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Biology

पर बैक्टीरिया के प्रभाव को मापने doi: 10.3791/51203 Published: October 22, 2013

Summary

एक अंडे में कीड़ा (eiw) परख अंडे बिछाने व्यवहार यों के लिए एक उपयोगी तरीका है. अंडा बिछाने में बदलाव मॉडल जीव के एक व्यवहार प्रतिक्रिया हो सकती है

Abstract

एलिगेंस अंडे बिछाने व्यवहार ऐसी परासारिता 1 और कंपन 2 के रूप में पर्यावरण cues से प्रभावित है. भोजन सी. की कुल अभाव में एलिगेंस भी अंडे बिछाने संघर्ष और उनके गर्भाशय 3 में निषेचित अंडे बरकरार रहती है. हालांकि, विशेष रूप से अलग भोजन के स्रोतों, विशेष रूप से रोगजनक बैक्टीरिया और अंडे बिछाने व्यवहार पर उदर faecalis, के प्रभाव को अच्छी तरह से विशेषता नहीं है. अंडे में कीड़ा (eiw) परख इस मामले ई. में, जीवाणु के विभिन्न प्रकार के प्रभाव यों के लिए एक उपयोगी उपकरण है faecalis, अंडे बिछाने व्यवहार पर.

Eiw assays के सी. के गर्भाशय में बनाए रखा अंडे की संख्या की गणना शामिल एलिगेंस 4. Eiw परख मंचन विरंजन, गर्भवती वयस्क सी. शामिल एलिगेंस छल्ली हटाने और पशु से बनाए रखा अंडे को अलग करने के लिए. पिछले विरंजन के लिए, कीड़े बैक्टीरिया (या पर्यावरण क्यू के किसी भी प्रकार के संपर्क में रहे) समय की एक निश्चित अवधि के लिए. विरंजन के बाद, एक बहुत आसानी से कीड़े के गर्भाशय के अंदर बनाए रखा अंडे की संख्या की गणना करने में सक्षम है. ई. के बाद अंडा प्रतिधारण में इस परख में, एक मात्रात्मक वृद्धि faecalis जोखिम आसानी से मापा जा सकता है. Eiw परख संभावित रोगजनक बैक्टीरिया या पर्यावरण विषाक्त पदार्थों की उपस्थिति के लिए स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक व्यवहार परख है. इसके अलावा, eiw परख अंडे बिछाने व्यवहार इस तरह सेरोटोनिन और acetylcholine 5-9 के रूप में न्यूरोट्रांसमीटर द्वारा संग्राहक है क्योंकि संकेत न्यूरोट्रांसमीटर को प्रभावित करने वाली दवाओं के लिए स्क्रीन करने के लिए एक उपकरण किया जा सकता है.

Introduction

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Caenorhabditis एलिगेंस, एक सूक्ष्म, मुक्त रहने वाले राउंडवॉर्म, पारंपरिक रूप से मनुष्य के लिए है क्योंकि इसकी पारदर्शी शरीर रचना विज्ञान, अच्छी तरह से विशेषता विकास, पूरी तरह से अनुक्रम जीनोम, लघु पीढ़ी समय, और आनुवंशिक अनुरूपता के विकास और कोशिका संकेतन प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल एक मॉडल जीव है . हाल ही में, सी. एलिगेंस पर्यावरण विष विज्ञान और सहज उन्मुक्ति 10, 11 के क्षेत्र में एक मॉडल जीव बन गया है.

इन स्वयं fertilizing उभयलिंगी कीड़े अंडे से सेने के दो से तीन दिनों के भीतर यौन परिपक्व हो जाते हैं. अपने जीवन चक्र, सी. के दौरान एलिगेंस वयस्कता तक पहुँचने से पहले, चार लार्वा चरणों (एल 1-L4) से होकर गुजरता है. एक पृथक उभयलिंगी शिखर उपजाऊपन के तीन दिनों के भीतर, औसत पर, 300 वंश का उत्पादन कर सकते हैं. प्रजनन परिपक्व सी में एलिगेंस hermaphrodites, निषेचित अंडे रखा जा रहा से पहले कई घंटे के लिए गर्भाशय के अंदर रखा जाता है.किसी एक समय में गर्भाशय में संग्रहीत अंडे की संख्या सामान्य (शिखर उपजाऊपन के दौरान) के बीच दस और पंद्रह 12 है. गर्भाशय में अंडे की संख्या अंडा उत्पादन की दर और अंडे बिछाने की दर दोनों के एक समारोह है. निषेचित अंडे योनी 13 के उद्घाटन के आसपास की व्यवस्था सोलह vulval मांसपेशियों के संकुचन से गर्भाशय से निष्कासित कर दिया है. उभयलिंगी विशेष motorneurons (HSN है) और इस प्रकार कुलपति motorneurons मांसपेशियों के संकुचन को प्रभावित करने vulval मांसपेशियों पर synapse और अंडे बिछाने व्यवहार 5,7,13,14. गर्भाशय से अंडे के निष्कासन न्यूरॉन्स और मांसपेशियों के समन्वित गतिविधि के कारण होता है.

सी. की लैब संस्कृतियों एलिगेंस आमतौर nonpathogenic Escherichia कोलाई OP50 के एक आहार पर उठा रहे हैं. प्राकृतिक वातावरण, सी में एलिगेंस ऐसे रोगजनक बैक्टीरिया के रूप में भोजन के स्रोतों की विविधता के साथ संपर्क में आते हैं, कि हानिकारक हो सकता है. में हानिकारक तत्वों के संपर्क मेंपर्यावरण, सी. पर्यावरण के अधिक अनुकूल हो जाता है जब तक एलिगेंस अंडे बरकरार रहती है. मुमकिन है इस अंडा प्रतिधारण उनकी संतान की रक्षा के लिए एक प्रयास है.

कीड़ा (eiw) परख, सी में इस अंडे में एलिगेंस संभावित रोगजनक बैक्टीरिया, वातावरण में पाया जाता है जो उदर faecalis, के संपर्क में हैं. ई. के रोगजनक रूपों के संपर्क में faecalis सी में लगातार आंत्र संक्रमण और यहां तक कि मौत का कारण बन सकता है एलिगेंस 15. रोगजनक बैक्टीरिया के अन्य रूपों के संपर्क में अंडा प्रतिधारण 16,17 को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है, लेकिन प्रभाव मात्रा निर्धारित नहीं किया गया था. ई. के अलावा, हल्का रोगजनक का असर उपभेदों faecalis, अंडे बिछाने व्यवहार पर, तुरंत घातक नहीं हैं कि उपभेदों अध्ययन नहीं किया गया.

Eiw assays के सी. के गर्भाशय में बनाए रखा अंडे की संख्या की गणना शामिल एलिगेंस 4. हालांकि सी. एलिगेंसपारदर्शी हैं, गर्भाशय में जमा अंडे एक अक्षुण्ण जानवर में अंदाजा लगाना मुश्किल हो सकता है. Eiw परख गर्भवती वयस्क सी. विरंजन शामिल समय की एक निश्चित अवधि के लिए बैक्टीरिया के संपर्क में थे कि एलिगेंस. ब्लीच समाधान के पीछे अंडे छोड़ने बाहरी छल्ली घुल. अंडे एक सुरक्षात्मक खोल की उपस्थिति के कारण ब्लीच के प्रभाव को अपवर्तक हैं. विरंजन के बाद, एक बहुत आसानी से विरंजन पर कीड़े के गर्भाशय से जारी अंडे की संख्या की गणना करने में सक्षम है.

वर्णित परख एक समय में गर्भाशय में अंडे की संख्या यों के लिए एक सरल, सस्ता और त्वरित तरीका है, और इस प्रकार ई. के प्रभाव यों अंडे की अवधारण पर faecalis. यह परख अंडा प्रतिधारण पर बैक्टीरिया, पर्यावरण विषाक्त पदार्थों या दवाओं के अन्य प्रकार का प्रभाव मात्रा ठहराना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह परख भी बैक्टीरियल pathogenicity के लिए एक स्क्रीन के रूप में इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता है.

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Protocol

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निमेटोड ग्रोथ मीडिया की 1) तैयार करना (एन जी एम)

  1. 50 प्लेटें बनाने के लिए, 1.5 छ NaCl, 8.5 ग्राम Ultrapure अग्रवाल, और एक 1 Lflask को 1.25 ग्राम peptone जोड़ें.
  2. फ्लास्क DH 2 हे 487.5 मिलीलीटर जोड़ें. एल्यूमीनियम पन्नी के एक टुकड़े के साथ कुप्पी के उद्घाटन के मिश्रण और कवर करने के लिए धीरे भंवर.
  3. मानक स्थितियों (121 साई, 120 डिग्री सेल्सियस, 20 मिनट) पर autoclaving द्वारा समाधान जीवाणुरहित.
  4. समाधान के लिए एक पानी के स्नान में 45 डिग्री सेल्सियस को शांत करने की अनुमति दें.
  5. एक 5 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान (इथेनॉल में भंग), 500 μl एम 1 2 CaCl, 500 μl 1 एम 4 MgSO, और 12.5 मिलीग्राम केपीओ 4 बफर (54.15 ग्राम से 500 μl कोलेस्ट्रॉल: समाधान करने के लिए, क्रम में निम्नलिखित जोड़ें DH 2 हे के 500 मिलीलीटर में 2 के.एच. पीओ 4 और 17.8 ग्राम कश्मीर 2 4 HPO) के रूप में 18 में वर्णित है.
  6. बाँझ pipettes का उपयोग करना, प्रत्येक 60 मिमी polystyrene पेट्री डिश के लिए अगर समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ें. मीडिया कमरे के तापमान overn में जमना करने की अनुमति देंight.

बी शोरबा ई. के 2) तैयार करना कोली मीडिया

  1. पाँच 100 मिलीलीटर संस्कृतियों बनाने के लिए, एक बीकर Bacto tryptone, 2.5 ग्राम खमीर निकालने, 5.0 छ NaCl की 5.0 ग्राम जोड़ें.
  2. 500 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए बाँझ, आसुत जल जोड़ें. विलेय भंग कर दिया है, जब तक उद्दीपक, जबकि एक गर्म थाली पर समाधान हीट.
  3. पांच कांच की बोतलें (कम से कम 200 मिलीलीटर मात्रा) में बी शोरबा के 100 मिलीलीटर डालो.
  4. मानक स्थितियों (121 साई, 120 डिग्री सेल्सियस, 20 मिनट) पर autoclaving द्वारा समाधान जीवाणुरहित.
  5. बी शोरबा उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान को शांत करने की अनुमति दें.

3) सीडिंग सी. एलिगेंस रखरखाव प्लेट्स

  1. एन जी एम प्लेटों कम से कम एक सप्ताह के लिए कमरे के तापमान पर शुष्क करने की अनुमति के बाद, ई. की कुछ कालोनियों के साथ एक 100 मिलीलीटर बी शोरबा संस्कृति टीका लगाना कोली (OP50).
  2. ई. आगे बढ़ें 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर कोलाई संस्कृति.
  3. पिपेट एक दो बूँदें (लगभग 10081, एल) OP50 संस्कृति के प्रत्येक एन जी एम थाली के केन्द्र पर. प्लेट्स आमतौर पर ढक्कन साइड खड़ी कर रहे हैं. (बोने) pipetting करते हैं, ढेर के नीचे थाली पर संस्कृति pipetting द्वारा शुरू करते हैं. प्रत्येक ढेर को अपने तरीके से काम करते हैं. यह संस्कृति भी बंद थाली के किनारों को नहीं मिलता है कि महत्वपूर्ण है क्योंकि, बोने के बाद प्लेटों को स्थानांतरित करने के लिए नहीं की कोशिश करें.
  4. वरीयता प्राप्त प्लेटों का उपयोग करने से पहले कम से कम एक सप्ताह के लिए कमरे के तापमान पर सूखे की अनुमति दें.
  5. वरीयता प्राप्त प्लेटें कमरे के तापमान पर मोहरबंद प्लास्टिक के कंटेनर में (उल्टे) जमा हो जाती है.

4) सी. बनाए रखने के एलिगेंस खींच

  1. अच्छी तरह से खिलाया सी. बनाए रखने के लिए एलिगेंस शेयरों, हर 3-4 दिनों एक नया, वरीयता प्राप्त एन जी एम थाली से तीन L4s या गर्भवती वयस्कों ले जाने के लिए उठा एक कीड़ा का उपयोग करें.
  2. स्टोर प्लेट (उल्टे) अधिमानतः एक मशीन के अंदर 15 - 22 डिग्री सेल्सियस वर्णित assays में संस्कृतियों 20 डिग्री सेल्सियस तापमान पर संग्रहित किया गया एलिगेंस विकास के तापमान पर निर्भर है. Maintena रूपतापमान बढ़ता nce, विकास के चरणों के बीच समय कम हो जाती है.

Tryptic सोया अग्रवाल (टीएसए) ई. के 5) तैयार करना faecalis संस्कृति मीडिया

  1. एक hotplate पर, क्रियाशीलता, जबकि 50 प्लेटें बनाने के लिए, एक फ्लास्क में बाँझ, आसुत पानी की 500 मिलीलीटर मापने के लिए और एक उबाल लाने के लिए.
  2. फ्लास्क पाउडर टीएसए अगर की 20 ग्राम जोड़ें और समाधान भंग करने की अनुमति.
  3. मानक स्थितियों (121 साई, 120 डिग्री सेल्सियस, 20 मिनट) पर autoclaving द्वारा समाधान जीवाणुरहित.
  4. समाधान के लिए एक पानी के स्नान में 45 डिग्री सेल्सियस को शांत करने की अनुमति दें.
  5. बाँझ pipettes का उपयोग करना, प्रत्येक 60 मिमी polystyrene पेट्री डिश के लिए अगर समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ें. मीडिया रात में कमरे के तापमान पर जमना करने की अनुमति दें.

Tryptic सोया शोरबा (टीएसबी) ई. के 6) तैयार करना faecalis संस्कृति मीडिया

  1. सरगर्मी जबकि 250 संस्कृति ट्यूब बनाने के लिए, एक hotplate पर एक फ्लास्क और गर्म में बाँझ, आसुत पानी की 500 मिलीलीटर उपाय. फ्लास्क टीएसबी अगर पाउडर के 15 ग्राम जोड़ें और पाउडर भंग करने के लिए अनुमति देते हैं.
  2. मानक स्थितियों (121 साई, 120 डिग्री सेल्सियस, 20 मिनट) पर autoclaving द्वारा समाधान जीवाणुरहित.
  3. बाँझ, 5 मिलीलीटर टेस्ट ट्यूब में समाधान कमरे के तापमान को शांत करने की अनुमति दें, तो पिपेट 2 मिलीलीटर.

7) ई. के लिए स्ट्रेप्टोमाइसिन साथ ब्रेन हार्ट आसव (भी) मीडिया, तैयार करना, faecalis संस्कृति

  1. एक फ्लास्क में बाँझ, आसुत पानी की 500 मिलीलीटर उपाय और एक hotplate पर, क्रियाशीलता, जबकि एक उबाल लाने के लिए.
  2. फ्लास्क BHI माध्यम की 26 ग्राम जोड़ें और समाधान भंग करने की अनुमति.
  3. मानक स्थितियों (121 साई, 120 डिग्री सेल्सियस, 20 मिनट) पर autoclaving द्वारा समाधान जीवाणुरहित.
  4. समाधान डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 45 को शांत करने की अनुमति दें.
  5. बाँझ तकनीक का उपयोग करना, एक 10 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन शेयर समाधान और मिश्रण को चक्कर आने की 0.5 मिलीलीटर जोड़ें.
  6. प्रत्येक 60 मिमी polystyrene पेट्री डिश के लिए समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ें.

8) ई. को बनाए रखने faecalis खींच

  1. ई. बनाए रखने के लिए faecalis शेयरों, अलग tryptic सोया अग्रवाल (टीएसए) प्लेटों पर लकीर व्यक्ति कालोनियों को एक बाँझ पाश का उपयोग करें.
  2. 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात संस्कृतियों आगे बढ़ें. कई हफ्तों के लिए कमरे के तापमान पर एक मोहरबंद बैग या बॉक्स में स्टोर प्लेट (उल्टे).

9) ई. तैयारी eiw परख के लिए faecalis प्लेट्स

  1. ई. की एक कॉलोनी के साथ एक 2 मिलीलीटर टीएसबी संस्कृति टीका लगाना faecalis और 37 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस
  2. ई. के पिपेट 20 μl faecalis एक तैयार BHI स्ट्रेप्टोमाइसिन थाली के केन्द्र पर संस्कृति, और 37 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस

10) ई. तैयारी eiw परख (नियंत्रण प्लेट्स) के लिए कोलाई प्लेट्स

  1. एक 100 मिलीलीटर बी भाई टीका लगानाई. की एक कॉलोनी के साथ वें संस्कृति कोलाई OP50 और 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते
  2. पिपेट 20 एक गैरवरीय एन जी एम थाली के केन्द्र पर OP50 संस्कृति के μl और वरीयता प्राप्त प्लेटें रात भर कमरे के तापमान पर शुष्क करने की अनुमति देते हैं.

इल्ली परख में 11) अंडे

  1. 15 उठाओ - 20 का मंचन-L4 सी. एक तैयार BHI-Strep-ई. पर जीवाणुओं की एक लॉन के केन्द्र पर एलिगेंस (चित्रा 1) faecalis थाली. BHI प्लेट को OP50 के एक बहुत स्थानांतरित करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा. एन जी एम-OP50 प्लेट एक नियंत्रण करने L4s की एक ही नंबर उठाओ.
  2. 20 डिग्री सेल्सियस से कम 40 घंटे के लिए प्लेटें सेते
  3. 20% ब्लीच समाधान तैयार है. आसुत जल की उचित मात्रा के साथ एक वाणिज्यिक ब्लीच (6.0% सोडियम hypochlorite) मिलाएं.
  4. एक प्लास्टिक के ढक्कन पर दस अलग स्थानों (एक कीड़ा या बैक्टीरियल थाली की) करने के लिए ब्लीच समाधान के 10 μl बूँदें जोड़ें.
  5. एक कीड़ा लेने का उपयोग करना, प्रत्येक ब्लीच बूंद में एक कीड़ा हस्तांतरण. का धीरे ज़ुल्फ़ टिपकीड़ा लेने के अंत में (एक विदारक खुर्दबीन के नीचे छोटी बूंद देखने के द्वारा पुष्टि) धुल गया है सुनिश्चित करने के लिए ब्लीच छोटी बूंद में उठा.
  6. कीड़े अंडे (चित्रा 2) को खदेड़ने, खुले फट जब तक छल्ली लगभग 10 मिनट के लिए या भंग करने की अनुमति दें. थाली से अंडे स्थानांतरित करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा.
  7. एक विदारक सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, ब्लीच की हर बूंद में अंडे गिनती.

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Representative Results

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यह परख एक सी. के भीतर बनाए रखा अंडे की संख्या यों के लिए अनुमति देता है ई. के लिए जोखिम के बाद एलिगेंस faecalis. L4 कीड़े (उनके योनी, चित्रा 1 ऊपर पारदर्शी खुले स्थान की विशेषता) ई. से अवगत कराया गया मंचन वयस्कता के माध्यम से faecalis. ई. के लिए जोखिम के चालीस घंटे बाद faecalis, विरंजन प्रदर्शन किया गया था. छल्ली ब्लीच छोटी बूंद में विघटित रूप में, अंडे (चित्रा 2) और अधिक स्पष्ट हो गया. बरकरार रखा अंडे की संख्या आसानी से खुर्दबीन विदारक तहत देखते समय की गणना के द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया था.

अधिक अंडे ई. की उपस्थिति में बनाए रखा गया ई. की तुलना में faecalis उपभेदों का परीक्षण किया कोलाई OP50 नियंत्रण (चित्रा 3). कुछ बदलाव ई. में से किसी एक तनाव के प्रभाव में है व्यक्तिगत कीड़े पर faecalis, के रूप में त्रुटि सलाखों से देखा. हालांकि, ई. के तनाव का असर अंडा प्रतिधारण भीतर पर faecalisकीड़े की आबादी नियंत्रण से काफी भिन्न है. अंडा प्रतिधारण की डिग्री ई. के विभिन्न प्रकारों से हासिल faecalis परीक्षण भी भिन्न हो सकते हैं. यह विभिन्न प्रभाव प्रत्येक तनाव में अलग विषैलापन कारकों की अभिव्यक्ति के कारण हो सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. पहचान करने L4 सी. मंचन एलिगेंस. ए. L4 मंच सी. एलिगेंस लार्वा वयस्क कीड़े से लंबाई में प्लेटें केवल थोड़ा कम है पर सबसे बड़ी लार्वा मौजूद हैं. L4s बरकरार रखा अंडे (वयस्क कीड़े थोड़ा व्यापक बनाना है). बी के अभाव की वजह से अच्छी तरह से वयस्क, की तुलना में पतली कर रहे हैं. वयस्कों की तुलना में थोड़ा कम कर रहे हैं कि उन लार्वा पहचान करने के बाद, सी. L4-मंचन एलिगेंस आगे में स्थित हल्का आधा चाँद मौके से पहचाने जाते हैंउनके शरीर के मध्य (काला तीर). इस मौके पर छोटे लार्वा (L2 और L3 चरणों) में दिख रही है, लेकिन वयस्क में अनुपस्थित है. सभी छवियों को एक विदारक माइक्रोस्कोप (ए और बी, क्रमशः के लिए 40X और 50X आवर्धन) के लिए मुहिम शुरू की है एक कैमरा के साथ, एन जी एम प्लेटों पर कीड़े के ले जाया गया. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. ब्लीच समाधान सी. घुल समय के साथ एलिगेंस छल्ली. एक मंचन वयस्क कृमि (ए) ब्लीच समाधान की एक छोटी बूंद में रखा गया है. पांच से दस मिनट में, कृमि की छल्ली (बीएफ) को भंग करने के लिए शुरू होता है. छल्ली की सबसे भंग कर रहा है के रूप में, अंडे (एफ काला तीर) दिखाई देने लगते हैं. कीड़ा ए एल एस के अंदर फैट स्टोर ब्लीच में धीरे धीरे भंग, और (एफ, ग्रे तीर) दिखाई रहना ओ. सभी छवियों को एक विदारक माइक्रोस्कोप (40X) के लिए मुहिम शुरू की है एक कैमरा के साथ, एन जी एम प्लेटों पर कीड़े के ले जाया गया. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. कुछ ई. faecalis उपभेदों जोखिम के 40 घंटे के बाद बढ़ा अंडा प्रतिधारण कारण. छह ई. के दो से अवगत कराया कीड़े faecalis उपभेदों (नारंगी सलाखों) कीड़े खिलाया ई. की तुलना में अंडे की अवधारण का एक बढ़ा स्तर से पता चला कोली (OP50) नियंत्रण तनाव (नीले सलाखों). दस कीड़े प्रत्येक परीक्षण में प्रत्येक बैक्टीरियल तनाव खिलाया गया. परीक्षण के अलग अलग दिनों पर तीन प्रतियों में किया गया. * इंगित करता है <0.05 पी (छात्र टी परीक्षण)."> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

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सफलतापूर्वक इस परख प्रदर्शन में सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) सी के परिपुष्ट शेयरों का उपयोग कर परख प्लेट, 3 पर एलिगेंस, 2) संवर्धन बैक्टीरिया का एक प्रकार) सही पहचान ई. के लिए जोखिम के लिए L4 के कीड़े का मंचन faecalis, 4) ई. के लिए जोखिम रखते समय समय विरंजन सभी परीक्षणों और 5 भर में लगातार faecalis) अंडा विघटन को रोकने के लिए दस मिनट से अधिक नहीं होना चाहिए.

इस परख के लिए यह स्वस्थ, परिपुष्ट कीड़े लेने के लिए महत्वपूर्ण है. मातृ भुखमरी उपजाऊपन और संतान 19,20 के विकास को प्रभावित कर सकता है, इसलिए यह कीड़े अच्छी तरह से इस परख प्रदर्शन से पहले कई पीढ़ियों के लिए तंग आ गया है कि महत्वपूर्ण है. कीड़े की एक अच्छी तरह से खिलाया शेयर आसानी से बस एक नया वरीयता प्राप्त एन जी एम प्लेट हर 2-3 दिनों के लिए कुछ वयस्क कीड़े स्थानांतरित द्वारा बनाए रखा है. परख से दो दिन पहले, वयस्क कीड़े परख के लिए उपलब्ध पर्याप्त L4 संतान के क्रम में OP50 के एक ताजा लॉन पर रखा जाना चाहिए.

<पी वर्ग = "jove_content"> यह eiw परख प्लेटें बैक्टीरिया का केवल एक ही प्रकार के विकास को बढ़ावा देने के लिए भी महत्वपूर्ण है कि. ई. faecalis उपभेदों BHI प्लेटों पर बड़े हो रहे थे. स्ट्रेप्टोमाइसिन ई. के खिलाफ चयन करने के लिए प्लेटों के लिए जोड़ा गया वे परख प्लेटें रखरखाव एन जी एम प्लेटों से स्थानांतरित कर रहे हैं के रूप में L4 के कीड़े के साथ स्थानांतरित कर रहा है जो कोलाई OP50,. OP50 भी BHI प्लेटों पर बढ़ता है. , सी. के खिलाफ यदि चयनित नहीं है एलिगेंस BHI प्लेटों पर जबकि बैक्टीरिया के दो प्रकार (ई. कोलाई और ई. faecalis) पर खिलाता. ई. के उपभेदों इस परख में इस्तेमाल faecalis स्ट्रेप्टोमाइसिन लिए प्रतिरोधी रहे हैं. बैक्टीरिया के विभिन्न प्रकार इस परख, एक अलग एंटीबायोटिक, और शायद अलग संस्कृति मीडिया के लिए इस्तेमाल किया गया है, तो चुनाव के जीवाणु के लिए चयन करने के लिए इस्तेमाल किया और ई. के खिलाफ किया जाना चाहिए कोलाई OP50.

सही इस परख के लिए कीड़े मंचन का चयन कई कारणों से महत्वपूर्ण है. सबसे पहले, यह टी के दौरान अंडा प्रतिधारण गिनती करने के लिए महत्वपूर्ण है वह अंडा उत्पादन के समय / स्वयं fertilizing सी. में बिछाने एलिगेंस. अंडा उत्पादन सी. के पहले पांच दिनों के दौरान ही होता है एलिगेंस वयस्कता (40 घंटे बाद L4 के चारों ओर बढ़ता जा) और जल्दी से उसके बाद 4,21 गिरावट आती है. निषेचित अंडे का उत्पादन नहीं है, जबकि वयस्क कीड़े दो से तीन सप्ताह के एक औसत के लिए रहते हैं, तो कई वयस्क कीड़े कम से कम एक सप्ताह के लिए रहते हैं. इसलिए, यह eiw परख अज्ञात उम्र के unstaged वयस्क कीड़े पर नहीं किया जाता है कि यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है.

इसका इस्तेमाल करने के लिए महत्वपूर्ण है दूसरा कारण eiw परख में जानवरों के कीड़े बैक्टीरिया को उजागर किया गया है, जिस पर विकास में समय, विष या दवा कसकर नियंत्रित किया जाता है कि इतना है का मंचन किया. सी. की संस्कृति एलिगेंस आम तौर पर अंडे, एल 1 या L4 के चरणों में सिंक्रनाइज़ कर रहे हैं. L4 मंच क्योंकि चिंता के इस परख के लिए इस्तेमाल किया गया था कि ई. को अब जोखिम कीड़े गर्भवती वयस्कों बनने से पहले faecalis मारक पर नतीजा होगा.

तम्बू "> समय कीड़े की अवधि ब्लीच समाधान में छोड़ दिया जाता है इस समय कृमि से कीड़ा के लिए अलग अलग है, हालांकि कीड़े निषेचित अंडे अंततः ब्लीच से भंग कर रहे हैं., आम तौर पर दस मिनट के अंतर्गत में भंग कर देना चाहिए. नजर रखने के लिए भी महत्वपूर्ण है, लेकिन प्रक्रिया एक सुरक्षात्मक खोल की उपस्थिति के कारण छल्ली के लिए की तुलना में धीमी है. खोल अब से 10-15 मिनट के लिए समाधान में छोड़ अगर ब्लीच द्वारा भंग होना शुरू हो जाएगा.

अंडा प्रतिधारण अंडा उत्पादन और अंडे बिछाने के बीच संतुलन को दर्शाता है. अकेले eiw परख गर्भाशय में बनाए रखा अंडे की संख्या में अंडे का उत्पादन या अंडा बिछाने में परिवर्तन की वजह से है कि क्या भेद नहीं करता. यह एक बैक्टीरियल तनाव या विष के साथ इलाज कीड़े नियंत्रण समूह में उन लोगों की तुलना में कम अंडे बरकरार रहती है तो विशेष रूप से चिंता का विषय है. विशेष रूप से इन मामलों में, एक अनुवर्ती चिंता आकार परख किया जाना चाहिए. चिंता आकार assays का कीड़ा की प्रजनन जीवनकाल 4 पर रखी अंडे की संख्या यों ई. की तरह हल्का रोगजनक जीवाणु उपभेदों faecalis अंडा उत्पादन को बढ़ाने के लिए कार्य करेगा, यह उचित लगता है कि ई. के लिए जोखिम के बाद अंडा प्रतिधारण में वृद्धि faecalis (के रूप में 3 चित्र में देखा) में कमी आई अंडे बिछाने व्यवहार का परिणाम है.

Eiw परख भी बैक्टीरिया अंडा प्रतिधारण बदल सकता है व्यवस्था है जिसके द्वारा निर्धारित नहीं करता है. यह संभव है कि सी. यह एक गरीब खाद्य स्रोत है क्योंकि रोगजनक बैक्टीरिया में बस्तियां और मुंह खोलने अवरुद्ध या द्वारा खिला को प्रभावित करता है क्योंकि एलिगेंस अंडे रखने सकता है. यह बैक्टीरिया उपनिवेश और vulval उद्घाटन ब्लॉक, या अंडे बिछाने प्रणाली में कोशिकाओं के समारोह को प्रभावित कर सकता है कि यह भी संभव है. आगे के विश्लेषण से whi के द्वारा व्यवस्था निर्धारित करने के लिए आवश्यक हैचर्चा अंडा प्रतिधारण बदल दिया है.

इस eiw परख आसानी से अंडे की अवधारण पर यौगिकों के कई प्रकार के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. इसके अलावा, इस परख यह रोगज़नक़ के प्रभाव के लिए आवश्यक या तो मेजबान (सी एलिगेंस) या (ई. faecalis) रोगज़नक़, में, जीन की पहचान करने के लिए एक स्क्रीन में शामिल किया जा सकता है कि काफी सरल है. Eiw परख अंडे बिछाने को विनियमित करने के लिए ही आवश्यक जीन के लिए स्क्रीन करने के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है. सी. एलिगेंस अंडे बिछाने व्यवहार इस तरह सेरोटोनिन और acetylcholine 5-9 के रूप में न्यूरोट्रांसमीटर द्वारा संग्राहक है, और कई न्यूरॉन्स और मांसपेशी समूहों 12 के समन्वित गतिविधि की आवश्यकता है. Eiw assays के गया और न्यूरोट्रांसमीटर संकेत और / या मांसपेशियों की गतिविधि के लिए महत्वपूर्ण जीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जाना जारी है. Eiw assays के एक मात्रात्मक, बजाय गुणात्मक, एक महत्वपूर्ण सी. के विश्लेषण प्रदान एलिगेंस व्यवहार.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

लेखकों ई. की आपूर्ति करने के लिए जून मिडलटन शुक्रिया अदा करना चाहूँगा faecalis उपभेदों और मार्गदर्शन के लिए बैक्टीरिया संस्कृति के साथ. सी. एलिगेंस रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर कार्यक्रम के NIH कार्यालय (P40 OD010440) द्वारा वित्त पोषित है जो CGC, द्वारा प्रदान किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar, ultrapure Affymetrix 10906
Bacto Peptone Becton Dickinson 211677
Bacto Tryptone Becton Dickinson 211705
Brain Heart Infusion dehydrated medium Carolina Biological Supply 781781
C. elegans, N2 strain Caenorhabditis Genetics Center http://www.cbs.umn.edu/cgc
Cholesterol Alfa Aesar A11470
Culture plates for C. elegans Tritech Research Inc. T3308
Culture plates for E. faecalis Fisher Scientific-Fisherbrand 875713
E. coli (OP50) Caenorhabditis Genetics Center http://www.cbs.umn.edu/cgc
E. faecalis strains provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci
by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth;

all strains grew at 44.5 ºC and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars (arabinose, mannitol, methyl-α-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed presumptive identification of all E. faecalis strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux).

Microscope Motic SMZ 168B any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient
Streptomycin sulfate Fisher BioReagents BP910-50
Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco Becton Dickinson 236950
Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL Becton Dickinson 211768
Yeast extract Acros 61180-1000

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References

  1. Horvitz, H. R., Chalfie, M., Trent, C., Sulston, J. E., Evans, P. D. Serotonin and octopamine in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 216, 1012-1014 (1982).
  2. Sawin, E. R. Genetic and cellular analysis of modulated behaviors in Caenorhabditis elegans [dissertation]. Massachusetts Institute of Technology. Cambridge, MA. (1996).
  3. Trent, C. Genetic and behavioral studies of the egg-laying system of Caenorhabditis elegans [dissertation]. Massachusetts Institute of Technology. Cambridge, MA. (1982).
  4. Chase, D. L., Koelle, M. R. Genetic analysis of RGS protein function in Caenorhabditis elegans. Methods Enzymol. 389, 305-320 (2004).
  5. Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 104, 619-647 (1983).
  6. Weinshenker, D., Garriga, G., Thomas, J. H. Genetic and pharmacological analysis of neurotransmitters controlling egg laying in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 15, 6975-6985 (1995).
  7. Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans. Neuron. 21, 203-214 (1998).
  8. Bany, A., Dong, M., Koelle, M. R. Genetic and cellular basis for acetylcholine inhibition of Caenorhabditis elegans egg-laying behavior. J. Neurosci. 23, 8060-8069 (2003).
  9. Dempsey, C. M., Mackenzie, S. M., Gargus, A., Blanco, G., Sze, J. Y. Serotonin (5HT), fluoxetine, imipramine and dopamine target distinct 5HT receptor signaling to modulate Caenorhabditis elegans egg-laying behavior. Genetics. 169, 1425-1436 (2005).
  10. Leung, M. C., Williams, P. L., Bennedetto, A., Au, C., Helmcke, K. J., Aschner, M., Meyer, J. N. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicol. Sci. 106, 5-28 (2008).
  11. Mylonakis, E., Aballay, A. Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions. Infect. Immun. 73, 3833-3841 (2005).
  12. Schafer, W. R. WormBook. WormBook. (2005).
  13. White, J., Southgate, E., Thomson, N., Brenner, S. The structure of the Caenorhabditis elegans nervous system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314, 1-340 (1986).
  14. Desai, C., Garriga, G., McIntire, S. L., Horvitz, H. R. A genetic pathway for the development of the Caenorhabditis elegans HSN motor neurons. Nature. 336, 638-646 (1988).
  15. Garsin, D. A., Sifri, C. D., Mylonakis, E., Qin, X., Singh, K. V., Murray, B. E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. A simple model host for identifying Gram-positive virulence factors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10892-10897 (2001).
  16. Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. A. Salmonella typhmurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans. Curr. Biol. 10, 1539-1542 (2000).
  17. O'Quinn, A. L., Wiegand, E. M., Jeddeloh, J. A. Burkholderia pseudomallei kills the nematode Caenorhabditis elegans using an endotoxin-mediated paralysis. Cell. Microbiol. 3, 381-393 (2001).
  18. Brenner, S. Genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  19. Harvey, S. C., Shorto, A., Orbidans, H. E. Quantitative genetic analysis of life- history traits of Caenorhabditis elegans in stressful environments. BMC Evol. Biol. 8, 15 (2008).
  20. Harvey, S. C., Orbidans, H. E. All eggs are not equal: the maternal environment affects progeny reproduction and developmental fate in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 6, e25840 (2011).
  21. Klass MR, Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mech. Ageing. Dev. 6, 413-429 (1977).
पर बैक्टीरिया के प्रभाव को मापने<em&gt; सी. एलिगेंस</emएक अंडा प्रतिधारण परख का उपयोग&gt; व्यवहार
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Gardner, M., Rosell, M., Myers, E. M. Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay. J. Vis. Exp. (80), e51203, doi:10.3791/51203 (2013).More

Gardner, M., Rosell, M., Myers, E. M. Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay. J. Vis. Exp. (80), e51203, doi:10.3791/51203 (2013).

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