Summary
I modsætning cellefrie HIV-1-partikler, er inficeret CD4 + T-celler effektivt registreres af plasmacytoide dendritiske celler (pdCs). Dette håndskrift beskriver en fremgangsmåde, hvor perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) eller isolerede pdCs dyrkes sammen med HIV-1-inficerede T-celler til at evaluere medfødte sensing af pdCs som vurderet ved frigivelse af type I-IFN.
Abstract
HIV-1 medfødte sensing kræver direkte kontakt med inficerede CD4 + -T-celler med plasmacytoide dendritiske celler (pdCs). For at undersøge denne proces protokollerne her beskrevne anvendelse frisk isolerede humane perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) eller plasmacytoide dendritiske celler (pdCs) til at registrere infektioner i enten T-cellelinie (MT4) eller heterologe primære CD4 + T-celler. For at sikre korrekt registrering, er det vigtigt, at PBMC isoleres umiddelbart efter blodprøvetagning og at optimal procentdel af inficerede T-celler anvendes. Desuden kan multi-parametrisk flowcytometrisk farvning anvendes til at bekræfte, at PBMC prøver indeholder de forskellige cellelinier ved fysiologiske forhold. En række kontroller kan også være inkluderet for at evaluere levedygtighed og funktionalitet pdCs. Disse omfatter, tilstedeværelsen af specifikke overflademarkører, vurdere cellulære responser til kendte agonist af Toll-lignende receptorer (TLR) veje, og bekræfter manglende spontaneous type I interferon (IFN) produktion. I dette system, frisk isolerede PBMC'er eller pdCs dyrkes sammen med HIV-1-inficerede celler i plader med 96 brønde til 18-22 timer. Supernatanter fra disse co-kulturer anvendes derefter til at bestemme niveauerne for bioaktive type I-IFN'er ved at overvåge aktivering af ISGF3 vejen i HEK-Blue-IFN-a / p-celler. Før og under co-dyrkningsbetingelser, kan målceller underkastes flowcytometrisk analyse for at bestemme et antal parametre, herunder den andel af inficerede celler, niveauer af specifikke overfladearealer markører, og forskellen drab af inficerede celler. Selv disse protokoller oprindeligt blev udviklet til at følge type I-IFN produktion, kunne de potentielt bruges til at studere andre imuno-modulerende molekyler frigives fra pdCs og for at opnå yderligere indsigt i de molekylære mekanismer, der styrer HIV-1 medfødte sensing.
Introduction
Type I-IFN-producerende pdCs repræsenterer den første linje i forsvaret mod virusinfektioner, og som sådan fungere som et vigtigt bindeled mellem medfødte og adaptive immunitet 1. Mens cellefrie HIV-1-partikler er dårligt påvises ved det medfødte immunsystem, er HIV-1-inficerede CD4 + T-celler effektivt registreres af pdCs 2. Sensing mekanisme kræver en indledende kontakt mellem det virale kappeglycoprotein (gp120) på overfladen af den inficerede T-celle og CD4-molekyler på pDC, som derefter følges af virus opsamling og internalisering af PDC. Efterfølgende anerkendelse af overført HIV-1 RNA ved TLR7 udløser aktivering af MyD88 / IRF7 sti og i sidste ende fører til type-I IFN produktion 3. Det er vigtigt, den anden aftaster pathway stede i pdCs, som medieres af TLR9, inhiberes ved interaktionen af det virale glycoprotein gp120, med pDC-specifikke overflade markør BDCA2 4.
5. BST2 udtrykkes ved høje niveauer på overfladen af pdCs og nogle kræftceller, men ved relativt lavere niveauer i andre celletyper, såsom B-celler, makrofager og T-celler. Det er vigtigt, kan BST2 induceres af type I-IFN i en række transformerede cellelinier samt i primære kulturer af humane og murine oprindelse 6. Bortset fra dens immun-regulerende funktion blev BST2 nylig fundet at inhibere frigivelsen af HIV-1 og andre indhyllet viruspartikler ved tværbinding vordende viruspartikler på den inficerede celleoverflade 7. I tilfælde af HIV-1 blev viruskodet accessorisk protein U (Vpu) vist sig at virke som en antagonist BST2. Det menes, at Vpu nedregulerer BST2 fra celleoverfladen af HIV-1-inficerede celler, stedet for dens tøjring aktivitet og som et resultat forbedrer viral frigivelse og spredning 7, selv om dette begreb er blevet udfordret 8,9. I mangel af Vpu, et stort antal fuldt dannet og moden afkom HIV-1-partikler tilbageholdes på celleoverfladen. Hvorvidt disse tøjrede partikler kunne repræsentere effektive mål for immun sensing stadig et åbent spørgsmål. Desuden er det uklart, om Vpu kunne dysregulate type I-IFN produktion fra pdCs ved at modulere overflade BST2 niveauer.
Tidlige studier har til formål at vurdere HIV-1 sensing blev udført under anvendelse cellefrie HIV-1-partikler, som generelt anses for ringe inducere af type I-IFN 3,10-12. Eftersom nylige undersøgelser tyder på, at PBMC'er og pdCs fornemmer HIV-smittede CD4 + T-lymfocytter 2,13,14 effektivt, vi beskriver her en simpel metode til at måle medfødte reaktioner udløst af pdCs upon anerkendelse af HIV-1-inficerede celler in vitro.
Protocol
Generelle noter
Det er vigtigt at holde celler i kultur uden antibiotika, da selv kontrollerede bakterielle infektioner kan føles af PBMC'er. En sådan registrering af bakterielle komponenter vil fremkalde en baggrund interferon produktion, der ikke kan skelnes fra det udløst af specifikke HIV-1-sensing. Desuden har alle celler, der skal testes rutinemæssigt for fravær af forurening med mycoplasma.
Brug altid endotoxin-fri løsninger når det er muligt.
Flowcytometrisk karakterisering af de forskellige celler, der skal anvendes i co-kulturer (PBMC'er, pdCs, MT4 og CD4 + T-celler) er et valgfrit trin, men stærkt anbefales, da det kan give værdifulde oplysninger, der kræves for korrekt fortolkning af en given eksperiment.
1. Forberedelse af inficerede Target Cells
- Opretholde humane CD4 + T-cellelinie MT4 i RPMI 1640 media suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), henvist fra nu af som RPMI-1640 komplet medium.
- Isolering af primære CD4 + T-celler.
- Isoler mononukleære celler fra humant perifert blod ved densitetsgradientcentrifugering.
- Isoler CD4 + T-lymfocytter ved hjælp af en CD4 + -T-celler negativ udvælgelse kit, efter fabrikantens anbefalinger.
- Aktiverer CD4 + T-lymfocytter med PHA-L (5 ug / ml) i 48 timer og derefter opretholder celler i RPMI-1640 komplet medium suppleret med rekombinant IL-2 (100 U / ml). Inficere primære T-celler 5 dage efter isolering.
- Infektion af målceller (MT4 T-cellelinie eller heterologe primære CD4 + T-celler).
- To dage før co-kultur, inficere T-celler med HIV-1 virus. I det specifikke eksempel er beskrevet her pNL4.3-GFP_ires_Nef vildtype (WT) eller pNL4.3-GFP_ires_Nef delta Vpu (dVpu virus) blev anvendt. Disse virusstammer repræsenterer greda fluorescerende protein (GFP) -mærket isogene infektiøse molekylære kloner, der kun adskiller sig i deres evne til at udtrykke Vpu.
- Brug forskellige infektionsmultipliciteter (MOI) og vælg kulturer med lignende niveauer af infektion til co-kulturer. Dagen for co-kultur, bestemme procentdelen af GFP + -celler ved flowcytometri som en markør for infektion. Brug kun kulturer med en rækkevidde på 20-50% inficerede celler til co-kulturer.
Valgfri trin: Udfør flowcytometrisk farvning på dette tidspunkt at evaluere overfladeekspression af molekyler / ligander af interesse såsom BST2, og CD4. For celleoverfladefarvning, resuspender 0,5 x 10 6 T-celler i 100 pi vaskeopløsning, tilsættes 1 ul anti-CD4_PerCP / Cy5.5 og 1 pi anti-BST2_A660. Inkuber rørene i 45 minutter ved 4 ° C, før vask med flowcytometri vaskeopløsning. Hvis undersøgelserne er rettet mod at vurdere den rolle, som Vpu-medieret BST2 antagonisme, udføre en HIV-1-partikelrelease assay på dette tidspunkt som tidligere beskrevet 15.
2. Isolering og Berigelse af Sensing celler (Hele PBMC'er eller beriget pdCs)
Bemærk: Når PBMC'er anvendes til registrering, start isolation inden for en halv time efter blodprøvetagning og gennemføre den i tide. Brug PBMC'er straks for co-kulturer eller pDC berigelse.
- Isoler mononukleære celler fra humant perifert blod ved densitetsgradientcentrifugering.
Valgfrit trin: Udfør multi-parametrisk flowcytometri farvning at bekræfte, at frisk isolerede PBMC'er indeholder de forskellige cellelinier ved fysiologiske forhold. For celleoverfladefarvning, resuspender 10 6 PBMC'er i 100 pi Fc blokerende opløsning og inkuberes i 15 minutter ved 4 ° C. Efter blokering tilsættes 1 pi anti-CD3_Pacific Blå (for T-celler), 1 pi anti-CD14-PE_Texas Red (for myeloide celler), 4 pi anti-BDCA2_APC og 1 pi anti-ILT7_PE (for pdCs). Inkuberrør til 45 minutter ved 4 ° C, før vask med flowcytometri vaskeopløsning. - Berige pdCs hjælp af et PDC negativ udvælgelse kit, efter fabrikantens anbefalinger. Det anbefales at arbejde hurtigt, holde cellerne koldt, og bruge præ-afkølede løsninger. Dette vil forhindre udjævningen af antistoffer på celleoverfladen og ikke-specifik celle mærkning samt sikre maksimal pDC aktivitet.
- Udfør multi-parametrisk flowcytometrisk analyse af frisk isolerede pdCs at bekræfte renhed, procentdel af berigelse og relative mængder af pDC- specifik overflade markører (såsom ILT7 og BDCA2). For celleoverfladefarvning, resuspender 10 4 pdCs i 100 pi Fc blokerende opløsning og inkuberes i 15 minutter ved 4 ° C. Efter blokering tilsættes 1 pi anti-CD3_Pacific blå, 1 pi anti-CD14_PE_Texas Red, 4 pi anti-BDCA2_APC og 1 pi anti-ILT7_PE. Inkuber rørene i 45 minutter ved 4 ° C, før vask med flowcytometri vaskeopløsning (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS). Mindst 40% pDC renhed anbefales (hvis udgangsmaterialet har 0,4% pDC, ville dette svare til en 100 gange berigelse).
3. Co-kultur af inficerede CD4 + T-celler og affølingsceller (Hele PBMC'er eller beriget pdCs)
- Bland 220 pi PBMC'er (fortyndet på 850.000 celler / ml) eller 220 pi pdCs (ved en koncentration i området fra 100.000 til 500.000 celler / ml) med 30 pi inficerede T-celler (fortyndet 10 6 celler / ml) pr brønd i en U-bund 96 brønd plade.
- Som kontroller, plade PBMC'er eller pdCs og T-celler alene. Justere lydstyrken i godt til 250 pi med RPMI 1640 komplet medium.
- Vurdere cellulære reaktioner på kendt agonist af TLR7 TLR9 veje. Med henblik herpå plade 220 pi PBMC'er (fortyndet til 850.000 celler / ml) eller 200 pi pdCs (ved en koncentration i området fra 100.000 til 500.000 celler / ml) pr brønd i en U-bund 96 brønd plade og tilføj TLR7 agonist ( Imiquimod, slutkoncentration: 2,5 ug / ml) eller TLR9 agonist (ODN 2216 CpG-A, slutkoncentration: 5 uM). Cellerne inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i 18-22 timer og behandle dem på en måde svarende til de co-kulturer beskrevet nedenfor.
- Inkuber co-kulturer ved 37 ° C og 5% CO2 i 18-22 timer, og derefter overføre dem til en V-bund plade med 96 brønde. Centrifuger i 5 minutter ved 400 x g.
- Overfør supernatanter til en fladbundet plade med 96 brønde. Supernatanter kan opbevares ved -80 ° C eller anvendt til type I-IFN detektion straks.
- Resuspender co-dyrkede celler i 2% paraformaldehyd og analysere dem ved hjælp af flowcytometri. På grund af forskelle i størrelse og granulering, MT4 celler er let skelnes fra PBMC'er eller pdCs baseret på deres side-scatter (SS) versus fremadrettede scatter (FS) profiler. Hvis primære T celler anvendes som target-inficerede celler, kan disse farves med nogen celle tracker farvestof, såsom CSFE, før co-kultur.
- Måling af bioaktive type I-IFN ved anvendelse af HEK-Blå IFN-a / p reporter celler.
Bemærk: Disse celler blev dannet ved stabil transfektion af celler med HEK293 de humane STAT2 og IRF9 gener for at opnå et fuldt aktivt type I IFN-signalvejen. De indeholder også det secernerede alkaliske phosphatase (SEAP) reporter-genet under kontrol af IFN-α / p inducerbar promotor ISG54. Stimulering af disse celler med type I-IFN aktiverer JAK / STAT / ISGF3 pathway og inducerer produktionen af SEAP.- Opretholde HEK-Blå IFN-α / P-celler i DMEM suppleret med 10% FBS. Plate dem ved en densitet på 50.000 celler per brønd i en fladbundet plade med 96 brønde, i et slutvolumen på 180 ul.
- Tilsæt 20 pi co-kultursupernatant til hver brønd i to eksemplarer. Hver plade kræver også et sæt interne standard kontrol (human IFNa, slutkoncentration fra 100 U / ml til 2.500 U / ml). Pladerne inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i 18-22 Time.
- Bestemme niveauer af alkalisk phosphatase-aktivitet under anvendelse QUANTI-blå opløsning, som skifter fra lyserød til lilla / blå i nærværelse af enzymet. Forbered QUANTI-Blå efter producentens anbefalinger. Tilføj 180 pi af denne opløsning til hver brønd i en fladbundet plade med 96 brønde. Til hver brønd tilsættes 20 også pi de inducerede HEK-Blå IFN-α / P-celler supernatanter og inkuberes pladen i en 37 ° C inkubator, indtil farven udvikles i standard IFN kontrolbrønde.
- Vurdere niveauer af SEAP under anvendelse af et spektrofotometer ved 620 til 655 nm, og bestemme koncentrationen af type I-IFN ved ekstrapolation fra den lineære del af IFN standardkurven.
Representative Results
Co-dyrkningssystem, der er beskrevet i figur 1 muliggør en kontrolleret undersøgelse med HIV-1 medfødte sensing. På grund af den variable karakter primære celler, er det vigtigt, at de normale forhold mellem myeloide og T-celler (CD14 + og CD3 + henholdsvis) observeres, såsom i udførelsesformen vist i figur 2A eksempel. Desuden er det kun et lavt antal aktiverede T-celler (højere FS og højere niveauer CD3 sammenlignet med ikke-aktiverede T-celler) er ønskelige i frisk isolerede PBMC'er kulturer. PBMC'er med unormale forhold mellem de forskellige celletyper er ofte ude af stand til at montere en ordentlig immunrespons medfødte in vitro, sandsynligvis på grund af en allerede aktiveret fænotype som følge af en igangværende infektion. Vigtigst skal evalueres som vist i figur 2B Den procentvise andel af pdCs. Selv om denne procentdel kan variere fra 0,2 til 1,2%, er en unormal sensing fænotype også observeret med både extremes af dette interval. Berigelse af pdCs hjælp af negativ selektion giver ofte 50-95% pDC renhed, som det ses i de to eksempler fra i figur 2B (92% og 72%). Et prototypisk eksempel for den samlede forsøg er vist i figur 3 og 4. I dette eksempel blev MT4-celler inficeret med pNL4.3-GFP_ires_Nef WT eller delta Vpu at opnå 30% infektion på tidspunktet for co-kultur (figur 3A). Som tidligere beskrevet, kun infektioner med WT virus resulterede i en signifikant nedregulering af overfladen BST2 (figur 3B). På grund af deres forskelle i størrelse og granularitet, kan MT4-celler let kan skelnes fra PBMCer ved flowcytometri (figur 4A). Efter co-dyrkning inkubation kun PBMC'er i kontakt med kendte TLR7 eller TLR9 agonist og PBMC'er i kontakt med HIV-1-inficerede celler frigives væsentlige mængder type I-IFN (figur 4B). Nr IFN blev påvist i PBMC'er alene, i PBMC'er co-cultured med mock-inficerede MT4-celler, eller i inficerede MT4-celler alene (figur 4B). I præsenteres her eksempel fandtes medfødte sensing af HIV-1-inficerede MT4-celler efter PBMC'er at blive reduceret betydeligt i nærværelse af Vpu.
Figur 1:. Skematisk oversigt over det eksperimentelle design SUP: supernatant Klik her for at se et større billede.
Figur 2: Fænotypisk karakterisering af frisk isolerede PBMC'er og Enriched pdCs. (A) Normal distribution af myeloide celler og T-celler observeret i PBMC'er isoleret fra en rask donor (Procent af myeloide celler bør ligge mellem 10-20% og T-celler 55-65%). PBMC'er prøve blev farvet ved anvendelse af fluorofor-konjugerede antistoffer, som genkender CD14 overflade (myeloid afstamning markering) og CD3 (T-celle markør). (B) Fænotypisk karakterisering af pdCs. Forud for berigning pdCs udgør mellem 0,2-1,2% af det totale antal celler inden for de PBMC'er (0,99% i det viste eksempel). Disse celler kan identificeres baseret på ekspression af specifikke markører, såsom BDCA2 og ILT7, der er til stede på celleoverfladen. Negativ selektion kan anvendes til en berigelse antallet af pdCs og fjerne potentielt skadelige forureninger, såsom CD14 + myeloide celler (berigelse nå 92% og 72% i de to viste eksempler). Click her for at se et større billede.
Figur 3:. Karakterisering af HIV-1-inficerede target MT4-celler (A) Procentdel af inficerede celler i MT4 kulturer inficeret med pNL4.3-GFP_ires_Nef WT eller dVpu som bestemt ved procentdelen af GFP-positive celler. (B) BST2 celleoverfladeekspression i de inficerede celler blev vurderet efter overfladefarvning. De grå fyldte histogrammer repræsenterer mock-inficerede celler farvet med præ-immun kaninserum (uplettet kontrol); de resterende histogrammer repræsenterer celler farvet med anti-BST2 polyklonalt kaninserum. Histogrammer med fuldt optrukne linier repræsenterer kontrol GFP negative (neg) celler; mens histogrammer med stiplede linier svarer til inficerede GFP-positive (POS) celler. Mean influenzaorescence intensitet er angivet (MFI) -værdier for hver prøve. Flowcytometri blev udført og analyseret som beskrevet i figur 2. Klik her for at se et større billede.
Figur 4:. Co kultur af frisk isolerede PBMC'er og inficerede MT4 T-celler (A) Sammenligning af flowcytometri FS / SS profiler observeret for MT4 T-celler alene, PBMC'er alene eller co-kulturer mellem PBMC'er og MT4 T-celler. På grund af forskelle i størrelse og granularitet, kan MT4 T-celler let at skelne fra PBMC'er i co-kulturer ved hjælp af flowcytometri. (B) Et repræsentativt eksempel på mængden af type I-IFN frigivet efter stimulering af PBMC'er med TLR7 eller TLR9 agonist (siden), eller efter co-kulturer med mock eller de angivne MT4-celler inficeret med pNL4.3-GFP_ires_Nef WT eller dVpu. Rådata vist som OD 650 værdier, og deres tilsvarende converseion til type-I IFN-koncentration udtrykt i U / ml. Klik her for at se et større billede.
Discussion
De her beskrevne protokoller måle sensing af T-celler inficeret med GFP-mærkede HIV-1 virus, der kun afviger i deres evne til at udtrykke Vpu, som beskrevet i vores seneste rapport 18. Imidlertid kan disse metoder let modificeres til at studere føling af umærkede vira samt vira mangler andre virale gener, der potentielt modulerer medfødte sensing. Hvis de vira, der anvendes ikke udtrykker GFP, bør procentdelen af inficerede målceller bestemmes på anden måde, før co-kultur, som p24 (capsid) intracellulær farvning og flowcytometri eller ved p24-ELISA. Desuden kan disse protokoller anvendes med forskellige target-T-celler, herunder en række af tilgængelige cellelinier og primære celler.
De er beskrevet i dette manuskript metoder har en række fordele sammenlignet med tidligere metoder, der anvendes til at studere HIV-1 sensing. Først og fremmest er det blevet fastslået ved en række grupper, der cellefri HIV-1-partikler er dårlige inducere af type I-IFN 2,13,14. Desuden tidlige undersøgelser påberåbte ældre IFNa ELISA-baserede metoder til at kvantificere mængden af type I-IFN produceret. En begrænsning af denne afsløring teknik er, at de fleste af de ældre IFNa ELISA kits måler kun én type IFNa, mens udsigt andre typer af IFNa og IFNp. Anvendelsen af de beskrevne reporter cellelinjer overvinder denne begrænsning, da koncentrationen af alle bioaktive former for humane type I-IFN'er kan måles på én gang. Teknikken er meget følsom, billigere end den nye generation af IFN ELISA kit og for mange donorer let kan detekteres store mængder type I-IFN. Ikke desto mindre kan denne protokol nemt tilpasses til anvendelse med andre type I-IFN udlæsningssystemer metoder såsom ELISA'er.
Kritiske trin: Det er vigtigt, at kvaliteten af alle cellulære komponenter (både mål og effektorer) være tæt kontrolleret. Potentiel kontaminering, selv når asymptomatisk, skal overvåges og kontrolleres. Som vi tidligere nævnt, antibiotika-kontrolleret asymptomatisk bakteriel forurening, og potentielt andre intracellulære patogener, såsom mycoplasma, kan generere lignende immunresponser til dem observeret efter HIV-1 infektion, dvs. produktion af type I-IFN. Desuden er alle reagenser skal være fri for LPS eller andre potentielle endotoksiner. Ligeledes overvågning af PBMC'er og pdCs er også vigtig, da humane prøver ofte kan grundes med underliggende igangværende infektioner, der kan påvirke den normale sensing. Vi anbefaler altid herunder de foreslåede negative kontroller, såsom fravær af target-celler samt co-kulturer med mock-inficerede celler. Levedygtighed af inficerede celler er også vigtigt for korrekt pDC sensing siden type I-IFN ikke produceres efter co-kultur med apoptotiske celler 2,14.
En vigtig begrænsning i teknikken er behov for frisk isolerede primære celler. Denne procedure ikke vartestet ved hjælp af PBMC'er eller pdCs, der enten tidligere frosne eller holdes i kultur. Isoleringen af PBMC'er er arbejdskrævende, og disse celler har en meget begrænset levetid. Desuden bør standardprotokoller til beskyttelse mod patogen blodbårne bruges mens du arbejder med humant blod. Der er ofte flere kilder til variation i forbindelse med arbejde, der involverer frisk isolerede humane celler. Blandt dem er de forskellige procedurer, der gennemføres for at isolere disse celler, og den arvede variabilitet stødt fra donor-til-donor. Selv om det er umuligt at undgå mangfoldigheden af donor anvendelsen af de foreslåede positive kontroller, såsom måling af reaktion på kendte agonister for TLR7 TLR9 veje, vil give et vigtigt intern kontrol til disse eksperimenter. Vi observerede, at et stærkt respons på agonister af TLR9 pathway kunne korreleres med en sund pDC respons, mens en responsiv TLR7 pathway er nødvendig for en korrekt respons mod HIV-1 3.
2, berigelse af pdCs fra PBMC'er ofte ikke nødvendig. Men hvis det eksperimentelle design kræver det (for eksempel i sammenhæng, hvor udtømning af specifikke PDC overflademarkører er nødvendigt) negativ udvælgelse er at foretrække i positiv selektion, som celler forbliver fri for antistof efter udvælgelsesprocessen. Isolerede pdCs undergår hurtige apoptose i kultur. Til forsøg, der kræver disse celler skal dyrkes i længere tid, kan dyrkningsmedier suppleres med IL-3. Dette cytokin inducerer pDC proliferation og hæmmer deres apoptose 16. Det er imidlertid nødvendigt IL-3 forbrug skal tæt kontrolleret, da det kan føre til pDC modning eller differentiering.
Den her beskrevne metode kombinerer target HIV-1-inficerede celler med frisk isolerede PBMC'er eller pdCs for at genskabe de første skridt, der er involveret i medfødte sensing. Denne metode vil utvivlsomt være nyttigt at Explore tidlige medfødte immun hændelser forbundet med HIV-infektion. Selvom de tilhørende protokoller er rettet mod måling af type I-IFN, kunne de let modificeres til at måle andre bioaktive molekyler, der frigives fra pdCs efter genkendelse af inficerede celler. Disse kunne omfatte: Type-III IFN (IFN-λ), pro-inflammatoriske cytokiner (såsom TNF-α og IL-6) og kemokiner CXCL10, CCL4 og CCL5 17.
Acknowledgments
Vi takker E. Massicotte og J. Herren for ekspert teknisk bistand under flowcytometri og celle sortering eksperimenter. Også, vil vi gerne takke IRCM klinik personale og alle donorer for at give blodprøver. Blodprøver Perifere blev opnået fra raske voksne donorer, som gav skriftligt informeret samtykke i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen under forskningsprotokoller godkendt af forskningsetik gennemgang bestyrelsen for Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM). Følgende reagenser blev opnået gennem NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT4 celler fra Dr. Douglas Richman; og menneskelige rIL-2 fra Dr. Maurice Gately, Hoffmann - La Roche Inc.
Dr. Cohen er modtageren af Canadas Research Chair i Human Retrovirology. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra CIHR (CIHR 111.226) til Dr. Cohen og fra Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) AIDS-netværk til Dr. Bego og Dr. Cohen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MT4 cells | NIH AIDS Reagent Program | 120 | This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT-4 from Dr. Douglas Richman. |
| HEK-Blu IFN-α/β reporter cells | Invivogen | HKB-IFNAB | |
| RPMI | Wisent | 350-000-CL | |
| DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
| FBS | Wisent | 080-150 | |
| Ficoll-Pâque Plus | Myltenyi | 17-1440-03 | |
| CD4+ T cell isolation kit II | Myltenyi | 130-091-155 | |
| Diamond Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II | Myltenyi | 130-097-240 | |
| PHA-L | Sigma-Aldrich | O2769 | |
| Human rIL-2 | NIH AIDS Reagent Program | 136 | This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: Human rIL-2 from Dr. Maurice Gately, Hoffmann - La Roche Inc. |
| Imiquimod | Invivogen | TLRL-IMQS | |
| ODN 2216 CpG-A | Hycult Biotec | HC4037 | |
| Human IFNα | PBL Interferon source | 11100-1 | |
| QUANTI-Blue | Cedarlane | REP-QB2 | |
| Flow cytometry (Antibodies/reagents) | |||
| Fc blocking solution (composition below): | Note: make in washing solution (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS) | ||
| 10% Goat serum | Sigma-Aldrich | G 9023 | |
| 10% Rabbit serum | Sigma-Aldrich | R 9133 | |
| 10% Mouse serum | Sigma-Aldrich | M 5909 | |
| 2.5 mg/ml human IgG | Sigma-Aldrich | I 4506 | |
| anti-CD3_Pacific Blue | Biolegend | 300417 | |
| anti-CD14_PE-TxRed | Life Technologie | MHCD1417 | |
| anti-BDCA2_APC | Myltenyi | 130-090-905 | |
| anti-ILT7_PE | Biolegend | 326408 | |
| anti-CD4_PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 317427 | |
| anti-BST2_Alexa 660 | eBioscience | 50-3179 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P 6148 | |
| Cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Cyan ADP instrument | Beckman Coulter | CY20030 |
References
- Colonna, M., Trinchieri, G., Liu, Y. J.
- Lepelley, A., et al.
- Beignon, A. S., et al. Endocytosis of HIV-1 activates plasmacytoid dendritic cells via Toll-like receptor-viral RNA interactions. The Journal of clinical investigation. 115, 3265-3275 (2005).
- Martinelli, E., et al. HIV-1 gp120 inhibits TLR9-mediated activation and IFN-{alpha} secretion in plasmacytoid dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3396-3401 (2007).
- Cao, W., et al. Regulation of TLR7/9 responses in plasmacytoid dendritic cells by BST2 and ILT7 receptor interaction. The Journal of experimental medicine. 206, 1603-1614 (2009).
- Bego, M. G., Mercier, J., Cohen, E. A. Virus-activated interferon regulatory factor 7 upregulates expression of the interferon-regulated BST2 gene independently of interferon signaling. Journal of virology. 86, 3513-3527 (2012).
- Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu. Nature. 451, 425-430 (2008).
- Miyagi, E., Andrew, A. J., Kao, S., Strebel, K. Vpu enhances HIV-1 virus release in the absence of Bst-2 cell surface down-modulation and intracellular depletion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2868-2873 (2009).
- McNatt, M. W., Zang, T., Bieniasz, P. D. Vpu binds directly to tetherin and displaces it from nascent virions. PLoS pathogens. 9, e1003299 (2013).
- Manel, N., et al. A cryptic sensor for HIV-1 activates antiviral innate immunity in dendritic cells. Nature. 467, 214-217 (2010).
- Yan, N., Regalado-Magdos, A. D., Stiggelbout, B., Lee-Kirsch, M. A., Lieberman, J. The cytosolic exonuclease TREX1 inhibits the innate immune response to human immunodeficiency virus type 1. Nature immunology. 11, 1005-1013 (2010).
- Fonteneau, J. F., et al. Human immunodeficiency virus type 1 activates plasmacytoid dendritic cells and concomitantly induces the bystander maturation of myeloid dendritic cells. Journal of virology. 78, 5223-5232 (2004).
- Ankel, H., Capobianchi, M. R., Frezza, F., Castilletti, C., Dianzani, F. Interferon induction by HIV-1-infected cells: a possible role of sulfatides or related glycolipids. Virology. 221, 113-119 (1996).
- Schmidt, B., Ashlock, B. M., Foster, H., Fujimura, S. H., Levy, J. A. HIV-infected cells are major inducers of plasmacytoid dendritic cell interferon production, maturation, and migration. Virology. 343, 256-266 (2005).
- Bego, M. G., Dube, M., Mercier, J., Cohen, E. A. Effect of calcium-modulating cyclophilin ligand on human immunodeficiency virus type 1 particle release and cell surface expression of tetherin. Journal of virology. 83, 13032-13036 (2009).
- Grouard, G., et al. The enigmatic plasmacytoid T cells develop into dendritic cells with interleukin (IL)-3 and CD40-ligand. The Journal of experimental medicine. 185, 1101-1111 (1997).
- Fitzgerald-Bocarsly, P., Jacobs, E. S. Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection: striking a delicate balance. Journal of leukocyte biology. 87, 609-620 (2010).
- Bego MG,, Côté, É, Aschman, N., Mercier, J., Weissenhorn, W. Cohen ÉA. Exploits the Cross-Talk between BST2 and the ILT7 Receptor to Suppress Anti-HIV-1 Responses by Plasmacytoid Dendritic Cells. PLoS Pathog. 11 (7), e1005024 (2015).
