Summary
सेल मुक्त एचआईवी -1 कणों के विपरीत, संक्रमित सीडी 4+ टी कोशिकाओं को प्रभावी ढंग plasmacytoid वृक्ष के समान कोशिकाओं (पीडीसी) द्वारा महसूस कर रहे हैं। यह पांडुलिपि प्रकार मैं IFN की रिहाई के द्वारा मूल्यांकन के रूप में परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) या पृथक पीडीसी पीडीसी द्वारा सहज संवेदन का मूल्यांकन करने के लिए एचआईवी -1 से संक्रमित टी कोशिकाओं के साथ सह सुसंस्कृत हैं, जहां एक विधि का वर्णन है।
Abstract
एचआईवी -1 जन्मजात संवेदन plasmacytoid वृक्ष के समान कोशिकाओं (पीडीसी) से संक्रमित सीडी 4+ टी कोशिकाओं के सीधे संपर्क की आवश्यकता है। इस प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल टी सेल लाइन (MT4) या heterologous प्राथमिक सीडी 4+ टी कोशिकाओं या तो में संक्रमण भावना के लिए हौसले से पृथक मानव परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) या plasmacytoid वृक्ष के समान कोशिकाओं (पीडीसी) का उपयोग करें। उचित संवेदन सुनिश्चित करने के क्रम में, यह PBMC रक्त संग्रह और उपयोग किया जाता है संक्रमित टी कोशिकाओं की कि इष्टतम प्रतिशत के बाद तुरंत अलग कर रहे हैं कि आवश्यक है। इसके अलावा, मल्टी पैरामीट्रिक प्रवाह cytometric धुंधला PBMC नमूने शारीरिक अनुपात में अलग सेल प्रजातियों के होते हैं कि इस बात की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। नियंत्रण की संख्या भी व्यवहार्यता और पीडीसी की कार्यक्षमता का मूल्यांकन करने के लिए शामिल किया जा सकता है। ये टोल की तरह रिसेप्टर्स के नाम से जाना जाता एगोनिस्ट (TLR) रास्ते, के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं का आकलन करने और प्रायोजित की कमी, पुष्टि, विशिष्ट सतह मार्कर की उपस्थिति में शामिलtaneous प्रकार मैं इंटरफेरॉन (IFN) उत्पादन। इस प्रणाली में, हौसले से पृथक PBMCs या पीडीसी 18-22 घंटे के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेट में एचआईवी -1 से संक्रमित कोशिकाओं के साथ सह-सुसंस्कृत हैं। इन सह संस्कृतियों से Supernatants तो HEK-ब्लू IFN-α / β कोशिकाओं में ISGF3 मार्ग के सक्रियण की निगरानी के द्वारा बायोएक्टिव प्रकार मैं IFNs के स्तर को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। प्रायर और सह संस्कृति की स्थिति के दौरान लक्ष्य कोशिकाओं को संक्रमित कोशिकाओं का प्रतिशत, विशिष्ट सतह मार्करों के स्तर, और संक्रमित कोशिकाओं के अंतर हत्या सहित मानकों के एक नंबर, निर्धारित करने के लिए cytometric विश्लेषण प्रवाह के अधीन किया जा सकता है। इन प्रोटोकॉल शुरू में प्रकार मैं IFN उत्पादन का पालन करने के लिए विकसित किया गया है, हालांकि, वे संभावित पीडीसी से रिहा अन्य imuno-modulatory अणुओं का अध्ययन करने और एचआईवी -1 जन्मजात संवेदन गवर्निंग आणविक तंत्र में और अधिक जानकारी हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
प्रकार मैं IFN-उत्पादन पीडीसी वायरल संक्रमण के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति का प्रतिनिधित्व करते हैं, और इस तरह के रूप में सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा को 1 के बीच एक महत्वपूर्ण कड़ी के रूप में काम करते हैं। सेल मुक्त एचआईवी -1 कणों खराब सहज प्रतिरक्षा प्रणाली से पता चला रहे हैं, वहीं एचआईवी -1 से संक्रमित सीडी 4+ टी कोशिकाओं को प्रभावी ढंग पीडीसी 2 से महसूस कर रहे हैं। संवेदन तंत्र तो पीडीसी से वायरस को पकड़ने और internalization के द्वारा पीछा किया जाता है, जो पीडीसी, पर संक्रमित टी सेल और सीडी 4 अणुओं की सतह पर वायरल लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन (gp120) के बीच एक प्रारंभिक संपर्क की आवश्यकता है। TLR7 द्वारा तबादला एचआईवी -1 आरएनए के बाद मान्यता Myd88 / IRF7 मार्ग के सक्रियण चलाता है और अंतत: IFN उत्पादन 3-मैं टाइप करने के लिए ले जाता है। महत्वपूर्ण बात है, TLR9 द्वारा मध्यस्थता है जो पीडीसी में मौजूद दूसरे संवेदन मार्ग, पीडीसी-विशिष्ट सतह मार्कर BDCA2 4 के साथ, वायरल ग्लाइकोप्रोटीन, gp120 की बातचीत से हिचकते हैं।
5 नामक एक और पीडीसी-विशिष्ट सतह निरोधात्मक रिसेप्टर के साथ (भी Tetherin या CD317 नामित) BST2 की सगाई द्वारा संग्राहक जा सकता है। BST2 पीडीसी और कुछ कैंसर कोशिकाओं की सतह पर उच्च स्तर पर व्यक्त की है, लेकिन इस तरह के बी कोशिकाओं, मैक्रोफेज, और टी कोशिकाओं के रूप में अन्य प्रकार की कोशिकाओं में अपेक्षाकृत निचले स्तर पर है। महत्वपूर्ण बात है, BST2 तब्दील सेल लाइनों की संख्या के साथ-साथ मानव और murine मूल 6 के प्राथमिक सेल संस्कृतियों में प्रकार मैं IFN द्वारा प्रेरित किया जा सकता है। इसके अलावा अपनी प्रतिरक्षा नियामक समारोह से, BST2 हाल ही में एचआईवी -1 की रिहाई को बाधित करने के लिए पाया गया था और अन्य संक्रमित कोशिका की सतह 7 पर पार से जोड़ने नवजात वायरस कणों से वायरल कणों छा। एचआईवी -1 के मामले में, वायरस इनकोडिंग गौण प्रोटीन यू (VPU) एक BST2 विरोधी के रूप में कार्य करने के लिए दिखाया गया था। यह VPU, एचआईवी -1 से संक्रमित कोशिकाओं की कोशिका की सतह से उसके तार की साइट BST2 downregulates माना जाता है किगतिविधि हैैं और इस धारणा 8,9 चुनौती दी गई है, हालांकि एक परिणाम के रूप में, वायरल रिहाई को बढ़ाता है और 7 में फैल गया। VPU, की एक बड़ी संख्या के अभाव में पूरी तरह से बनाई और परिपक्व संतान एचआईवी -1 कणों कोशिका की सतह पर रखा जाता है। इन tethered कणों प्रतिरक्षा संवेदन के लिए प्रभावी लक्ष्य का प्रतिनिधित्व कर सकता है कि क्या अभी भी एक खुला सवाल बनी हुई है। इसके अतिरिक्त, यह VPU सतह BST2 स्तरों नियमन द्वारा पीडीसी से प्रकार मैं IFN उत्पादन dysregulate सकता है कि क्या यह स्पष्ट नहीं है।
एचआईवी -1 संवेदन का आकलन तैयार प्रारंभिक अध्ययन आम तौर प्रकार मैं IFN 3,10-12 के गरीब inducers माना जाता है, जो सेल मुक्त एचआईवी -1 कणों का उपयोग किया गया। हाल के अध्ययनों से PBMCs और पीडीसी कुशलता से एचआईवी संक्रमित सीडी 4+ टी lymphocytes 2,13,14 भावना का सुझाव है कि यह देखते हुए कि हम यहाँ इन विट्रो में एचआईवी -1 से संक्रमित कोशिकाओं की मान्यता पर पीडीसी से शुरू हो रहा सहज प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए एक सरल विधि का वर्णन है।
Protocol
सामान्य नोट्स
यह भी नियंत्रित जीवाणु संक्रमण PBMCs से महसूस किया जा सकता है, क्योंकि किसी भी एंटीबायोटिक के बिना संस्कृति में कोशिकाओं को रखने के लिए महत्वपूर्ण है। बैक्टीरियल घटकों के इस तरह के संवेदन विशिष्ट एचआईवी -1 संवेदन से शुरू हो रहा है कि उस से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है कि एक पृष्ठभूमि इंटरफेरॉन उत्पादन को प्रेरित करेगा। इसके अलावा, सभी कोशिकाओं को नियमित माइकोप्लाज्मा संदूषण के अभाव के लिए परीक्षण किया जाना है।
जब भी संभव हमेशा endotoxin मुक्त समाधान का उपयोग करें।
विभिन्न कोशिकाओं के प्रवाह cytometric लक्षण वर्णन सह संस्कृतियों में प्रयोग की जाने वाली (PBMCs, पीडीसी, MT4 और सीडी 4+ टी कोशिकाओं) एक वैकल्पिक कदम है, लेकिन यह एक भी प्रयोग की उचित व्याख्या के लिए आवश्यक बहुमूल्य जानकारी प्रदान कर सकते हैं के बाद से अत्यधिक की सिफारिश की।
संक्रमित लक्ष्य कोशिकाओं के 1. तैयारी
- 1640 RPMI मेडी में मानव सीडी 4+ टी सेल लाइन MT4 बनाए रखेंएक RPMI 1640 पूरा माध्यम के रूप में अब से संदर्भित 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), के साथ पूरक।
- प्राथमिक सीडी 4+ टी कोशिकाओं के अलगाव।
- घनत्व ढाल centrifugation द्वारा मानव परिधीय रक्त से मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को अलग।
- निर्माता की सिफारिशों के बाद एक सीडी 4+ टी कोशिकाओं नकारात्मक चयन किट का उपयोग करते हुए सीडी 4+ टी lymphocytes अलग।
- RPMI 1640 पूरा मध्यम में 48 घंटे के लिए पीएचए एल (5 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ सीडी 4+ टी लिम्फोसाइटों सक्रिय करें और फिर बनाए रखने कोशिकाओं पुनः संयोजक आईएल -2 (100 यू / एमएल) के साथ पूरक। प्राथमिक टी कोशिकाओं 5 दिनों के बाद अलगाव को संक्रमित।
- लक्ष्य कोशिकाओं (MT4 के टी सेल लाइन या heterologous प्राथमिक सीडी 4+ टी कोशिकाओं) का संक्रमण।
- एचआईवी -1 वायरस के साथ टी कोशिकाओं, सह संस्कृति को संक्रमित करने के लिए दो दिन पहले। यहाँ वर्णित विशिष्ट उदाहरण में pNL4.3-GFP_ires_Nef जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) या pNL4.3-GFP_ires_Nef डेल्टा VPU (dVpu) वायरस का इस्तेमाल किया गया। ये वायरल उपभेदों जीआरई का प्रतिनिधित्वफ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) VPU को व्यक्त करने की क्षमता में ही मतभेद है कि isogenic संक्रामक आणविक क्लोन -marked एन।
- संक्रमण (MOIs) के विभिन्न multiplicities का प्रयोग करें और सह संस्कृतियों के लिए संक्रमण के समान स्तर के साथ संस्कृतियों का चयन करें। सह संस्कृति के दिन cytometry, संक्रमण के एक मार्कर के रूप में प्रवाह द्वारा GFP + कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करते हैं। सह संस्कृतियों के लिए 20-50% संक्रमित कोशिकाओं की एक सीमा के साथ ही संस्कृतियों का प्रयोग करें।
वैकल्पिक कदम: ऐसे BST2, और सीडी 4 के रूप में ब्याज के अणुओं / ligands की सतह अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए इस बिंदु पर प्रवाह cytometric धुंधला प्रदर्शन करना। कोशिका की सतह धुंधला के लिए, विरोधी CD4_PerCP / Cy5.5 की 1 μl और विरोधी BST2_A660 की 1 μl जोड़ने, धोने के समाधान के 100 μl में 0.5 x 10 6 टी कोशिकाओं resuspend। धोने के समाधान प्रवाह cytometry के साथ धोने से पहले, 4 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए ट्यूबों सेते हैं। अध्ययनों VPU की मध्यस्थता BST2 विरोध की भूमिका का मूल्यांकन करने के उद्देश्य से कर रहे हैं, एक एचआईवी -1 कण प्रदर्शनइस समय रिलीज परख के रूप में पहले 15 में वर्णित है।
कोशिकाओं (साबुत PBMCs या समृद्ध पीडीसी) संवेदन 2. अलगाव और संवर्धन
नोट: PBMCs संवेदन के लिए उपयोग किया जाता है, रक्त संग्रह के बाद आधे घंटे के भीतर अलगाव शुरू करने और एक समय पर ढंग से यह आचरण। सह संस्कृतियों या पीडीसी संवर्धन के लिए तुरंत PBMCs का प्रयोग करें।
- घनत्व ढाल centrifugation द्वारा मानव परिधीय रक्त से मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को अलग।
वैकल्पिक कदम: कि हौसले से पृथक PBMCs शारीरिक अनुपात में अलग सेल प्रजातियों को शामिल पुष्टि करने के लिए बहु-पैरामीट्रिक फ्लो धुंधला प्रदर्शन करना। कोशिका की सतह धुंधला के लिए, एफसी को अवरुद्ध समाधान के 100 μl में 10 6 PBMCs resuspend, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं। अवरुद्ध करने के बाद, विरोधी CD3_Pacific ब्लू, (माइलॉयड कोशिकाओं के लिए) विरोधी CD14-PE_Texas लाल का 1 μl, विरोधी BDCA2_APC के 4 μl और (पीडीसी के लिए) विरोधी ILT7_PE की 1 μl (टी कोशिकाओं के लिए) के 1 μl जोड़ें। सेतेधोने के समाधान प्रवाह cytometry के साथ धोने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए ट्यूब,। - निर्माता की सिफारिशों के बाद एक पीडीसी नकारात्मक चयन किट का उपयोग कर, पीडीसी समृद्ध। यह तेजी से काम ठंड कोशिकाओं रखने के लिए, और पूर्व ठंडा समाधान का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है। यह अधिक से अधिक पीडीसी गतिविधि सुनिश्चित करने के रूप में अच्छी तरह से कोशिका की सतह और गैर विशिष्ट सेल लेबलिंग पर एंटीबॉडी के कैपिंग कर पाएगा।
- पवित्रता, संवर्धन का प्रतिशत, और (जैसे ILT7 और BDCA2 के रूप में) pDC- विशिष्ट सतह मार्कर के रिश्तेदार मात्रा पुष्टि करने के लिए हौसले से पृथक पीडीसी की बहु पैरामीट्रिक प्रवाह cytometric विश्लेषण करते हैं। कोशिका की सतह धुंधला के लिए, एफसी को अवरुद्ध समाधान के 100 μl में 10 4 पीडीसी resuspend, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं। अवरुद्ध करने के बाद, विरोधी CD3_Pacific ब्लू की 1 μl, विरोधी CD14_PE_Texas लाल का 1 μl, विरोधी BDCA2_APC के 4 μl और विरोधी ILT7_PE की 1 μl जोड़ें। (पीबीएस, 5 धोने समाधान प्रवाह cytometry के साथ धोने से पहले, 4 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए ट्यूबों सेतेमिमी EDTA, 5% FBS)। 40% पीडीसी पवित्रता का एक न्यूनतम (प्रारंभिक सामग्री 0.4% पीडीसी है, तो यह एक 100 गुना संवर्धन के बराबर होगा) की सिफारिश की है।
संक्रमित सीडी 4+ टी कोशिकाओं और सेंसिंग कोशिकाओं (साबुत PBMCs या समृद्ध पीडीसी) 3. सह संस्कृति
- अच्छी तरह से प्रति (10 6 कोशिकाओं / एमएल में पतला) संक्रमित टी कोशिकाओं के 30 μl में साथ PBMCs के 220 μl या पीडीसी के 220 μl (850,000 कोशिकाओं / एमएल में पतला) (100,000 500,000 करने के लिए कोशिकाओं से लेकर एक एकाग्रता में / एमएल) मिक्स यू-नीचे 96 अच्छी तरह से थाली।
- अकेले नियंत्रण, प्लेट PBMCs या पीडीसी और टी कोशिकाओं के रूप में। 1640 RPMI पूरा मध्यम के साथ अच्छी तरह से करने के लिए 250 μl में मात्रा समायोजित करें।
- TLR7 और TLR9 रास्ते के नाम से जाना जाता एगोनिस्ट के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं का आकलन करें। यह अंत करने के लिए, PBMCs की प्लेट 220 μl एक यू के नीचे 96 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति या (100000 500000 करने के लिए कोशिकाओं / एमएल से लेकर एक एकाग्रता में) पीडीसी के 200 μl (850,000 कोशिकाओं / एमएल में पतला) और (TLR7 एगोनिस्ट जोड़ने आईएमआईquimod, अंतिम एकाग्रता: 2.5 माइक्रोग्राम / एमएल) या TLR9 एगोनिस्ट (ODN 2216 सीपीजी-ए, अंतिम एकाग्रता: 5 माइक्रोन)। 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं और 5% सीओ 2 के 18-22 घंटे के लिए और नीचे वर्णित सह संस्कृतियों के लिए इसी तरह के एक तरीके से उन्हें प्रक्रिया।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर सह संस्कृतियों सेते हैं और 5% सीओ 2 18-22 घंटे के लिए, और फिर एक वि नीचे 96 अच्छी तरह से थाली को हस्तांतरण। 400 x जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
- एक फ्लैट नीचे 96 अच्छी तरह से थाली supernatants स्थानांतरण। Supernatants -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत या तुरंत प्रकार मैं IFN का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
- 2% paraformaldehyde में सह-संवर्धित कोशिकाओं Resuspend और प्रवाह cytometry का उपयोग उन्हें विश्लेषण। आकार और दानेदार में मतभेद के कारण, MT4 कोशिकाओं आगे-बितर (एफएस) प्रोफाइल बनाम उनके पक्ष तितर बितर (एसएस) पर आधारित PBMCs या पीडीसी से आसानी से प्रतिष्ठित हैं। प्राथमिक टी कोशिकाओं लक्ष्य संक्रमित कोशिकाओं के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं, ये ऐसे CSFE के रूप में, किसी भी सेल पर नजर रखने वाली डाई के साथ पूर्व सह-संस्कृति कलंकित किया जा सकता।
- HEK-ब्लू IFN-α / β संवाददाता कोशिकाओं का उपयोग बायोएक्टिव प्रकार मैं IFN का मापन।
नोट: इन कोशिकाओं को मैं मार्ग संकेत IFN एक पूरी तरह से सक्रिय प्रकार प्राप्त करने के लिए मानव STAT2 और IRF9 जीन के साथ HEK293 कोशिकाओं के स्थिर अभिकर्मक द्वारा उत्पन्न किया गया। उन्होंने यह भी inducible ISG54 प्रमोटर β / IFN-α के नियंत्रण में स्रावित क्षारीय फॉस्फेट (SEAP) पत्रकार जीन होते हैं। प्रकार मैं IFN के साथ इन कोशिकाओं की उत्तेजना जे ए / स्टेट / ISGF3 मार्ग को सक्रिय करता है और SEAP के उत्पादन को प्रेरित करता है।- 10% FBS के साथ पूरक DMEM में HEK-ब्लू IFN-α / β कोशिकाओं को बनाए रखें। 180 μl के अंतिम मात्रा में, एक फ्लैट नीचे 96 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति 50,000 कोशिकाओं के घनत्व पर उन्हें थाली।
- दो प्रतियों में प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए सह संस्कृति सतह पर तैरनेवाला के 20 μl जोड़ें। प्रत्येक प्लेट भी आंतरिक मानक नियंत्रण का एक सेट (मानव IFNα, 2500 यू / एमएल एमएल 100 यू / से अंतिम एकाग्रता) की आवश्यकता है। 18 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में प्लेटें सेते-22 घंटा।
- एंजाइम की उपस्थिति में बैंगनी / नीले रंग के लिए गुलाबी से बदलता है जो quanti ब्लू समाधान का उपयोग क्षारीय फॉस्फेट गतिविधि के स्तर को निर्धारित करते हैं। निर्माता की सिफारिशों का पालन quanti ब्लू तैयार करें। एक फ्लैट नीचे 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए इस समाधान के 180 μl जोड़ें। प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से भी प्रेरित HEK-ब्लू IFN-α / β कोशिकाओं supernatants के 20 μl जोड़ने के लिए, और रंग मानक IFN नियंत्रण कुओं में विकसित करता है जब तक एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली सेते हैं।
- 620-655 एनएम पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग SEAP के स्तर का मूल्यांकन और IFN मानक वक्र के रैखिक भाग से एक्सट्रपलेशन द्वारा प्रकार मैं IFN की एकाग्रता का निर्धारण।
Representative Results
चित्रा 1 में वर्णित प्रणाली सह संस्कृति एचआईवी -1 जन्मजात संवेदन की एक नियंत्रित अध्ययन के लिए अनुमति देता है। कारण प्राथमिक कोशिकाओं के चर प्रकृति के कारण, यह माइलॉयड और टी कोशिकाओं (क्रमशः CD14 + और CD3 +) के सामान्य अनुपात में इस तरह के चित्र 2A में दिखाए गए उदाहरण में, के रूप में मनाया जाता है कि महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, (गैर सक्रिय टी कोशिकाओं की तुलना में अधिक है FS और उच्च CD3 स्तर) सक्रिय टी कोशिकाओं का केवल एक कम संख्या हौसले से पृथक PBMCs संस्कृतियों में वांछित हैं। विभिन्न सेल प्रकार के बीच असामान्य अनुपात के साथ PBMCs की वजह से चल रहे एक संक्रमण का एक परिणाम के रूप में एक पहले से ही सक्रिय phenotype के लिए अक्सर इन विट्रो, संभावना में एक उचित सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया बढ़ते के काबिल नहीं हैं। सबसे महत्वपूर्ण बात, पीडीसी के रिश्तेदार प्रतिशत चित्रा 2 बी में दिखाया गया के रूप में मूल्यांकन किया जाना चाहिए। यह प्रतिशत 0.2 से 1.2% करने के लिए अलग-अलग हो सकता है, एक असामान्य संवेदन फेनोटाइप भी extre दोनों के साथ मनाया जाता हैइस श्रृंखला के एमईएस। चित्रा 2 बी (92% और 72%) में से दो उदाहरण के रूप में देखा नकारात्मक चयन का उपयोग पीडीसी के संवर्धन अक्सर, 50-95% पीडीसी पवित्रता अर्जित करता है। कुल मिलाकर प्रयोग के लिए एक प्रोटोटाइप उदाहरण के आंकड़े 3 और 4 में दिखाया गया है। इस उदाहरण में, MT4 कोशिकाओं सह संस्कृति (चित्रा 3) के समय में 30% संक्रमण को प्राप्त करने के pNL4.3-GFP_ires_Nef गुम्मट या डेल्टा VPU से संक्रमित थे। पहले से वर्णित है, केवल गुम्मट वायरस से संक्रमण के सतह BST2 की एक महत्वपूर्ण नीचे विनियमन (चित्रा 3 बी) में हुई। कारण आकार और दाने की शक्ल में अपने मतभेदों को, MT4 कोशिकाओं फ्लो (चित्रा 4 ए) द्वारा PBMCs से आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। सह संस्कृति ऊष्मायन के बाद, प्रकार मैं IFN (चित्रा 4 बी) के एचआईवी -1 से संक्रमित कोशिकाओं जारी की महत्वपूर्ण मात्रा के संपर्क में जाना जाता TLR7 या TLR9 एगोनिस्ट और PBMCs के साथ संपर्क में केवल PBMCs। कोई IFN PBMCs सह घन में, अकेले PBMCs में पाया गया थानकली संक्रमित MT4 कोशिकाओं के साथ ltured, या अकेले संक्रमित MT4 कोशिकाओं (चित्रा 4 बी) में। यहाँ प्रस्तुत उदाहरण में, PBMCs से एचआईवी -1 से संक्रमित MT4 कोशिकाओं की जन्मजात संवेदन काफी VPU की उपस्थिति में कम किया जा पाया गया।
चित्रा 1:। प्रयोगात्मक डिजाइन के योजनाबद्ध सिंहावलोकन समर्थन: सतह पर तैरनेवाला बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: हौसले से पृथक PBMCs और Enr की प्ररूपी लक्षण वर्णनiched पीडीसी। (ए) माइलॉयड कोशिकाओं और एक स्वस्थ दाता से अलग PBMCs में मनाया टी कोशिकाओं की सामान्य वितरण (माइलॉयड कोशिकाओं का प्रतिशत% 55-65% के बीच और टी कोशिकाओं 10-20 के बीच सीमा होनी चाहिए)। PBMCs नमूना की सतह CD14 (माइलॉयड वंश मार्कर) और CD3 (टी सेल मार्कर) समझते हैं कि fluorophore संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग दाग रहे थे। (बी) पीडीसी की प्ररूपी लक्षण वर्णन। संवर्धन पीडीसी से पहले PBMCs के भीतर कोशिकाओं की कुल संख्या (दिखाए गए उदाहरण में 0.99%) की 0.2-1.2% के बीच का प्रतिनिधित्व करते हैं। इन कोशिकाओं को कोशिका की सतह पर उपस्थित ऐसी BDCA2 और ILT7 के रूप में विशिष्ट मार्कर, की अभिव्यक्ति के आधार पर पहचाना जा सकता है। नकारात्मक चयन काफी पीडीसी की संख्या को समृद्ध और ऐसे CD14 + माइलॉयड कोशिकाओं (संवर्धन दिखाया दो उदाहरण में 92% और 72% तक पहुँचने) के रूप में संभावित हानिकारक संदूषण को खत्म करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Cliबड़ी छवि को देखने के लिए यहां सी.के.।
चित्रा 3:। PNL4.3-GFP_ires_Nef गुम्मट या dVpu से संक्रमित MT4 संस्कृतियों के भीतर संक्रमित कोशिकाओं के एचआईवी -1 से संक्रमित लक्ष्य MT4 कोशिकाओं की विशेषता (ए) का प्रतिशत GFP सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत के द्वारा निर्धारित है। संक्रमित कोशिकाओं में (बी) BST2 कोशिका की सतह अभिव्यक्ति सतह धुंधला के बाद मूल्यांकन किया गया था। ग्रे भरा histograms पूर्व प्रतिरक्षा खरगोश सीरम (बेदाग नियंत्रण) के साथ दाग नकली संक्रमित कोशिकाओं प्रतिनिधित्व करते हैं; शेष histograms विरोधी BST2 पॉलीक्लोनल खरगोश सीरम के साथ दाग कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। ठोस लाइनों के साथ histograms नियंत्रण GFP नकारात्मक (neg) कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं; बिंदीदार लाइनों के साथ histograms संक्रमित GFP सकारात्मक (पीओएस) कोशिकाओं के अनुरूप है। फ्लू मतलबorescence तीव्रता (एमएफआई) मूल्यों प्रत्येक नमूना के लिए संकेत कर रहे हैं। प्रवाह cytometry चित्रा 2 में वर्णित के रूप में प्रदर्शन किया और विश्लेषण किया गया था। बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4:। हौसले से पृथक PBMCs और संक्रमित MT4 टी कोशिकाओं के सह संस्कृति PBMCs और MT4 टी कोशिकाओं के बीच अकेले MT4 टी कोशिकाओं के लिए मनाया एफएस / एस एस प्रोफाइल, अकेले PBMCs, या सह संस्कृतियों प्रवाह cytometry (ए) से तुलना। कारण आकार और दाने की शक्ल में मतभेद के कारण, MT4 टी कोशिकाओं प्रवाह cytometry का उपयोग सह संस्कृतियों में PBMCs से आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। (बी) TLR साथ PBMCs की उत्तेजना के बाद जारी प्रकार मैं IFN की राशि का प्रतिनिधि उदाहरण7 या TLR9 एगोनिस्ट (पहले), या नकली या pNL4.3-GFP_ires_Nef गुम्मट या dVpu से संक्रमित संकेत MT4 कोशिकाओं के साथ सह संस्कृतियों के बाद। कच्चे डेटा आयुध डिपो के रूप में 650 मूल्यों दिखाया गया है और उनके इसी converseion। / एमएल यू में व्यक्त IFN एकाग्रता-मैं टाइप करने के लिए बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Discussion
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल हमारे ताजा रिपोर्ट में 18 में वर्णित है, VPU को व्यक्त करने की क्षमता में ही मतभेद है कि GFP टैग एचआईवी -1 वायरस से संक्रमित टी कोशिकाओं की संवेदन उपाय। हालांकि, इन तरीकों को आसानी से संभावित जन्मजात संवेदन मिलाना सकता है कि अन्य वायरल जीनों की कमी untagged वायरस के रूप में अच्छी तरह के रूप में वायरस की संवेदन अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। GFP व्यक्त नहीं करते इस्तेमाल किया वायरस, संक्रमित लक्ष्य कोशिकाओं का प्रतिशत ऐसे पी 24 (capsid) के रूप में, इंट्रासेल्युलर धुंधला-संस्कृति सीओ और cytometry या पी 24 एलिसा द्वारा प्रवाह करने से पहले एक और साधन के द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, इन प्रोटोकॉल उपलब्ध सेल लाइनों और प्राथमिक कोशिकाओं की एक किस्म सहित विभिन्न लक्ष्य टी कोशिकाओं के साथ प्रयोग किया जा सकता है।
एचआईवी -1 संवेदन अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जल्दी के तरीके की तुलना में जब इस पांडुलिपि में वर्णित विधि लाभ का एक नंबर है। पहला और सबसे महत्वपूर्ण यह समूहों की एक संख्या है कि सेल मुक्त एचआईवी -1 पी द्वारा स्थापित किया गया हैलेख प्रकार मैं IFN 2,13,14 के गरीब inducers हैं। इसके अलावा, प्रारंभिक अध्ययन उत्पादित प्रकार मैं IFN की राशि यों पुराने IFNα एलिसा आधारित विधियों पर भरोसा किया। इस पहचान तकनीक की एक सीमा है IFNα और IFNβ के अन्य प्रकार की अनदेखी करते हुए पुराने IFNα एलिसा किट की सबसे केवल, IFNα का एक प्रकार है कि उपाय है। वर्णित संवाददाता सेल लाइनों का उपयोग एक बार में मापा जा सकता है मानव प्रकार मैं IFNs के सभी बायोएक्टिव रूपों की एकाग्रता के रूप में इस सीमा पर काबू। तकनीक IFN एलिसा किट की नई पीढ़ी की तुलना में और प्रकार मैं IFN की बड़ी मात्रा में आसानी से पता लगाया जा सकता है कई दाताओं के लिए कम खर्चीला, अत्यधिक संवेदनशील है। फिर भी, इस प्रोटोकॉल आसानी से ऐसे ELISAs के रूप में अन्य प्रकार मैं IFN पढ़ने के लिए बाहर के तरीकों के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
महत्वपूर्ण कदम: यह सभी सेलुलर घटकों (लक्ष्य और प्रभावोत्पादक दोनों) की गुणवत्ता में कसकर नियंत्रित किया कि महत्वपूर्ण है। संभावित संदूषण, तब भी जब asymptomatic, निगरानी और नियंत्रित करने की जरूरत है। जैसा कि हम पहले उल्लेख किया है, स्पर्शोन्मुख जीवाणु संक्रमण एंटीबायोटिक नियंत्रित है, और इस तरह के माइकोप्लाज्मा के रूप में संभावित अन्य इंट्रासेल्युलर रोगजनकों, एचआईवी -1 संक्रमण, प्रकार मैं IFN की अर्थात् उत्पादन के बाद मनाया लोगों के समान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न कर सकते हैं। इसके अलावा, सभी अभिकर्मकों एलपीएस या अन्य संभावित endotoxins से मुक्त होने की जरूरत है। मानव नमूनों अक्सर सामान्य संवेदन को प्रभावित कर सकता है, जो अंतर्निहित चल रहे संक्रमण, द्वारा primed किया जा सकता है, क्योंकि इसी तरह, PBMCs और पीडीसी की निगरानी के लिए भी महत्वपूर्ण है। हम हमेशा प्रस्तावित नकारात्मक नियंत्रण, नकली संक्रमित कोशिकाओं के साथ इस तरह के लक्ष्य कोशिकाओं के अभाव के साथ-साथ सह संस्कृतियों शामिल करने की अनुशंसा। संक्रमित कोशिकाओं की व्यवहार्यता भी प्रकार मैं IFN apoptotic कोशिकाओं 2,14 के साथ सह-संस्कृति का पालन का उत्पादन नहीं कर रहा है के बाद से उचित पीडीसी संवेदन के लिए महत्वपूर्ण है।
तकनीक का एक महत्वपूर्ण सीमा हौसले से पृथक प्राथमिक कोशिकाओं के लिए की जरूरत है। यह प्रक्रिया नहीं थीया तो पहले से जमे हुए या संस्कृति में रखा गया था कि PBMCs या पीडीसी उपयोग कर परीक्षण किया। PBMCs के अलगाव श्रम गहन है और इन कोशिकाओं को एक बहुत ही सीमित देता है। मानव रक्त के साथ काम कर रहा है, जबकि इसके अलावा, रक्त जनित रोगज़नक़ के खिलाफ की रक्षा करने के लिए मानक प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाना चाहिए। हौसले से अलग मानव कोशिकाओं से जुड़े काम के साथ जुड़े परिवर्तनशीलता के कई स्रोतों अक्सर कर रहे हैं। उनमें से दाता-से-दाता से सामना करना इन कोशिकाओं को अलग करने के लिए लागू विभिन्न प्रक्रियाओं, और विरासत में मिला परिवर्तनशीलता हैं। यह दाता के बीच परिवर्तनशीलता से बचने के लिए असंभव है, इस तरह के TLR7 और TLR9 रास्ते के नाम से जाना जाता एगोनिस्ट के जवाब मापने के रूप में सुझाव दिया सकारात्मक नियंत्रण, का उपयोग करते हैं, इन प्रयोगों के लिए एक महत्वपूर्ण आंतरिक नियंत्रण प्रदान करेगा। हम एक संवेदनशील TLR7 मार्ग एचआईवी -1 3 के खिलाफ एक उचित प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक है, जबकि TLR9 मार्ग की एगोनिस्ट के लिए एक मजबूत प्रतिक्रिया, एक स्वस्थ पीडीसी प्रतिक्रिया के साथ जोड़ा जा सकता है कि मनाया।
2 अन्य, के आधार पर एस एस = "jove_content">। प्रयोगात्मक डिजाइन आवश्यकता है यह तो कोशिकाओं चयन प्रक्रिया के बाद एंटीबॉडी से मुक्त रहने के रूप में हालांकि, नकारात्मक चयन (विशिष्ट पीडीसी सतह मार्कर की कमी की जरूरत है, जहां संदर्भ में उदाहरण के लिए), सकारात्मक चयन पर बेहतर है। पृथक पीडीसी संस्कृति में तेजी से apoptosis से गुजरना। इन कोशिकाओं की आवश्यकता है कि प्रयोगों समय की विस्तारित अवधि के लिए सुसंस्कृत होने के लिए, संस्कृति मीडिया आईएल -3 के साथ पूरक हो सकते हैं। इस साइटोकाइन पीडीसी प्रसार लाती है और उनके एपोप्टोसिस 16 को रोकता है। यह पीडीसी परिपक्वता या भेदभाव करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के बाद हालांकि, आईएल -3 उपयोग कसकर नियंत्रित किया जाना चाहिए।
यहाँ वर्णित विधि जन्मजात संवेदन के दौरान शामिल प्रारंभिक कदम विश्राम करने के क्रम में हौसले से पृथक PBMCs या पीडीसी के साथ लक्ष्य एचआईवी -1 से संक्रमित कोशिकाओं को जोड़ती है। इस विधि निस्संदेह एक्सप्लोरेशन के लिए उपयोगी हो जाएगाएचआईवी संक्रमण के साथ जुड़े ई जल्दी सहज प्रतिरक्षा घटनाओं। संबद्ध प्रोटोकॉल प्रकार मैं IFN मापने के उद्देश्य से कर रहे हैं, वे आसानी से संक्रमित कोशिकाओं की मान्यता पर पीडीसी से रिहा अन्य बायोएक्टिव अणुओं को मापने के लिए संशोधित किया जा सकता है। ये शामिल हो सकते हैं: प्रकार तृतीय IFN (IFN-λ), और chemokines CXCL10, CCl4, और CCL5 17 (जैसे टीएनएफ-α और आईएल 6) के रूप में समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स।
Acknowledgments
हम फ्लो और सेल छँटाई प्रयोगों के दौरान विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए ई Massicotte और जे भगवान का धन्यवाद। इसके अलावा, हम रक्त के नमूने उपलब्ध कराने के लिए IRCM क्लिनिक कर्मचारियों और सभी दानदाताओं का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। परिधीय रक्त के नमूनों Institut डी Recherches Cliniques डी मॉन्ट्रियल (IRCM) के अनुसंधान नैतिकता समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित अनुसंधान प्रोटोकॉल के तहत हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार सूचित लिखित सहमति दे दी है जो स्वस्थ वयस्क दानदाताओं से प्राप्त किया गया। निम्नलिखित अभिकर्मकों एनआईएच एड्स अभिकर्मक कार्यक्रम, एड्स, NIAID, एनआईएच के डिवीजन के माध्यम से प्राप्त किया गया: डॉ डगलस रिचमैन से MT4 कोशिकाओं; और मानव आरआईएल -2 डॉ मौरिस गेटली, हॉफमन से - ला रोश इंक
डॉ कोहेन मानव Retrovirology में कनाडा अनुसंधान चेयर के प्राप्तकर्ता है। इस काम के डॉ कोहेन के CIHR (CIHR 111,226) से और Fonds डे अति सूक्ष्म डु क्यूबेक-Santé (FRQ-एस) डा Bego और डॉ कोहेन को एड्स नेटवर्क से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MT4 cells | NIH AIDS Reagent Program | 120 | This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT-4 from Dr. Douglas Richman. |
| HEK-Blu IFN-α/β reporter cells | Invivogen | HKB-IFNAB | |
| RPMI | Wisent | 350-000-CL | |
| DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
| FBS | Wisent | 080-150 | |
| Ficoll-Pâque Plus | Myltenyi | 17-1440-03 | |
| CD4+ T cell isolation kit II | Myltenyi | 130-091-155 | |
| Diamond Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II | Myltenyi | 130-097-240 | |
| PHA-L | Sigma-Aldrich | O2769 | |
| Human rIL-2 | NIH AIDS Reagent Program | 136 | This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: Human rIL-2 from Dr. Maurice Gately, Hoffmann - La Roche Inc. |
| Imiquimod | Invivogen | TLRL-IMQS | |
| ODN 2216 CpG-A | Hycult Biotec | HC4037 | |
| Human IFNα | PBL Interferon source | 11100-1 | |
| QUANTI-Blue | Cedarlane | REP-QB2 | |
| Flow cytometry (Antibodies/reagents) | |||
| Fc blocking solution (composition below): | Note: make in washing solution (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS) | ||
| 10% Goat serum | Sigma-Aldrich | G 9023 | |
| 10% Rabbit serum | Sigma-Aldrich | R 9133 | |
| 10% Mouse serum | Sigma-Aldrich | M 5909 | |
| 2.5 mg/ml human IgG | Sigma-Aldrich | I 4506 | |
| anti-CD3_Pacific Blue | Biolegend | 300417 | |
| anti-CD14_PE-TxRed | Life Technologie | MHCD1417 | |
| anti-BDCA2_APC | Myltenyi | 130-090-905 | |
| anti-ILT7_PE | Biolegend | 326408 | |
| anti-CD4_PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 317427 | |
| anti-BST2_Alexa 660 | eBioscience | 50-3179 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P 6148 | |
| Cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Cyan ADP instrument | Beckman Coulter | CY20030 |
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