Summary
בניגוד לחלקיקים HIV-1 ללא סלולריים, תאי CD4 + T נגוע הם חשו ביעילות על ידי תאים דנדריטים plasmacytoid (PDC). כתב יד זה מתאר שיטה שבה תאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) או pDCs המבודד הם שיתוף תרבותיים עם HIV-1 תאי T נגועים כדי להעריך חישה מולדת על ידי pDCs כפי שהוערכו על ידי שחרורו של הסוג-אני IFN.
Abstract
HIV-1 חישה מולדת דורשת מגע ישיר של תאים מסוג CD4 + T נגועות בתאים דנדריטים plasmacytoid (PDC). על מנת ללמוד את התהליך הזה, הפרוטוקולים המתוארים כאן להשתמש בתאים מבודדים טרי אנושיים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) או תאים דנדריטים plasmacytoid (PDC) לחוש זיהומים באו קו T תא (MT4) או תאי CD4 + T Heterologous העיקריים. על מנת להבטיח חישה נכונה, זה חיוני כי PBMC מבודדים מייד לאחר איסוף דם ושהאחוז האופטימלי של תאי T נגועים משמש. יתר על כן, מכתים התזרים cytometric רב פרמטרית ניתן להשתמש כדי לאשר כי דגימות PBMC מכילות את שושלות תאים השונות ביחסים פיסיולוגיים. מספר הפקדים יכול להיכלל גם להעריך את הכדאיות ואת הפונקציונליות של pDCs. אלה כוללים, הנוכחות של סמני משטח ספציפיים, הערכת תגובות הסלולר אגוניסט הידוע של רצפטורים אגרה-כמו (TLR) מסלולים, ומאשר חוסר sponייצור taneous סוג אני אינטרפרון (IFN). במערכת זו, PBMCs או pDCs המבודדים טרי הם שיתוף תרבותי עם HIV-1 תאים נגועים ב 96 צלחות גם ל18-22 שעות. Supernatants משיתוף תרבויות אלה משמשים לאחר מכן כדי לקבוע את הרמות של IFNs סוג אני ביו ידי ניטור ההפעלה של מסלול ISGF3 בתאים / β IFN-α HEK-הכחול. לפני ובמהלך תנאי שיתוף תרבות, יכולים להיות נתונה תאי יעד לניתוח תזרים cytometric לקבוע מספר הפרמטרים, ביניהם אחוז התאים הנגועים, הרמות של סמני משטח ספציפיים, והרג ההפרש של תאים נגועים. אמנם, פרוטוקולים אלה פותחו בתחילה כדי לעקוב ייצור מסוג אני IFN, הם עלולים לשמש כדי לחקור מולקולות imuno-modulatory אחרים שוחררו מpDCs ולהשיג תובנה נוספת לתוך המנגנונים המולקולריים השולטים HIV-1 חישה מולדת.
Introduction
pDCs IFN-ייצורי-הקלד מייצג את קו הגנה הראשון מפני זיהומים נגיפיים, ובתור שכזו ישמש כקישור חיוני בין חסינות מולד אדפטיבית 1. בעוד חלקיקי HIV-1-תא ללא מזוהים היטב על ידי מערכת החיסון המולדת, תאי CD4 + T נגוע HIV-1 הם חשו ביעילות על ידי pDCs 2. מנגנון החישה דורש קשר ראשוני בין גליקופרוטאין הנגיפי המעטפה (gp120) על פני השטח של התאים הנגועים T מסוג CD4 ומולקולות בPDC, אשר לאחר מכן ואחריו ללכוד וירוס והפנמה על ידי PDC. הכרה עוקבת RNA HIV-1 שהועבר על ידי TLR7 מפעילה את ההפעלה של Myd88 / מסלול IRF7 וסופו של דבר מובילה לסוג-שהייצור IFN 3. חשוב לציין, המסלול השני החישה הנוכחי בpDCs, אשר מתווך על ידי TLR9, הוא מעוכב על ידי האינטראקציה של גליקופרוטאין הנגיפי, gp120, עם BDCA2 סמן משטח PDC הספציפי 4.
> מסלולי חישת TLR7 וTLR9 של PDC יכולים להיות מווסת על פוטנציאל שלילי על ידי ההתקשרות של BST2 (גם המיועדת Tetherin או CD317) עם עוד קולט מעכב משטח PDC ספציפי נקרא ILT7 5. BST2 מתבטא ברמות גבוהות על פני השטח של pDCs וכמה תאי סרטן, אך ברמות נמוכות יחסית בסוגי תאים אחרים, כגון תאי B, מקרופאגים, תאי T ו. חשוב לציין, יכול להיגרם על ידי BST2 סוג אני IFN במספר שורות תאים הפכו, כמו גם בתרביות תאים ראשוניות של מקורות אנושיים ועכבריים 6. מלבד תפקוד מערכת חיסון-הרגולציה שלה, BST2 נמצא לאחרונה כדי לעכב את שחרורו של HIV-1 ואחר עטפו חלקיקים נגיפיים על ידי חלקיקי נגיף המתהווים cross-linking על פני השטח של התאים הנגועים 7. במקרה של HIV-1, חלבון אבזר קידוד הווירוס U (Vpu) הוצג לפעול כיריב BST2. הוא האמין כי פעולת ה- Vpu downregulates BST2 מתא השטח של תאים נגועים בנגיף HIV-1, באתר שלה לקשורing פעילות וכתוצאה מכך משפר את השחרור נגיפי ולהפיץ 7, למרות שרעיון זה כבר אתגר 8,9. בהעדר פעולת ה- Vpu, מספר גדול של נוצר באופן מלא וחלקיקי HIV-1 צאצאים בוגרים נשמרים על פני התא. אם חלקיקים קשורים אלה יכולים לייצג מטרות יעילות לחישה חיסונית עדיין נותר פתוח. בנוסף, לא ברור אם פעולת ה- Vpu תוכל dysregulate ייצור IFN-אני סוג מpDCs על ידי ויסות משטח BST2 רמות.
מחקרים מוקדמים נועדו להעריך חישת HIV-1 נערכו באמצעות חלקיקים HIV-1 ללא סלולריים, שנחשבים בדרך כלל מעוררים עניים מסוג-אני IFN 3,10-12. בהתחשב בכך שהמחקרים האחרונים מראים כי PBMCs וpDCs יעילות לחוש לימפוציטים מסוג CD4 + T נגוע ב- HIV 2,13,14, אנו מתארים כאן שיטה פשוטה למדידת תגובות מולדת מופעלות על ידי pDCs בעת ההכרה של תאים נגועים בנגיף HIV-1 במבחנה.
Protocol
הערות כלליות
חשוב לשמור על תאים בתרבית ללא כל אנטיביוטיקה, מאז ניתן חש זיהומים חיידקיים אפילו נשלטים על ידי PBMCs. חישה כגון רכיבי חיידקים תגרום לייצור אינטרפרון רקע שלא ניתן להבחין בין שמופעל על ידי חישת HIV-1 ספציפית. יתר על כן, כל התאים צריכים להיבדק באופן שגרתי על היעדריו של זיהום mycoplasma.
תמיד להשתמש בפתרונות ללא רעלן פנימי בכל ההזדמנות אפשרית.
אפיון cytometric זרימה של התאים השונים כדי לשמש בשיתוף התרבויות (PBMCs, pDCs, MT4 ותאי CD4 + T) הוא צעד אופציונאלי, אך מומלץ מאוד שכן הוא יכול לספק מידע רב ערך הנדרש לפרשנות נכונה של ניסוי נתון.
1. הכנת תאי יעד נגוע
- לשמור על קו של תאי CD4 + אדם MT4 בRPMI 1640 Mediבתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS), המכונה מעתה ואילך כRPMI-1640 בינוניים מלא.
- בידוד של תאים מסוג CD4 + T העיקריות.
- בודד תאי mononuclear מהדם היקפי אדם על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות.
- לבודד ימפוציטים מסוג CD4 + T באמצעות ערכת סלקציה שלילית תאי CD4 + T, בעקבות ההמלצות של היצרן.
- תאים לימפוציטים מסוג CD4 + הפעל T עם PHA-L (5 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך 48 שעות ולאחר מכן לשמור בRPMI-1640 בינוניים מלא בתוספת IL-2 רקומביננטי (100 U / ml). להדביק תאי T שלאחר בידוד 5 ימים ראשוניים.
- זיהום של תאי מטרה (קו תא MT4 T או תאי CD4 + T Heterologous העיקריים).
- יומיים לפני תרבות משותפת, להדביק תאי T עם נגיף ה- HIV-1. בדוגמא הספציפית המתוארת כאן pNL4.3-GFP_ires_Nef סוג בר (WT) או וירוסי pNL4.3-GFP_ires_Nef דלתא Vpu (dVpu) היה בשימוש. זני נגיפים אלה מייצגים GREen חלבון ניאון (GFP) -marked שיבוטים מולקולריים זיהומיות isogenic שונה רק ביכולתם להביע את פעולת ה- Vpu.
- השתמש multiplicities שונה של זיהום (MOIs) ובחר תרבויות עם רמות דומות של זיהום לשיתוף תרבויות. היום של התרבות המשותפת, לקבוע את האחוז של ה- GFP + תאים על ידי cytometry זרימה כסמן לזיהום. השתמש בתרבויות רק עם טווח של תאים נגועים 20-50% לשיתוף תרבויות.
צעדים אופציונליים: בצעו צביעת cytometric זרימה בשלב זה להעריך את ביטוי פני השטח של מולקולות / ligands של עניין, כגון BST2, וCD4. עבור מכתים שטח פני תא, resuspend 0.5 x 10 6 תאי T בפתרון לשטוף 100 μl, להוסיף 1 μl של אנטי-CD4_PerCP / Cy5.5 וμl 1 של אנטי-BST2_A660. דגירה צינורות במשך 45 דקות ב 4 ° C, לפני הכביסה עם cytometry זרימת פתרון לשטוף. אם המחקרים שמטרתם להעריך את התפקיד של אנטגוניזם BST2 תיווך Vpu, לבצע חלקיקים HIV-1assay שחרור בשלב זה כפי שתואר לעיל 15.
2. בידוד והעשרה של תאי חישה (PBMCs כולו או pDCs מועשר)
הערה: כאשר PBMCs משמש לחישה, להתחיל בידוד בתוך חצי שעה לאחר איסוף דם ולנהל אותו במועד. השתמש PBMCs מייד לשיתוף תרבויות או העשרת PDC.
- בודד תאי mononuclear מהדם היקפי אדם על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות.
שלב אופציונאלי: בצע צביעת cytometry זרימה רב-פרמטרית כדי לאשר שPBMCs מבודד טרי מכיל את שושלות תאים השונות ביחסים פיסיולוגיים. עבור מכתים שטח פני תא, resuspend 10 6 PBMCs בפתרון של חסימת Fc 100 μl, דגירה במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר החסימה, להוסיף μl 1 של אנטי-CD3_Pacific כחול (לתאי T), 1 μl של אנטי-CD14-PE_Texas אדום (לתאי מיאלואידית), 4 μl של אנטי-BDCA2_APC וμl 1 של אנטי-ILT7_PE (לPDC). דגירהצינורות במשך 45 דקות ב 4 ° C, לפני הכביסה עם cytometry זרימת פתרון לשטוף. - להעשיר pDCs באמצעות ערכת סלקציה שלילית PDC, בעקבות ההמלצות של היצרן. מומלץ לעבוד מהר, לשמור על תאים קרים, ולהשתמש בפתרונות מקוררים מראש. זה ימנע את מכסת של נוגדנים על פני התא ותיוג תא שאינו ספציפי, כמו גם להבטיח את פעילות PDC מקסימלי.
- לבצע ניתוח התזרים cytometric רב פרמטרית של pDCs המבודדים הטרי כדי לאשר טוהר, אחוז ההעשרה, וכמויות יחסי של סמני משטח ספציפי pDC- (כגון ILT7 וBDCA2). עבור מכתים שטח פני תא, resuspend 10 4 pDCs בפתרון של חסימת Fc 100 μl, דגירה במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר החסימה, להוסיף μl 1 של אנטי-CD3_Pacific כחול, μl 1 של אנטי-CD14_PE_Texas אדום, 4 μl של אנטי-BDCA2_APC וμl 1 של אנטי-ILT7_PE. דגירה צינורות במשך 45 דקות ב 4 ° C, לפני הכביסה עם cytometry זרימת פתרון לשטוף (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS). מינימום של 40% טוהר PDC מומלץ (אם חומר ההתחלה יש 0.4% PDC, זה יהיה שווה ערך להעשרה פי 100).
3. משותף תרבות של תאים נגועים מסוג CD4 + T ותאי חישה (PBMCs כולו או pDCs מועשר)
- מערבבים 220 μl של PBMCs (/ מיליליטר בריכוז הנע בין 100,000 ל 500,000 תאים) (בדילול ב850,000 תאים / מיליליטר) או 220 μl של pDCs עם 30 μl של תאי T נגועים (בדילול ב 10 6 תאים / מיליליטר) לכל גם ב צלחת גם 96 U-תחתון.
- כפקדים, PBMCs צלחת או pDCs ותאי T לבד. להתאים את עוצמת קול ובל -250 μl עם RPMI 1640 בינוניים מלא.
- להעריך תגובות הסלולר אגוניסט הידוע של מסלולי TLR7 וTLR9. לשם כך, 220 μl הצלחת של PBMCs (בדילול ב850,000 תאים / מיליליטר) או 200 μl של pDCs (בריכוז הנע בין 100,000 ל 500,000 תאים / מיליליטר) לכל היטב בצלחת גם U-תחתונה 96 ולהוסיף אגוניסט TLR7 ( אימיquimod, ריכוז סופי: 2.5 מיקרוגרם / מיליליטר) או אגוניסט TLR9 (ODN 2,216 CPG-, ריכוז סופי: 5 מיקרומטר). דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ל18-22 שעות ולעבד אותם באופן דומה לשיתוף התרבויות המתוארות להלן.
- דגירה שיתוף תרבויות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ל18-22 שעות, ולאחר מכן להעביר אותם לצלחת גם 96 V-תחתון. צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 400 x גרם.
- העבר את supernatants לצלחת גם 96 בעלת תחתית. ניתן לאחסן supernatants ב -80 ° C או המשמש לזיהוי סוג אני IFN מייד.
- Resuspend תאי שיתוף תרבותי בparaformaldehyde 2% ולנתח אותם באמצעות cytometry זרימה. בשל הבדלים בגודל ובפרור, תאי MT4 הם להבחין בקלות מPBMCs או pDCs מבוסס על תופעות פיזורם (SS) לעומת קדימה-פיזור פרופילים (FS). אם תאי T עיקריים משמשים כתאי מטרה נגועה, אלה יכולים להיות מוכתמים עם כל צבע גשש תא, כגון CSFE, לשתף תרבות קודמת.
- המדידה ביו-הסוג אני IFN שימוש בתאי כתב β HEK-הכחול IFN-α /.
הערה: תאים אלה נוצרו על ידי transfection היציב של תאי HEK293 עם גני STAT2 וIRF9 אדם להשיג סוג פעיל באופן מלא אני IFN מסלול איתות. הם גם מכילים את גן כתב phosphatase אלקליין המופרש (SEAP) תחת שליטתו של IFN-α / β אמרגן ISG54 מושרה. גירוי של תאים אלה עם סוג אני IFN מפעיל את JAK / STAT / ISGF3 מסלול וגורם ייצור של SEAP.- שמור על תאי HEK-הכחול IFN-α / β DMEM בתוספת 10% FBS. צלחת אותם בצפיפות של 50,000 תאים לכל גם בצלחת גם 96 בעלת תחתית, בנפח סופי של 180 μl.
- הוסף 20 μl של supernatant התרבות המשותפת לכל טוב בשני עותקים. כל צלחת גם דורשת קבוצה של פקדים סטנדרטיים פנימיים (IFNα אדם, ריכוז סופי של 100 U / ml 2500 U / ml). דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור 18שעה -22.
- לקבוע רמות של פעילות בסיסית phosphatase באמצעות פתרון Quanti-הכחול, שמשתנה מורוד לסגול / כחול בנוכחות של האנזים. הכן Quanti-כחול בעקבות ההמלצות של היצרן. להוסיף 180 μl של פתרון זה היטב בכל צלחת גם 96 בעלת תחתית. לכל אחד גם להוסיף גם 20 μl של supernatants תאי HEK-הכחול IFN-α / β המושרה, ודגירת הצלחת בחממה 37 ° C עד הצבע מתפתח בבארות שליטת IFN סטנדרטית.
- להעריך רמות של SEAP באמצעות ספקטרופוטומטר ב620-655 ננומטר ולקבוע את הריכוז של הסוג-אני IFN על ידי ניפוח מהחלק ליניארית של העקומה סטנדרטית IFN.
Representative Results
מערכת שיתוף התרבות המתוארת באיור 1 מאפשרת למחקר מבוקר של HIV-1 חישה מולדת. בשל האופי המשתנה של תאים ראשוניים, חשוב שהיחסים נורמלים של מיאלואידית ותאי T (CD14 + וCD3 + בהתאמה) הם נצפו, כמו בדוגמא המוצגת באיור 2 א. יתר על כן, רק מספר נמוך של תאים מופעלים T (FS גבוה יותר ורמות גבוהות יותר CD3 בהשוואה לתאי T מופעל ללא) רצוי בתרבויות PBMCs המבודדים הטרי. PBMCs עם יחסים נורמליים בין תאים מהסוגים השונים הם לעתים קרובות לא מסוגל הרכבה תגובה חיסונית מולדת נכונה במבחנה, כנראה עקב פנוטיפ כבר הופעל כתוצאה מזיהום מתמשך. והכי חשוב, את האחוז היחסי של pDCs צריך להיות מוערך כפי שמוצג באיור 2. למרות שאחוז זה יכול להשתנות 0.2-1.2%, פנוטיפ חישה נורמלי הוא ציין גם עם שני extreMES של טווח זה. העשרת pDCs באמצעות סלקציה שלילית לעתים קרובות מניבה 50-95% טוהר PDC, כפי שניתן לראות בשתי דוגמאות באיור 2 (92% ו -72%). דוגמא טיפוסית לניסוי הכולל מוצגת באיורים 3 ו -4. בדוגמא זו, תאי MT4 נדבקו pNL4.3-GFP_ires_Nef WT או דלתא Vpu להשיג זיהום 30% בזמן של התרבות המשותפת (איור 3 א). כפי שתואר לעיל, רק הזיהומים בוירוס WT הביאו את תקנה משמעותית של BST2 פני השטח (איור 3). בשל חילוקי הדעות ביניהם בגודל ובגרעיניות, תאי MT4 ניתן להבחין בקלות מPBMCs ידי cytometry זרימה (איור 4 א). לאחר הדגירה התרבות המשותפת, PBMCs רק במגע עם אגוניסט הידוע TLR7 או TLR9 וPBMCs במגע עם HIV-1 כמויות משמעותיות תאים נגועים שוחררו מהסוג-אני IFN (איור 4). אין IFN זוהה בPBMCs לבד, בשיתוף מ"ק PBMCsltured עם תאי MT4 נגועים מדומים, או בתאים נגועים MT4 לבד (איור 4). בדוגמא שהוצגה כאן, חישה מולדת של תאי MT4 נישאים HIV-1 על ידי PBMCs נמצאה להיות מופחת באופן משמעותי בנוכחות Vpu.
איור 1:. סקירה סכמטי של תכנון ניסוי SUP: supernatant לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
איור 2: אפיון פנוטיפי של PBMCs וenr המבודדים טריpDCs iched. () התפלגות נורמלית של תאי מיאלואידית ותאי T שנצפו בPBMCs מבודד מתורם בריא (אחוז מתאי מיאלואידית צריך לנוע בין 10-20% ותאי T בין 55-65%). מדגם PBMCs היו מוכתם באמצעות נוגדני fluorophore מצומדות שיכירו CD14 פני השטח (סמן שושלת מיאלואידית) וCD3 (סמן תא T). אפיון פנוטיפי של pDCs (B). לפני pDCs העשרה מייצג בין .2-1.2% מהמספר הכולל של תאים בתוך PBMCs (0.99% בדוגמא מוצגים). ניתן לזהות תאים אלה מבוססים על ביטוי של סמנים ספציפיים, כגון BDCA2 וILT7, שנכחו בשטח פני התא. סלקציה שלילית יכולה לשמש כדי להעשיר באופן משמעותי את מספר pDCs ולחסל זיהומים שעלולים להיות מזיקים, כגון תאי CD14 + מיאלואידית (העשרה להגיע 92% ו -72% בשתי דוגמאות מוצגות). CLICK כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
אחוז אפיון של תאי MT4 יעד נישאים HIV-1 (א) של תאים נגועים בתרבויות MT4 הנגועים בpNL4.3-GFP_ires_Nef WT או dVpu כפי שנקבעו על ידי אחוז התאים החיוביים GFP: איור 3.. ביטוי פני תא (ב ') BST2 בתאים הנגועים הוערך לאחר צביעת פני השטח. היסטוגרמות האפורה מילא מייצגת תאים נגועים מדומים מוכתמים בדם לפני חיסון הארנב (שליטה בלא כתם); היסטוגרמות שנותרה לייצג תאים מוכתמים בסרום ארנבת polyclonal אנטי-BST2. היסטוגרמות עם קווים מוצקים מייצגת שלילי שליטת GFP (נג) תאים; בעוד היסטוגרמות עם קווים מקווקווים מתאים לתאים נגועים GFP חיוביים (POS). אומר שפעתעוצמת orescence ערכים (MFI) מצוינים עבור כל דגימה. Cytometry זרימה בוצע ונותח, כמתואר באיור 2. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
איור 4:. תרבות Co של PBMCs מבודד טרי ותאי T נגועים MT4 () השוואת cytometry זרימת פרופילי FS / SS נצפו לתאי T MT4 לבד, PBMCs לבד, או שיתוף תרבויות בין PBMCs ותאי T MT4. בשל הבדלים בגודל ובגרעיניות, תאי T MT4 ניתן להבחין בקלות מPBMCs בשיתוף תרבויות באמצעות cytometry זרימה. דוגמא מייצגת של כמות סוג אני IFN שוחררה לאחר גירוי של PBMCs עם TLR (ב)7 או אגוניסט TLR9 (לפני), או לאחר שיתוף תרבויות עם מדומה או תאי MT4 המצוין נגועים בpNL4.3-GFP_ires_Nef WT או dVpu. הנתונים גולמיים מוצגים כOD 650 ערכים וconverseion המקביל להקליד-אני ריכוז IFN לידי ביטוי בU / ml. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
Discussion
הפרוטוקולים שתוארו כאן למדוד חישה של תאי T נגועים בוירוסים מתויג GFP HIV-1 שנבדלים רק ביכולתם להביע את פעולת ה- Vpu, כפי שתוארו בדו"ח האחרון שלנו 18. עם זאת, יכולים היו בקלות להיות שונה בשיטות אלה כדי ללמוד חישה של וירוסים לא מתויגים כמו גם וירוסים חסרי גנים נגיפיים אחרים שעלולים לווסת חישה מולדת. אם הווירוסים משמשים לא להביע GFP, אחוז תאי יעד הנגועים צריכים להיקבע על ידי אמצעים אחר לפני תרבות משותפת, כגון p24 (קפסיד) מכתימה תאית וcytometry זרימה או על ידי p24 ELISA. יתר על כן, ניתן להשתמש בפרוטוקולים אלה עם תאי T היעד שונים, כוללים מגוון רחב של שורות תאים זמינות ותאים ראשוניים.
יש השיטות שתוארו בכתב היד הזה יש מספר היתרונות בהשוואה לשיטות המוקדמות נהגו ללמוד חישת HIV-1. בראש ובראשונה את זה כבר נקבע על ידי מספר הקבוצות שp HIV-1-תא ללאמאמרים מעוררים עניים מהסוג-אני IFN 2,13,14. יתר על כן, מחקרים מוקדמים הסתמכו על שיטות מבוססות ELISA IFNα מבוגרות לכמת את כמות סוג אני IFN מיוצרת. הגבלה של טכניקת זיהוי זה היא שרוב ערכות IFNα ELISA המבוגרות למדוד רק סוג אחד של IFNα, בעוד שמשקיף סוגי IFNα וIFNβ האחרים. השימוש בשורות תאי הכתב תיארו מתגברת על מגבלה זו כריכוז של כל הצורות ביו של IFNs סוג-אני האנושי ניתן למדוד בפעם אחת. הטכניקה היא רגישה מאוד, יקרה פחות מהדור החדש של ערכת ELISA IFN ולתורמים רבים כמויות גדולות של הסוג-IFN אני יכול בקלות להיות מזוהות. עם זאת, פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לשימוש עם סוג אני IFN שיטות אחרות לקריאה החוצה כגון ELISAs.
צעדים קריטיים: חשוב שהאיכות של כל המרכיבים התאיים (המטרות והן effectors) להיות מבוקרת היטב. זיהום פוטנציאלי, גם כאשר asymptomatic, צריך להיות במעקב ובשליטה. כפי שהזכרנו קודם לכן, אנטיביוטיקה בשליטת זיהום חיידקים ללא תסמינים, ופתוגנים תאיים פוטנציאלי אחרים כגון mycoplasma, יכולים ליצור תגובה חיסונית דומה לאלה שנצפו לאחר הדבקת HIV-1, כלומר ייצור של הסוג-אני IFN. יתר על כן, כל חומרים כימיים צריכים להיות חופשי של LPS או אנדוטוקסינים פוטנציאליים אחרים. כמו כן, ניטור של PBMCs וpDCs חשוב גם כן לעתים קרובות יכולות להיות דרוכים דגימות אנושיות על ידי זיהומים מתמשכים הבסיסיים, אשר עשוי להשפיע חישה נורמלית. אנחנו תמיד ממליצים כוללים בקרות שליליות המוצעות, כגון העדר תאי יעד, כמו גם שיתוף תרבויות עם תאים נגועים מדומים. כדאיות של תאים נגועים היא גם חשובה לחישה נכונה PDC מאז סוג אני IFN אינו מיוצר הבא תרבות משותפת עם תאים אפופטוטיים 2,14.
מגבלה חשובה אחת של הטכניקה היא את הצורך בתאים ראשוניים מבודדים טרי. הליך זה לא היה נבדק באמצעות PBMCs או pDCs שהוקפאו או נשמר בתרבות או בעבר. הבידוד של PBMCs הוא עבודה אינטנסיבית ויש לי תאים אלה אורך חיים מוגבלים מאוד. יתר על כן, יש להשתמש בפרוטוקולים סטנדרטיים להגנה מפני פתוגנים שמקורן בדם בעת שעבדו עם דם אנושי. לעתים קרובות יש כמה מקורות שונות הקשורים בעבודה הכרוכה בתאים אנושיים מבודדים טרי. ביניהם ההליכים השונים יושמו לבודד תאים אלה, וההשתנות בירושה נתקלו מתורם לתורם הם. בעוד שאי אפשר להימנע משונות בין תורם, השימוש בפקדים חיוביים הציעו, כגון מדידת תגובה לאגוניסטים ידועים של מסלולי TLR7 וTLR9, יספק בקרה פנימית חשובה לניסויים אלה. אנחנו הבחנו שתגובה חזקה לאגוניסטים של מסלול TLR9 יכולה להיות מתואמות עם תגובת PDC בריאה, ואילו נדרש מסלול TLR7 מגיב לתגובה הולמת נגד HIV-1 3.
ss = "jove_content"> בהתבסס על תצפיות שנעשו על ידי אותנו ואחרים 2, העשרת pDCs מPBMCs לעתים קרובות אין צורך. עם זאת, אם עיצוב ניסיוני דורש את זה (למשל בהקשר שבו יש צורך בדלדול של סמני משטח PDC ספציפיים) סלקציה שלילית עדיף על בחירה חיובית, כמו תאים להישאר חופשיים של נוגדן לאחר תהליך הבחירה. pDCs המבודד עובר אפופטוזיס המהיר בתרבות. לניסויים הדורשים תאים אלה להיות מתורבתים לתקופה ארוכה של זמן, יכולה להיות בתוספת תקשורת ותרבות עם IL-3. ציטוקינים זה גורם התפשטות PDC ומעכב אפופטוזיס 16. עם זאת, IL-3 שימוש צריך להיות מבוקר היטב שכן הוא עלול להוביל להתבגרות או בידול PDC.
השיטה המתוארת כאן משלבת יעד HIV-1 תאים נגועים בPBMCs או pDCs המבודדים טרי כדי לשחזר מעורבים בחישה מולדת הצעדים הראשוניים. שיטה זו תהיה ללא ספק להיות שימושית לExplorאירועי הדואר מוקדמים מולדים חיסוניים קשורים לזיהום HIV. למרות שהפרוטוקולים הנלווים מכוונים מדידה מסוג אני IFN, הם יכלו בקלות להיות שונה כדי למדוד מולקולות ביו אחרות שוחררו מpDCs בעת ההכרה של תאים נגועים. אלו יכולים לכלול: סוג III-IFN (IFN-λ), ציטוקינים פרו-דלקתיים (כגון TNF-α ו- IL-6) וCXCL10 כמוקינים, CCl4, וCCL5 17.
Acknowledgments
אנו מודים E. Massicotte וג 'ה' לקבלת סיוע טכני מומחה בcytometry זרימה וניסויי מיון תא. כמו כן, ברצוננו להודות לצוות המרפאה IRCM וכל התורמים למתן דגימות דם. דגימות דם היקפיים התקבלו מתורמים מבוגרים בריאים שנתנו בכתב הסכמה מדעת בהתאם להצהרת הלסינקי תחת פרוטוקולי מחקר שאושרו על ידי המועצה לביקורת האתיקה מחקר של מכון דה Recherches Cliniques מונטריאול (IRCM). התקבלו ריאגנטים הבאים באמצעות התכנית מגיב NIH האיידס, החטיבה של האיידס, NIAID, NIH: תאי MT4 מד"ר דאגלס ריצ'מן; וRIL-2 אדם מד"ר מוריס גייטלי, הופמן - לה רוש בע"מ
ד"ר כהן הוא הנמען של מחקר קתדרת קנדה בRetrovirology האדם. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מCIHR (CIHR 111,226) לד"ר כהן ומהחטיבות דה משוכלל ונדיר du קוויבק-סנטה (FRQ-S) רשת איידס לד"ר Bego וד"ר כהן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MT4 cells | NIH AIDS Reagent Program | 120 | This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT-4 from Dr. Douglas Richman. |
| HEK-Blu IFN-α/β reporter cells | Invivogen | HKB-IFNAB | |
| RPMI | Wisent | 350-000-CL | |
| DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
| FBS | Wisent | 080-150 | |
| Ficoll-Pâque Plus | Myltenyi | 17-1440-03 | |
| CD4+ T cell isolation kit II | Myltenyi | 130-091-155 | |
| Diamond Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II | Myltenyi | 130-097-240 | |
| PHA-L | Sigma-Aldrich | O2769 | |
| Human rIL-2 | NIH AIDS Reagent Program | 136 | This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: Human rIL-2 from Dr. Maurice Gately, Hoffmann - La Roche Inc. |
| Imiquimod | Invivogen | TLRL-IMQS | |
| ODN 2216 CpG-A | Hycult Biotec | HC4037 | |
| Human IFNα | PBL Interferon source | 11100-1 | |
| QUANTI-Blue | Cedarlane | REP-QB2 | |
| Flow cytometry (Antibodies/reagents) | |||
| Fc blocking solution (composition below): | Note: make in washing solution (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS) | ||
| 10% Goat serum | Sigma-Aldrich | G 9023 | |
| 10% Rabbit serum | Sigma-Aldrich | R 9133 | |
| 10% Mouse serum | Sigma-Aldrich | M 5909 | |
| 2.5 mg/ml human IgG | Sigma-Aldrich | I 4506 | |
| anti-CD3_Pacific Blue | Biolegend | 300417 | |
| anti-CD14_PE-TxRed | Life Technologie | MHCD1417 | |
| anti-BDCA2_APC | Myltenyi | 130-090-905 | |
| anti-ILT7_PE | Biolegend | 326408 | |
| anti-CD4_PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 317427 | |
| anti-BST2_Alexa 660 | eBioscience | 50-3179 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P 6148 | |
| Cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Cyan ADP instrument | Beckman Coulter | CY20030 |
References
- Colonna, M., Trinchieri, G., Liu, Y. J. Plasmacytoid dendritic cells in immunity. Nature immunology. 5, 1219-1226 (2004).
- Lepelley, A., et al. Innate sensing of HIV-infected cells. PLoS pathogens. 7, e1001284 (2011).
- Beignon, A. S., et al. Endocytosis of HIV-1 activates plasmacytoid dendritic cells via Toll-like receptor-viral RNA interactions. The Journal of clinical investigation. 115, 3265-3275 (2005).
- Martinelli, E., et al. HIV-1 gp120 inhibits TLR9-mediated activation and IFN-{alpha} secretion in plasmacytoid dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3396-3401 (2007).
- Cao, W., et al. Regulation of TLR7/9 responses in plasmacytoid dendritic cells by BST2 and ILT7 receptor interaction. The Journal of experimental medicine. 206, 1603-1614 (2009).
- Bego, M. G., Mercier, J., Cohen, E. A. Virus-activated interferon regulatory factor 7 upregulates expression of the interferon-regulated BST2 gene independently of interferon signaling. Journal of virology. 86, 3513-3527 (2012).
- Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu. Nature. 451, 425-430 (2008).
- Miyagi, E., Andrew, A. J., Kao, S., Strebel, K. Vpu enhances HIV-1 virus release in the absence of Bst-2 cell surface down-modulation and intracellular depletion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2868-2873 (2009).
- McNatt, M. W., Zang, T., Bieniasz, P. D. Vpu binds directly to tetherin and displaces it from nascent virions. PLoS pathogens. 9, e1003299 (2013).
- Manel, N., et al. A cryptic sensor for HIV-1 activates antiviral innate immunity in dendritic cells. Nature. 467, 214-217 (2010).
- Yan, N., Regalado-Magdos, A. D., Stiggelbout, B., Lee-Kirsch, M. A., Lieberman, J. The cytosolic exonuclease TREX1 inhibits the innate immune response to human immunodeficiency virus type 1. Nature immunology. 11, 1005-1013 (2010).
- Fonteneau, J. F., et al. Human immunodeficiency virus type 1 activates plasmacytoid dendritic cells and concomitantly induces the bystander maturation of myeloid dendritic cells. Journal of virology. 78, 5223-5232 (2004).
- Ankel, H., Capobianchi, M. R., Frezza, F., Castilletti, C., Dianzani, F. Interferon induction by HIV-1-infected cells: a possible role of sulfatides or related glycolipids. Virology. 221, 113-119 (1996).
- Schmidt, B., Ashlock, B. M., Foster, H., Fujimura, S. H., Levy, J. A. HIV-infected cells are major inducers of plasmacytoid dendritic cell interferon production, maturation, and migration. Virology. 343, 256-266 (2005).
- Bego, M. G., Dube, M., Mercier, J., Cohen, E. A. Effect of calcium-modulating cyclophilin ligand on human immunodeficiency virus type 1 particle release and cell surface expression of tetherin. Journal of virology. 83, 13032-13036 (2009).
- Grouard, G., et al. The enigmatic plasmacytoid T cells develop into dendritic cells with interleukin (IL)-3 and CD40-ligand. The Journal of experimental medicine. 185, 1101-1111 (1997).
- Fitzgerald-Bocarsly, P., Jacobs, E. S. Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection: striking a delicate balance. Journal of leukocyte biology. 87, 609-620 (2010).
- Bego MG,, Côté, É, Aschman, N., Mercier, J., Weissenhorn, W. Cohen ÉA. Exploits the Cross-Talk between BST2 and the ILT7 Receptor to Suppress Anti-HIV-1 Responses by Plasmacytoid Dendritic Cells. PLoS Pathog. 11 (7), e1005024 (2015).
