden opgeslagen (omgekeerde) in verzegelde plastic containers op kamertemperatuur.

4) Behoud C. elegans Stammen

  1. Te onderhouden weldoorvoede C. elegans voorraden, gebruik dan een worm kiezen om drie L4S of zwangere volwassenen om de 3-4 dagen verhuizen naar een nieuwe, zonder zaadjes NGM plaat.
  2. Store platen (omgekeerde) bij voorkeur in een incubator bij 15 - 22 ° C Culturen in de beschreven testen werden bij 20 ° C. C. opgeslagen elegans ontwikkeling temperatuurafhankelijk is. Zoals maintenance temperatuur stijgt, de tijd tussen de ontwikkelingsstadia afneemt.

5) Bereiding van Tryptic Soy Agar (TSA) E. faecalis Cultuur Media

  1. Tot 50 platen te maken, meet 500 ml steriel, gedestilleerd water in een kolf en breng aan de kook, al roerend, op een kookplaat.
  2. Voeg 20 g poedervormig TSA agar aan kolf en laat oplossing te ontbinden.
  3. Steriliseren van de oplossingen in autoclaaf bij standaard condities (121 psi, 120 ° C, 20 minuten).
  4. Laat de oplossing in een waterbad te koelen tot 45 ° C.
  5. Met steriele pipetten, voeg 10 ml agar oplossing voor elke 60 mm polystyreen petrischaal. Laat het materiaal stollen bij kamertemperatuur gedurende een nacht.

6) Bereiding van Tryptic Soy Broth (TSB) E. faecalis Cultuur Media

  1. Tot 250 cultuurbuizen maken, meet 500 ml steriel, gedestilleerd water in een kolf en warm op een kookplaat onder roeren. Voeg 15 g TSB agar poeder aan de kolf en laat het poeder op te lossen.
  2. Steriliseren van de oplossingen in autoclaaf bij standaard condities (121 psi, 120 ° C, 20 minuten).
  3. Laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur, vervolgens pipet 2 ml in steriele 5 ml reageerbuizen.

7) Voorbereiding van Brain Heart Infusion (BHI) Media, met streptomycine, voor E. faecalis Cultuur

  1. Meet 500 ml steriel, gedestilleerd water in een kolf en breng aan de kook, al roerend, op een kookplaat.
  2. Voeg 26 g BHI medium aan de kolf en laat de oplossing op te lossen.
  3. Steriliseren van de oplossingen in autoclaaf bij standaard condities (121 psi, 120 ° C, 20 minuten).
  4. Laat de oplossing afkoelen tot 45 C in een waterbad.
  5. Met behulp van steriele techniek wordt 0,5 ml van een 10 mg / ml streptomycine stockoplossing en swirl te mengen.
  6. Voeg 10 ml van de oplossing in elk 60 mm polystyreen Petri dish.

8) Handhaving E. faecalis stammen

  1. Naar E. behouden faecalis voorraden, gebruik dan een steriele lus om streak individuele kolonies op afzonderlijke tryptische soja-agar (TSA) platen.
  2. Groeien kweken bij 37 ° C geïncubeerd. WINKEL platen (geïnverteerd) in een gesloten zak of doos bij kamertemperatuur gedurende enkele weken.

9) Het voorbereiden E. faecalis Platen voor EIW Assay

  1. Inoculeren een 2 ml TSB cultuur met een kolonie van E. faecalis en incubeer overnacht bij 37 ° C.
  2. Pipetteer 20 ul E. faecalis cultuur op het midden van een voorbereide BHI-streptomycine plaat en incubeer overnacht bij 37 ° C.

10) Het voorbereiden E. coli Platen voor EIW Assay (Controle Plates)

  1. Inoculeren een 100 ml B-broth cultuur met een kolonie van E. coli OP50 en incubeer overnacht bij 37 ° C
  2. Pipetteer 20 ul van de OP50 cultuur op het midden van een ongeplaatste NGM plaat en laat de geplaatste borden te drogen bij kamertemperatuur gedurende de nacht.

11) Ei in Worm Assay

  1. Pick 15 - 20 geënsceneerde-L4 C. elegans (Figuur 1) op het midden van een grasveld van bacteriën op een voorbereide BHI-Strep-E. faecalis plaat. Wees voorzichtig niet te veel OP50 over te dragen aan de BHI plaat. Kies hetzelfde aantal L4S een controle NGM-OP50 plaat.
  2. Incubeer de platen gedurende 40 uur bij 20 ° C.
  3. Bereid 20% bleekwater oplossing. Meng een commercieel bleekmiddel (6,0% natriumhypochloriet) met het juiste volume gedestilleerd water.
  4. Voeg 10 ul druppels bleekwater oplossing voor tien verschillende locaties op een plastic deksel (van een worm of bacteriële plaat).
  5. Met behulp van een worm pick, overdracht een worm in elk bleekmiddel druppel. Zwenk de punt van dekies in het bleekmiddel druppel te zorgen dat de worm heeft het einde van de oogst (te bevestigen door het bekijken van de druppel onder een dissectie microscoop) afgewassen.
  6. Laat de cuticula te ontbinden gedurende ongeveer 10 minuten of totdat de wormen openbarsten, het verdrijven van de eieren (figuur 2). Wees voorzichtig niet om eieren te brengen van de plaat.
  7. Met behulp van een microscoop ontleden, tel de eieren in elke druppel van bleekwater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Deze test maakt het mogelijk om het aantal behouden eieren kwantificeren binnen C. elegans na blootstelling aan E. faecalis. L4 opgevoerd wormen (gekenmerkt door transparante open ruimte boven de vulva, figuur 1) werden blootgesteld aan E. faecalis door volwassenheid. Na veertig uur van blootstelling aan E. faecalis, bleken uitgevoerd. Aangezien de cuticula gedesintegreerd in het bleekmiddel druppeltje, de eieren duidelijker werd (Figuur 2). Het aantal vastgehouden eieren werd gemakkelijk gekwantificeerd door het tellen tijdens het bekijken van onder dissectiemicroscoop.

Meer eieren werden in aanwezigheid van E. behouden faecalis stammen getest in vergelijking met E. coli OP50 controles (figuur 3). Er is enige variatie in het effect van een stam van E. faecalis op individuele wormen, gezien vanaf de foutbalken. Het effect van stammen van E. faecalis op ei retentie binneneen bevolking van wormen is aanzienlijk afwijken van de controles. De mate van retentie ei opgewekt door verschillende stammen van E. faecalis geteste kan ook variëren. Deze afwisselende effect kan worden toegeschreven aan de expressie van verschillende virulentiefactoren in elke stam.

Figuur 1
Figuur 1. Het identificeren van L4 geënsceneerd C. elegans. A. L4 stadium C. elegans larven zijn het grootste larven aanwezig-platen slechts iets korter dan volwassen wormen. L4S zijn dunner dan volwassenen, voornamelijk door de afwezigheid van de ingehouden eieren (die volwassen wormen iets breder te maken). B. Na het identificeren van die larven die zijn iets korter dan volwassenen, L4-geënsceneerde C. elegans worden verder geïdentificeerd door de lichtere halve maan plek gelegen in demidden van hun lichaam (zwarte pijlpunten). Deze plaats is zichtbaar in kleinere larven (L2 en L3 stadium), maar afwezig in de volwassene. Alle beelden werden genomen van de wormen op NGM platen, met een camera gemonteerd op een dissectie microscoop (40X en 50X vergroting voor respectievelijk A en B). Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 2
Figuur 2. Bleekwater oplossing lost de C. elegans cuticula tijd. Een stapsgewijze volwassen worm in een druppel bleekmiddel oplossing (A). Meer dan vijf tot tien minuten, de cuticula van de worm begint op te lossen (BF). Zoals de meeste van de cuticula wordt ontbonden, de eieren zichtbaar worden (F zwarte pijlen). Vetreserves in de worm ALS o lossen langzaam op in bleekwater, en zichtbaar blijven (F, grijze pijlen). Alle beelden werden genomen van de wormen op NGM platen, met een camera gemonteerd op een dissectie microscoop (40X). Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 3
Figuur 3. Sommige E. faecalis stammen tot verhoogde retentie ei na 40 uur blootstelling. Worms blootgesteld aan twee van de zes E. faecalis stammen (oranje balken) toonde een verhoogd niveau van ei-retentie in vergelijking met wormen voedde de E. coli (OP50) controle stam (blauwe staven). Ten wormen gevoed elke bacteriestam in elke proef. Proeven werden uitgevoerd in drievoud op verschillende dagen. * Geeft p <0,05 (Student's t-test)."> Klik hier voor grotere afbeelding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De meest kritische stappen in het succesvol uitvoeren van deze test zijn: 1) met goed gevoede voorraden C. elegans, 2) het kweken van enkele soorten bacteriën op de testplaat, 3) de nauwkeurige identificatie van geënsceneerde L4 wormen voor blootstelling aan E. faecalis, 4) het houden van de blootstelling tijd om E. faecalis consistent in alle proeven en 5) bleken de tijd mag niet meer dan tien minuten voor ei desintegratie te voorkomen.

Voor deze test is het belangrijk om gezonde, goed gevoede wormen halen. Maternale verhongering kunnen beïnvloeden vruchtbaarheid en groei van nakomelingen 19,20, daarom is het belangrijk dat wormen zijn goed gevoed meerdere generaties voordat deze assay. Een goed gevoede voorraad van wormen is gemakkelijk te onderhouden door simpelweg de overdracht van een aantal volwassen wormen naar een nieuwe zaadjes NGM plaat om de 2-3 dagen. Twee dagen vóór de test moet volwassen wormen op een verse grasveld van OP50 geplaatst om voldoende L4 nageslacht voor de assay.

<p class = "jove_content"> Het is ook belangrijk dat EIW testplaten de groei van slechts een type van bacteriën. E. faecalis stammen werden gekweekt op BHI platen. Streptomycine werd aan de platen toegevoegd tegen E. selecteren coli OP50, die wordt overgedragen met L4 wormen worden overgedragen van onderhoud NGM platen de testplaten. OP50 groeit ook op BHI platen. Zo niet tegen, C. geselecteerd elegans zou voeden twee soorten bacteriën (E. coli en E. faecalis) terwijl op de BHI platen. De stammen van E. faecalis die in deze assay tegen streptomycine. Als verschillende typen bacteriën werden gebruikt voor deze test, een andere antibiotica, en uiteenlopende kweekmedia worden gebruikt om te selecteren voor de bacteriën keuze en tegen E. coli OP50.

Nauwkeurig selecteren opgevoerd wormen voor deze test is cruciaal voor verschillende redenen. Ten eerste is het belangrijk om egg retentie tellen tijdens t hij de tijd van eiproductie / leggen in de self-bemesting C. elegans. Eierproductie treedt alleen op tijdens de eerste vijf dagen van C. elegans volwassenheid (piek rond 40 uur post-L4) en snel daalt daarna 4,21. Volwassen wormen leven voor een gemiddelde van twee tot drie weken, zo veel volwassen wormen leven voor minstens een week, terwijl niet de productie van bevruchte eieren. Daarom is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de EIW assay niet wordt uitgevoerd op unstaged volwassen wormen van onbekende leeftijd.

De tweede reden is het belangrijk om gebruik opgevoerd dieren in de EIW assay is zodat de tijd ontwikkelen waarbij wormen zijn blootgesteld aan de bacteriën, toxine of geneesmiddel wordt streng gecontroleerd. Culturen van C. elegans worden typisch gesynchroniseerd op het ei, L1 en L4 stadia. De L4 stadium werd voor deze test omdat de bezorgdheid dat langere blootstelling aan E. faecalis zou resulteren in letaliteit voordat wormen werd zwangere volwassenen.

tent "> De tijdsduur wormen worden achtergelaten in het bleekmiddel oplossing is ook belangrijk om te controleren. Worms er normaalgesproken oplossen in minder dan tien minuten, maar dit keer niet overal op worm worm. Bevruchte eieren uiteindelijk opgelost door bleekmiddel, maar het proces is langzamer dan de cuticula door de aanwezigheid van een beschermende eierschaal. de eierschaal begint op te lossen door het bleekmiddel als links in de oplossing langer dan 10-15 minuten.

Ei retentie weerspiegelt de balans tussen de productie van eieren en ei leggen. De EIW test alleen niet onderscheiden of het aantal in de baarmoeder behouden eieren is te wijten aan veranderingen in de productie van eieren of ei leggen. Dit is vooral een probleem wanneer wormen behandeld met een bacteriestam of een toxine behouden minder eieren dan die in de controlegroep. In deze gevallen vooral, moet een follow-up broedselgrootte test worden gedaan. Broedselgrootte assays kwantificeren het aantal gelegd over de worm reproductieve levensduur van 4 eieren E. faecalis zou fungeren om eierproductie te verhogen, is het aannemelijk dat een toename ei retentie na blootstelling aan E. faecalis (zoals gezien in figuur 3) is een gevolg van verminderde leg gedrag.

De EIW test is ook niet bepaald het mechanisme waarmee bacteriën kunnen ei retentie veranderen. Het is mogelijk dat C. elegans kunnen eieren behouden omdat de pathogene bacteriën beïnvloedt voeden door koloniseren in en het blokkeren van de mondopening of omdat het een slechte bron van voedsel. Het is ook mogelijk dat de bacteriën koloniseren en blokkeren de vulva opening of invloed op de functie van cellen in de leg systeem. Verder onderzoek is nodig om het mechanisme te bepalen which ei retentie is veranderd.

Dit EIW test kan eenvoudig worden aangepast om de effecten van vele soorten verbindingen van eieren retentie bepalen. Bovendien, deze test is eenvoudig genoeg dat deze in een scherm kan worden opgenomen om genen te identificeren, in de hostcomputer (C. elegans) of ziekte (E. faecalis) die vereist zijn voor het effect van de ziekteverwekker. De EIW test kan ook worden gebruikt om te screenen op genen die nodig zijn voor het regelen van eierleggende zelf. C. elegans eileg gedrag wordt gemoduleerd door neurotransmitters zoals serotonine en acetylcholine 5-9, en vereist de gecoördineerde activiteit van meerdere neuronen en spiergroepen 12. EIW assays zijn geweest en nog steeds worden gebruikt om genen te identificeren voor belangrijke neurotransmitter signalering en / of spieractiviteit. EIW testen leveren een kwantitatief, in plaats van kwalitatieve, analyse van een belangrijk C. elegans gedrag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

De auteurs willen graag juni Middleton bedanken voor het leveren van E. faecalis stammen en voor begeleiding met bacteriën cultuur. C. elegans werden verstrekt door de CGC, dat wordt gefinancierd door NIH Office van Infrastructuur Programma Onderzoek (P40 OD010440).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar, ultrapure Affymetrix 10906
Bacto Peptone Becton Dickinson 211677
Bacto Tryptone Becton Dickinson 211705
Brain Heart Infusion dehydrated medium Carolina Biological Supply 781781
C. elegans, N2 strain Caenorhabditis Genetics Center http://www.cbs.umn.edu/cgc
Cholesterol Alfa Aesar A11470
Culture plates for C. elegans Tritech Research Inc. T3308
Culture plates for E. faecalis Fisher Scientific-Fisherbrand 875713
E. coli (OP50) Caenorhabditis Genetics Center http://www.cbs.umn.edu/cgc
E. faecalis strains provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci
by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth;

all strains grew at 44.5 ºC and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars (arabinose, mannitol, methyl-α-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed presumptive identification of all E. faecalis strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux).

Microscope Motic SMZ 168B any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient
Streptomycin sulfate Fisher BioReagents BP910-50
Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco Becton Dickinson 236950
Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL Becton Dickinson 211768
Yeast extract Acros 61180-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Horvitz, H. R., Chalfie, M., Trent, C., Sulston, J. E., Evans, P. D. Serotonin and octopamine in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 216, 1012-1014 (1982).
  2. Sawin, E. R. Genetic and cellular analysis of modulated behaviors in Caenorhabditis elegans [dissertation]. Massachusetts Institute of Technology. Cambridge, MA. (1996).
  3. Trent, C. Genetic and behavioral studies of the egg-laying system of Caenorhabditis elegans [dissertation]. Massachusetts Institute of Technology. Cambridge, MA. (1982).
  4. Chase, D. L., Koelle, M. R. Genetic analysis of RGS protein function in Caenorhabditis elegans. Methods Enzymol. 389, 305-320 (2004).
  5. Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 104, 619-647 (1983).
  6. Weinshenker, D., Garriga, G., Thomas, J. H. Genetic and pharmacological analysis of neurotransmitters controlling egg laying in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 15, 6975-6985 (1995).
  7. Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans. Neuron. 21, 203-214 (1998).
  8. Bany, A., Dong, M., Koelle, M. R. Genetic and cellular basis for acetylcholine inhibition of Caenorhabditis elegans egg-laying behavior. J. Neurosci. 23, 8060-8069 (2003).
  9. Dempsey, C. M., Mackenzie, S. M., Gargus, A., Blanco, G., Sze, J. Y. Serotonin (5HT), fluoxetine, imipramine and dopamine target distinct 5HT receptor signaling to modulate Caenorhabditis elegans egg-laying behavior. Genetics. 169, 1425-1436 (2005).
  10. Leung, M. C., Williams, P. L., Bennedetto, A., Au, C., Helmcke, K. J., Aschner, M., Meyer, J. N. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicol. Sci. 106, 5-28 (2008).
  11. Mylonakis, E., Aballay, A. Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions. Infect. Immun. 73, 3833-3841 (2005).
  12. Schafer, W. R. WormBook. WormBook. (2005).
  13. White, J., Southgate, E., Thomson, N., Brenner, S. The structure of the Caenorhabditis elegans nervous system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314, 1-340 (1986).
  14. Desai, C., Garriga, G., McIntire, S. L., Horvitz, H. R. A genetic pathway for the development of the Caenorhabditis elegans HSN motor neurons. Nature. 336, 638-646 (1988).
  15. Garsin, D. A., Sifri, C. D., Mylonakis, E., Qin, X., Singh, K. V., Murray, B. E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. A simple model host for identifying Gram-positive virulence factors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10892-10897 (2001).
  16. Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. A. Salmonella typhmurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans. Curr. Biol. 10, 1539-1542 (2000).
  17. O'Quinn, A. L., Wiegand, E. M., Jeddeloh, J. A. Burkholderia pseudomallei kills the nematode Caenorhabditis elegans using an endotoxin-mediated paralysis. Cell. Microbiol. 3, 381-393 (2001).
  18. Brenner, S. Genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  19. Harvey, S. C., Shorto, A., Orbidans, H. E. Quantitative genetic analysis of life- history traits of Caenorhabditis elegans in stressful environments. BMC Evol. Biol. 8, 15 (2008).
  20. Harvey, S. C., Orbidans, H. E. All eggs are not equal: the maternal environment affects progeny reproduction and developmental fate in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 6, e25840 (2011).
  21. Klass MR, Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mech. Ageing. Dev. 6, 413-429 (1977).
Het meten van de effecten van bacteriën op<em&gt; C. Elegans</em&gt; Gedrag Met behulp van een Ei Retention Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gardner, M., Rosell, M., Myers, E. M. Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay. J. Vis. Exp. (80), e51203, doi:10.3791/51203 (2013).More

Gardner, M., Rosell, M., Myers, E. M. Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay. J. Vis. Exp. (80), e51203, doi:10.3791/51203 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter