ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för samtidig framställning av neurala föregångare cellkulturer, som antingen vidhäftande monolager eller neurosfärer, från subventrikulära zonen och gyrus dentatus enskilda vuxna möss.
Abstract
Den neurosfär-analysen och den vidhäftande monoskiktsodlingssystemet är värdefulla verktyg för att fastställa den potentiella (proliferation eller differentiering) av vuxna neurala stamceller in vitro. Dessa analyser kan användas för att jämföra föregångaren potentialen av celler som isolerats från genetiskt olika eller differentiellt behandlade djur för att fastställa effekterna av exogena faktorer på neural gångare celltillväxt och differentiering och generera neurala föregångare cellinjer som kan analyseras över kontinuerliga passager. Neurosphere analysen används traditionellt för post hoc identifiering av stamceller, främst på grund av brist på definitiva markörer med vilka de kan isoleras från primär vävnad och har den stora fördelen av att ge en snabb uppskattning av siffror gångare cell i hjärnvävnad kommer från enskilda djur. Adherenta encellslagsodlingar däremot inte traditionellt används för att jämföra spridningen mellan enskilda djur, Eftersom varje kultur i allmänhet initieras från den kombinerade vävnaden på mellan 5-8 djur. De har dock den stora fördelen att, till skillnad från neurosfärer, de består av en till största delen homogen population av föregångarceller och är användbara för att följa den differentieringsprocess i enstaka celler. Här beskriver vi i detalj alstringen av neurosfärkulturer och, för första gången, adherenta kulturer från enskilda djur. Detta har många viktiga konsekvenser inklusive parade analyser av proliferation och / eller differentiering potential i både subventrikulära zonen (SVZ) och gyrus gyrus (GD) i behandlade eller genetiskt olika mus linjer, samt en betydande minskning av djuranvändning.
Introduction
Den neurosphere analys 1,2 och vidhäftande monolager kultur 3,4, båda utvecklade i början av 1990, fortfarande den gyllene standarden in vitro neurala stamcellsanalyser. I dessa analyser är primär vävnad mikro dissekerat från ett visst område i hjärnan, dissocieras till en enkelcellsuspension och odlades i närvaro av mitogener epidermal tillväxtfaktor (EGF) och fibroblast-tillväxtfaktor-2 (FGF2) för att bilda antingen fritt flytande kluster (neurosfärer) eller vidhäftande monolager. Båda systemen har ett antal fördelar och nackdelar och noggrann hänsyn bör tas till den fråga som ska lösas innan det ena eller det andra systemet väljs.
Neurosfärer tillåta en enkel avläsning av skillnaderna i prekursor cellantalet och potential. Dessutom neurosfärer är också ett användbart verktyg för att studera inneboende specifikation av cellerna när de tas bort från sin normala yttre miljön. Extrinsic ledtrådar kan studeras genom att helt enkelt lägga den faktor av intresse för tillväxtmediet och kvantifiera antalet och storleken på de neuro genereras. Den största nackdelen med neurosfärer är dock att de utgör en egen nisch, med cellerna vid mitten av neurosfärer (särskilt stora neurosfärer) är mer differentierad än de på ytan 5. Neuro innehåller en blandning av stamceller, stamceller och differentierade celler och cell-cell interaktioner inom neuro motverkar underhållet av stamceller. Därför neurospheres innehåller endast ett fåtal riktiga stamceller 6-8.
Adherenta encellslagsodlingar ger också en god in vitro-system för att modellera in vivo spridning. Adherenta kulturer, där cellerna förblir mer isolerade och homogena, kan eliminera den heterogena karaktären hos neurosphere. Under dessa tillväxtbetingelser prekursorcellerna proliferera rapiDLY och nästan alla celler delar sig och uttrycker de karakteristiska neurala föregångare markörer nestin, Sox2 och BLBP. Den största nackdelen med den monolagerkultur system jämfört med neurosfären analysen är att de enskilda förstadiepartiklama-härledda kloner inte kan följas och kvantifieras.
En nackdel med de flesta protokoll för båda typerna av kulturer har varit nödvändigt att använda relativt stort antal djur, eftersom avkastningen av isoleringsstrategier har ofta varit dålig. Samtidigt har det blivit tydligt att vuxna neurogenes bidrar till individualisering av hjärnan 9, vilket resulterar i behovet av individuellt ex vivo-modeller också. Dessa behov kan tillgodoses genom "en-mus-en-kultur"-protokoll som beskrivs i denna rapport.
Följande visuella protokoll beskriver samtidig framställning av neurala föregångare kulturer från både SVZ och GD för enskilda djur antingen som vidhäftande monolayers eller i form av neurosfärer. Den generation av kulturer från enskilda djur är särskilt användbart när jämförelser mellan individuellt behandlade djur eller olika individuella transgena eller vildtyp möss krävs. Detta protokoll innehåller detaljerade instruktioner för samtidig microdissection av SVZ och GD regioner från vuxna möss, deras avståndstagande till en enda cell suspension, in vitro-kultur som antingen vidhäftande encellslagsodlingar eller neurosfärer och analys av multipotentialitet och långsiktig potential, de två kardinal egenskaperna hos ett ben fide stamceller.
Protocol
1. Grundinställningar och Beredning av odlingsmedium
- Minst två dagar innan vi påbörjar experimentet, förbereda Poly-D-lysin (PDL) / laminin belagda plattor för fastsittande encellslagsodlingar. För framställning av brunnar / kolvar tillsätt tillräckligt PDL (10 mg / ml i dH 2 O) för att belägga ytan och inkubera över natten vid rumstemperatur. Avlägsna lösningen från skålen och tvätta skålen tre gånger med dH 2 O. Låt lufttorka. Lägg Laminin (5 mg / ml i kall DMEM: F12) och inkubera vid 37 ° C över natten. Avlägsna Laminin och antingen använda plattorna omedelbart eller förvara med laminin vid -20 ° C tills de behövdes.
- Förbered eld polerade pipetter med "medelstora" och "små" borrningar genom att rotera glaspasteurpipetter i en flamma till dess att kanterna blir rundade. Autoklav för att sterilisera.
- På dagen för dissektion, förbereda lämplig mängd odlingsmedium genom att blanda Neural bassubstratets med 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 mg / ml heparin, 50 enheter / ml penicillin / streptomycin, 20 ng / ml renad mus-receptor-grade epidermal tillväxtfaktor (EGF), och 20 ng / ml rekombinant bovint fibroblast-tillväxtfaktor (FGF-2). Värm odlingsmediet till 37 ° C i ett vattenbad.
- För SVZ dissociation förbereda 0,05% trypsin-EDTA och 0,125 mg / ml trypsininhibitor innehållande 0,01 mg / ml DNasI. Jämvikta dessa lösningar till 37 ° C.
- Inrätta en dissektion mikroskop och förbereda de verktyg som behövs för att ta bort hjärnan (sax och liten spatel) och för SVZ och GD dissektioner (skalpell, 27 G nål fäst till 1 ml spruta, 1 x # 7 pincett, 1 x # 5/45 pincett) efter blötläggning i 70% etanol.
2. Skörd av Adult Mouse Brains och SVZ / DG Microdissections
- Bedöva enda vuxen (8 veckor gamla) möss enligt lämpliga institutionella riktlinjer. Utför halsdislokation.
- Spray huvudet med 70% etanol för att sterilisera området och för att minimera mängden päls som endheres till saxen och hjärna. Använda vass sax decapitate djuret vid basen av hjärnstammen.
- Håll huvudet vid basen av skallen, skär skallen mellan de två lukt lökar genom att placera ett blad av en liten sax i varje öga hålrum och skär koronalt. Därefter gör två laterala snitt vid basen av skallen, följt av ett längsgående snitt genom skallen längs sagittala suturen Varning:. Se vinkeln på saxen är så grunt som möjligt för att undvika att skada den underliggande hjärnan.
- Exponera hjärnan genom att riva av skallen med antingen bladet i en sax eller ett par krökta pincett. Frigör hjärnan från skallen med användning av en liten spatel och placera i kall PBS.
- Skölj hjärnor med PBS för att avlägsna blod och päls.
- Överför hjärnor till en 10 cm plast petriskål med PBS
- Placera petriskål med hjärnan under ett dissektionsmikroskop vid låg förstoring och placera flätn på dess ventrala yta. Med fin böjd pincett bort lukt glödlampor medan du håller hjärnan på plats av lillhjärnan.
- Rotera hjärnan på den dorsala aspekten och med användning av en skalpell göra ett koronalt snitt genom hjärnan på nivån för den optiska chiasm
- Att microdissect SVZ (för mer detaljerade instruktioner, se även Azari et al. 10), placera det rostrala delen av hjärnan så att den skär koronala ytan är vänd uppåt och fokusera mikroskopet på en större förstoring. Ta bort och kasta septum med fina böjda pincett.
- Dissekera SVZ (det tunna skiktet av vävnad som omger ventrikeln) genom att placera spetsen på ett blad av ett par fina böjda pincett i den laterala hörnet av den laterala ventrikeln omedelbart under corpus callosum och de andra ungefär 1 mm i vävnaden omedelbart angränsande till ventrikeln. Tryck ner tången mot botten av skålen och mot den ventrala aspekten av VENTRICLE att avlägsna en liten triangulär bit vävnad. Placera dissekerade SVZ i en petriskål på is.
- Att microdissect GD (för mer detaljerade instruktioner, se även Hagihara et al. 11), placera den kaudala delen av hjärnan i petriskålen och skär längs den längsgående spricka med hjälp av en skalpell.
- Enligt en dissektion mikroskop, ta bort lillhjärnan och diencephalon med pincett.
- Fokusera mikroskopet så att gränserna kring GD är nu synliga. För att ta bort gyrus dentatus, in spetsen på en 27 G nål och glida längs gränsen mellan GD och Ammons horn. Med hjälp av fin pincett, befria GD från den omgivande vävnaden.
3. SVZ vävnadsdissociering
- Finhacka vävnad med hjälp av ett skalpellblad under ca 1 min tills inga stora bitar kvar.
- Överför den malda vävnaden i ett 15 ml rör med användning av 1 ml förvärmd 0,05% trypsin-EDTA och inkubera i 7 min iett vattenbad inställt på 37 ° C.
- För att stoppa den enzymatiska reaktionen, tillsätt 1 ml trypsin inhibitor innehåller DNasI och blanda innehållet genom att ställa röret.
- Pelle suspensionen genom centrifugering vid 300 x g under 5 min och kasta bort supernatanten
- Suspendera pelleten i 1 ml odlingsmedium och avstånd genom att försiktigt pipettera upp och ned ca 7-10x med hjälp av en P1000 pipett Varning:. Över finfördelning kan leda till ökad celldöd och kommer att negativt påverka efterföljande celltillväxt.
- Lägg till tillväxtmediet till en total volym av 5 ml och passera cellsuspensionen genom en 40 mm sikt för att avlägsna skräp och odissocierad vävnad klumpar.
- Centrifugera vid 300 x g under 5 min, kasta supernatanten och resuspendera den resulterande pelleten i 200 ml tillväxtmedium.
4. GD vävnadsdissociering
- Finhacka vävnad med hjälp av ett skalpellblad under ca 1 min tills inga stora bitar förblir och överföringin förvärmd PDD enzymblandning (Papain 2,5 U / ml, Dispas 1 U / ml, DNasI 250 U / ml). Inkubera under 20 minuter vid 37 ° C, och blanda genom att vända röret varje 3-5 min.
- Dissociera vävnaden mekaniskt med hjälp av ett medium borrning, brand polerat, pasteurpipett genom att pipettera upp och ner försiktigt 10x.
- Inkubera i ytterligare 10 min vid 37 ° C, och blanda genom att vända röret varje 3-5 min.
- Ytterligare dissociera vävnaden mekaniskt med hjälp av en liten borrning, brand polerad pasteurpipett genom att pipettera upp och ner försiktigt 10x.
- Centrifugera vid 130 x g under 5 min.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml buffertlösning (1x HBSS, 30 mM glukos, 2 mM HEPES (pH 7,4), 26 mM NaHCOs 3). Fyll upp till 10 ml med buffertlösningen.
- Centrifugera vid 130 x g under 5 min.
- Avlägsna supernatanten och suspendera pelleten i 5 ml 20% Percoll. (För framställning av 90% Percoll, tillsätt 4,5 ml av 100% Percoll till 0,5 ml av 10x PBS sedan ytterligare späda detta till 20%genom att tillsätta 1,1 ml 90% Percoll i 3,9 ml 1 x PBS).
- Centrifugera 450 xg under 15 min.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 10 ml buffert.
- Centrifugera vid 130 x g under 5 min.
- Återsuspendera pelleten i 200 | il tillväxtmedium.
5. Generation av vidhäftande monolager kulturer
- Plåt det dissocierade SVZ eller GD vävnad till en enda PDL / laminin belagda brunn i en 96-brunnars platta och inkubera vid 37 ° C med 5% CO2.
- Cirka 24 h efter plätering, när cellerna har vidhäftat till den belagda ytan, byta ut odlingsmediet för att ytterligare avlägsna överskott av smuts.
- Varje därpå följande 3-4 dagarna, utbyte hälften av odlingsmediet med färskt medium för att fylla på tillväxtfaktorer.
- Upprepa tills cellerna når cirka 80% konfluens och är redo att passe Anm. Tiden mellan plätering och den första passagen kan ta upp till 2-3 veckor.
- När kulturerna når ungefär 80% konfluens avlägsna mediet från brunnen och tvättas med PBS.
Obs: Låt inte cellerna att överstiga 90% confluency eftersom detta kan leda till avlossning av celler och neurosfären bildning och dessutom ökade nivåer av celldöd. - Lägg till 50 ml Accutase och inkubera vid 37 ° C i 2-3 min (kontroll för att se om cellerna är avrundade och fristående).
- Avlägsna cellerna till ett 15 ml rör och tvätta den väl en gång med PBS och överför till samma rör.
- Späd celler till 5 ml med PBS och centrifugera 300 xg under 5 min.
- För den första passagen, späd celler till 1 ml och plattan i en PDL / laminin belagda brunn i en 24 brunnars platta.
- För efterföljande passager, återsuspendera celler i 200 ml tillväxtmedium och räkna med användning av en hemocytometer. Platta vid en x 10 4 celler / cm 2 i lämplig storlek belagda brunnen eller kolv. i>
7. Differentiering av vidhäftande monolager kulturer
- För att skilja de vidhäftande monoskiktkulturer, tallriks prolifererande celler på PDL / Laminin-belagda täckglas vid en densitet av 1 x 10 4 celler / cm 2 i tillväxtmedium innehållande 20 ng / ml EGF och 10 ng / ml bFGF.
- När cellerna når ungefär 80% konfluens (normalt 2 dagar), ersätta tillväxtmediet med medium innehållande 5 ng / ml bFGF och 0 ng / ml EGF.
- Efter 2 dagar i 5 ng / ml bFGF, ersätta mediet med odlingsmedium i frånvaro av både mitogener i ytterligare 3 dagar Obs:. Under denna period en betydande mängd celldöd kommer att inträffa.
- Efter totalt 5 dagar, tvätta de differentierade cellerna med PBS för att avlägsna eventuella döda celler sedan fixa med 4% paraformaldehyd (PFA) i 20 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta en gång med PBS för att avlägsna eventuella PFA och lagra täckglas i brunnar i 1 ml PBS vid 4 ° C.
- Späd den dissocierade SVZ eller GD vävnad från ett djur i 20 ml odlingsmedium och plattan 200 ml / brunn på en 96-brunnars platta med användning av en 10 ml multidoser pipett.
- Inkubera vid 37 ° C med 5% CO2 under 6-7 dagar för SVZ-härledda neurosfärer och 10 till 12 dagar för GD-härledda neurosfärer.
Anmärkning: tillväxt under längre tid än de rekommenderade inkubationstiderna kommer att leda till överväxt och kommer att leda till celldöd i mitten av neurosfärer och / eller, spontana kvarstad och differentiering. - Räkna och mäta diametern av neurosfärerna med användning av en okularfokalplattan monteras på en upprättstående ljusmikroskop
9. Ympa om de Neurosfärer
Efter de primära neuro har räknats och deras storlek spelade de kan utökas över flera passager som börjar med antingen en enda neurosfär eller en bulk kultur.
- Bulk kultur neurosphere expansionen
- Till passage kombinerade neurosfärer som en bulkkultur, avlägsna mediet innehållande neurosfärerna från plattan, överför till en 15 ml rör och centrifugera vid 300 xg under 5 min.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera neurosfärer i en ml förvärmd 0,05% trypsin-EDTA och inkubera vid rumstemperatur under 3 min.
- Lägg till en lika stor volym av trypsin inhibitor innehåller DNasI och blanda väl.
- Centrifugera i 5 minuter vid 300 x g, avlägsna supernatanten och tillsätt 1 ml av tillväxtmediet.
- Finfördela upp och ner ca 10x med en P1000 pipett att skilja de neurosfärer.
- Ta 10 ml av cellsuspensionen och blanda med en lika stor volym av trypanblått och utföra ett levande cellräkning med användning av en hemocytometer.
- Reseed cellerna vid en densitet av 1 x 10 4 celler / cm 2 i lämplig storlek cellodlingsbrunn eller kolv.
- Inkubera vid 37 ° Cmed 5% CO2 tills sekundära neurosfärer form.
- Single expansionsneurosfär
- För passage individuella neurospheres väljer brunnar som innehåller en enda neurosfär och försiktigt bort och kassera cirka 160 l av tillväxtmediet från varje brunn utan att störa neurosphere.
- Tillsätt 100 ml av 0,05% trypsin-EDTA till varje brunn för att passe och inkubera vid rumstemperatur under 3 min.
- Addera 100 pl av trypsininhibitor innehållande DNAsel för att stoppa reaktionen.
- Finfördela ungefär 10 gånger upp och ner med en P200 pipett för att bryta isär neurosphere.
- Överför 200 ml innehållande den dissocierade neurosfär till en ny brunn i en 24-brunnars platta innehållande 1,5 ml odlingsmedium. Inkubera vid 37 ° C med 5% CO2 till dess sekundära neurosfärer form.
OBS: för att bestämma långsiktig potential, en av de huvudsakliga egenskaperna hos en sann neurala sTEM-cell, ska neurosfärer passe i minst 5-10 passager. Se även litteraturen om den delvis kontroversiell tolkning av dessa resultat 12-14.
10. Differentiering av neurosfärkulturer
Primära eller passe neurospheres kan differentieras för att bestämma multipotentialitet.
- Ta neurosfärer i suspension från deras odlingsplatta eller kolv och överföra dem till en 10 cm plast petriskål.
- Enligt en dissektion mikroskop bort ca 15-20 neurosfärer från mediet med hjälp av en P20 pipett och överför till en 24-brunnar innehåller odlingsmediet utan tillväxtfaktorer och en PDL / laminin belagda täckglas.
- Deri under ca 7 dygn vid 37 ° C med 5% CO2.
- Tvätta de differentierade neurospheres med PBS för att avlägsna eventuella döda celler sedan fixa med 4% PFA i 20 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta igen med PBS till rEFlytta någon PFA och lagra täckglas i brunnar i 1 ml PBS vid 4 ° C
11. Immunfärgning av neurosfären och Adherenta kulturer
Obs: För färgning med O4 kroppen utelämna Triton från blockerings och färgningssteg och kom ihåg att använda en lämplig IgM sekundär antikropp.
- Inkubera täckglas innehållande de differentierade neurosfärer eller adherenta monolagerkulturer i blockeringslösning (10% Normal Donkey serum i PBS innehållande 0,2% Triton X-100) under 60 min vid rumstemperatur.
- Inkubera i färsk blockeringslösning innehållande primär BIII-tubulin, Map2a + b, glia fibrillärt surt protein (GFAP) eller O4 antikroppar för 60min vid rumstemperatur.
- Tvätta 3x med PBS.
- Inkubera i färsk blockeringslösning innehållande lämpliga fluorescens-konjugerade sekundära antikroppar och 4,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, 1:5000) under 30 min vid rumstemperatur i mörker.
- Montera täckglas på objektglas med hjälp av fluorescens monteringsmedium och lufttorka i mörker över natten
- Visa och bild med hjälp av en fluorescensmikroskop.
Representative Results
Även om de två neurogena regioner i vuxen mus hjärnan både innehåller neurala föregångare celler, kan dessa celler beter sig helt annorlunda när de odlas in vitro. De vidhäftande encellslagsodlingar genereras från båda regionerna visas morfologiskt oskiljbara (figur 1 A), emellertid SVZ-härledda vidhäftande kulturer föröka snabbare och måste passe i genomsnitt 1-2 dagar tidigare än de som härrör från GD. Som neurosfärer, de SVZ-härledda prekursorceller föröka sig också snabbare och bilda större neurosfärer (Figur 1B) än GD-härledda prekursorceller (Figur 1C). Medan SVZ-härledda neuro vanligtvis räknas efter 6-7 dagar i kultur, är GD-härledda neurospheres vanligtvis kvantifieras efter 10-12 dagar. Dessutom har ett mycket större antal neurala prekursorceller uppe i SVZ jämfört med DG, vilket framgår av den nästan 10-faldigt större antalet neurosfärer, som kan vara släktenated från denna region (SVZ: 1173 ± 74,9 vs DG: 145,3 ± 26,4, p = <0,0001, n = 10 djur per grupp, fig. 2A).
Studier har visat att förstadiepartiklama celler i SVZ och GD svarar på olika stimuli. De föregångarceller i GD aktiveras av specifika typer av spatial inlärning och genom stimuli såsom anrikning miljö och fysisk aktivitet, medan SVZ prekursorceller aktiveras av olfaktoriska inlärning och olfaktorisk anrikning. I överensstämmelse med detta, en av oss (TLW) tidigare visat att generaldirektoratet innehåller en population av latent stam-och progenitorceller som kan aktiveras av neural excitation 15-18. Däremot fann vi att SVZ precursorceller reagerar helt annorlunda på denna stimulans, med en minskning av neurosphere nummer som svar på depolariserande nivåer av KCl 17. Här har vi upprepat detta experiment, plätering hälften av de isolerade celler från SVZ och GD för individual djur i depolariserande nivåer av KCl och den andra hälften i kontroll KCl nivåer. Vi visar, liksom tidigare, att även om GD prekursorcellerna aktiveras av depolarisation (101,2 ± 17,4 vs 184,8 ± 12,5, p = 0,005, n = 5 djur), är spridningen av SVZ-härledda celler faktiskt minskat avsevärt ( 368,0 ± 62,9 vs 266,6 ± 41,6, p = 0,02, n = 5 djur; Figur 2B).
För att bekräfta långsiktig potential, en av de huvudsakliga funktionerna i en sann stamcell, enkla neurosfärer eller fastsittande encellslagsodlingar måste kunna utökad utbyggnad dvs under minst 10 passager. Vid varje passage, efter framställningen av en singel-cellsuspension, antalet celler räknas och vecket expansionen beräknas. Den teoretiska cell Totalt beräknas sedan genom att multiplicera vecket expansionen under denna passage genom den teoretiska totala från den tidigare passagen. Detta är disp la som ett linjediagram med passagenummer plottades mot log 10 av den teoretiska totala cellantalet (se t.ex. figur 3). För att bekräfta multipotentialitet, kan både monolagerkulturer och neurosfärer differentieras genom mitogen tillbakadragande och visas ge upphov till både nervceller och glia (Figur 4).
. Figur 1 vuxen mus prekursorceller kan odlas som vidhäftande encellslagsodlingar (A) eller som neurosfärer (B: SVZ, C: GD).. Skala bar är 50 mm Klicka här för att visa en större bild.
load/51225/51225fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51225/51225fig2.jpg "/>
Figur 2. Signifikant fler neurosfärer genereras från SVZ jämfört med DG av enstaka möss (A). SVZ och GD precursorceller reagerar olika på in vitro depolarisation (B).
Figur 3. Att bekräfta långsiktig potentiering, är neurosfärer expanderas i mer än 10 passager.
Figur 4. Neurosfärer kan delas in i BIII-Tubulin + nervceller (A: röd), GFAP + astrocyter (A: grön), O4 + oligodendrocyter (B: röd) och MAP2ab + neuroner (C: röd). Klicka här för att visa en större bild.
Discussion
Denna uppsats presenterar ett detaljerat protokoll för att inleda neurala föregångare kulturer, såväl som vidhäftande monolager och neurosfärer, från de två stora neurogena regioner av den vuxna musen hjärnan. Det finns ett antal viktiga punkter som måste hållas i åtanke när du försöker någon av dessa in vitro odlingssystem. För det första är valet av dissociation metod mycket viktigt och är vävnadsberoende. I våra händer, är 0,05% trypsin-EDTA mycket effektivt för dissociation av SVZ vävnad, och resulterar i ett större antal neurosfärer än när man använder ett papain baserad dissociation teknik. För dissociation av GD vävnad dock rekommenderar vi starkt en papain baserad dissociation strategi. Vid direkt jämförelse mellan de två dissociation metoder på GD vävnad, observerade vi en betydligt lägre avkastning på levande celler och ungefär 10 gånger färre neurosfärer vid användning av trypsin. Denna skillnad i dissociation skulle kunna bero på skillnaden i vävnads composition mellan de två regionerna. Den kompakta vävnaden i GD omges av omfattande neuropil och omfattande skador av cellulära processer kan förekomma under dissociation.
En annan viktig punkt att notera är att även om neurosphere analysen kan vara bra att göra kvantitativa uttalanden om antalet prekursorceller som finns i ett givet vävnadsprov, viss försiktighet måste dock användas i tolkningen av dessa absoluta tal. Fusion av neurosfärer kan vara en viktig påverkande faktor. Flera studier har visat att nervceller är mycket rörliga och kan smälta, även under vad är förment "klonala" villkor 7,19. Det resulte neurosphere frekvens kan vara mycket beroende av faktorer inklusive mellankomponenter, dissektion förfarandet och dissociation processen. Även mellan erfarna lastare viss variation i antalet neurosfärer som genereras från förment identiska prover är uppenbar (se figur 1A.) Mer användbart, är en direkt jämförelse av utgångsfrekvensen mellan två givna prover (dvs. styrning kontra behandlad eller vildtyp kontra knock-out) hanteras av samma person i ett enda experiment, snarare än en kvantitativ rapport över total prekursorcell nummer.
När man beslutar vilken av de två odlingsmetoder är mest lämpad för ett visst experiment är det viktigt att notera att dessa två kultursystem skiljer sig åt i homogeniteten i de celltyper som genereras. I jämförelse med prolifererande vidhäftande cellkulturer, som visar en i stort sett homogen prekursorcell pool (~ 98% av cellerna är Sox2 +) 20, neurosfärer är mer heterogen och innehåller, liksom prolifererande prekursorceller, differentierade neuroner och astrocyter 21,22. Det är viktigt att de neurosfärer inte är odlade under längre perioder mellan passager som den större neurosfären blir desto mer sannolikt är det att hitta differentierade celltyper i sin kärna.
Vi initierar traditionellt vidhäftande monolayer neurala föregångare kulturer från GD vävnaden på mellan 5-8 möss. Därför, när man försöker fastställa de vidhäftande monolayer kulturer från GD eller SVZ av en enda mus, behöver den största omsorg som skall vidtas under det vävnadsdissociering förfarandet för att undvika överdriven celldöd orsakad av över finfördelning av vävnad, eller ta förlängas perioder mellan dissektion och slutliga odlingssteg. Detta protokoll beskriver, för första gången, generering av vidhäftande monolager föregångare kulturer från både SVZ och GD för enskilda djur. Det finns många tillfällen när jämförelsen av prekursor proliferation och differentiering måste göras på ett enda djur basis. Dessa inkluderar möjligheten att direkt jämföra GD och SVZ enskilda djur med hjälp av parade statistik och för att koppla ihop kultur data med enskilda beteendemässiga eller fysiologiska data 9. Enstaka djur kulturer också allåg användning av sällsynta transgena djur, där ålders-matchning en pool av 5-8 donatorer per kultur inte är möjligt, samt unika djur (t.ex. F2 kors eller ut uppfödda djur) för genetiska associationsstudier.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
TLW fick stöd av ett Marie Curie International Incoming Fellowship. Arbetet finansierades också från grundläggande institutionella medel, Bundesministerium für Bildung och Forschung (BMBF) finansiering och dels med stöd från Priority Research Program (SFB) 655 till GK. Författarna vill tacka Anne Karasinsky för vård och underhåll av alla djur som användes i denna studie och Odette Leiter, Susann Ruhwald, Fanny Böhme, och Richard Wetzel för cellodling och mikroskopi assistans.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280-5MG | |
| Laminin | Roche | 11243217001 | |
| Glass Pastuer pipettes | Volac | BS5732 | |
| DMEM:F12 (1:1) 1x | Life Technologies | 21331-020 | |
| Neural Basal Medium (1x) | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 supplements (50x) | Life Technologies | 17504-044 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-038 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Penacillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| bFGF | PeproTech | 100-18B | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| DNaseI | Roche | 10104159001 | |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| Papain | Worthington | LS003120 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| HBSS (with Calcium and Magnesium) | Life Technologies | 14025-050 | |
| Glucose | Roth | X997.2 | |
| HEPES | Sigma | H3375-500G | |
| NaHCO3 | Merck | K39347429847 | |
| 1 ml Syringes | Braun | 2016-10 | |
| 27 G Needles | Braun | 4657705 | |
| Scalpels (#22 disposable) | Braun | BA222 | |
| Dumont #7 forceps | FST | 11271-30 | |
| Dumont 5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Scissors | FST | 14060-10 | |
| Iris spatula | FST | 10093-13 | |
| 70% Ethanol | |||
| PBS | Life Technologies | 14040-091 | |
| flasks/well plates | TPP | 92696 | |
| PFA (4%) | Sigma | P6148 | |
| Hemocytometer | Marienfeld | 650010 | |
| Trypan blue (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| NDS | Millipore | 530 | |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Mouse monoclonal bIII-tubulin antibody | Promega | G712A | |
| Rabbit polyclonal glial fibrillary acidic protein antibody | Dako | 20334 | |
| O4 | R&D Systems | MAB1326 | |
| Map2a+b | Sigma | M1406 | |
| Donkey anti-mouse Cy3 antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-505-151 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa488 | Dianova | 711-545-152 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | 861405 | |
| Aqua Polymount | Polysciences Inc | 18606 | |
| 10 ml Combi tips | Eppendorf | 30089677 | |
| Plastic 10 ml and 25 ml serological pipettes | Corning | 4488/4489 | |
| EQUIPMENT | |||
| Pipetboy | Integra Biosciences | 521942 | |
| Multidoser pipette | Eppendorf | ||
| 37 °C waterbath | |||
| Dissecting microscope | |||
| 37 °C:5% CO2 incubator | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R |
References
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev. Biol. 175, 1-13 (1996).
- Palmer, T. D., Ray, J., Gage, F. H. FGF-2-responsive neuronal progenitors reside in proliferative and quiescent regions of the adult rodent brain. Mol. Cell. Neurosci. 6, 474-486 (1995).
- Ray, J., Raymon, H. K., Gage, F. H. Generation and culturing of precursor cells and neuroblasts from embryonic and adult central nervous system. Methods Enzymol. 254, 20-37 (1995).
- Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Res. 993, 18-29 (2003).
- Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G. Enriched monolayer precursor cell cultures from micro-dissected adult mouse dentate gyrus yield functional granule cell-like neurons. PLoS One. 2, (2007).
- Jessberger, S., Clemenson, G. D., Gage, F. H. Spontaneous fusion and nonclonal growth of adult neural stem cells. Stem Cells. 25, 871-874 (2007).
- Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12, 4565-4574 (1992).
- Freund, J., et al. Emergence of individuality in genetically identical mice. Science. 340, 756-759 (2013).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. , (2010).
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. J. Vis. Exp. , (2009).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol. Neurobiol. 34, 153-161 (2006).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell. Stem Cell. 8, 486-498 (2011).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres- re-evaluating the relationship. Nat. Methods. 2, 333-336 (2005).
- Walker, T. L., Turnbull, G. W., Mackay, E. W., Hannan, A. J., Bartlett, P. F. The latent stem cell population is retained in the hippocampus of transgenic Huntington's disease mice but not wild-type mice. PLoS One. 6, (2011).
- Walker, T. L., et al. Prolactin stimulates precursor cells in the adult mouse hippocampus. PLoS One. 7, (2012).
- Walker, T. L., et al. Latent stem and progenitor cells in the hippocampus are activated by neural excitation. J. Neurosci. 28, 5240-5247 (2008).
- Walker, T. L., et al. Prominin-1 allows prospective isolation of neural stem cells from the adult murine hippocampus. J. Neurosci. 33, (2013).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat. Methods. 3, 801-806 (2006).
- Babu, H., et al. A protocol for isolation and enriched monolayer cultivation of neural precursor cells from mouse dentate gyrus. Front. Neurosci. 5, 89 (2011).
- Parmar, M., Sjoberg, A., Bjorklund, A., Kokaia, Z. Phenotypic and molecular identity of cells in the adult subventricular zone in vivo and after expansion in vitro. Mol. Cell Neurosci. 24, 741-752 (2003).
- Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14506-14511 (2002).
Tags
Neurovetenskap prekursorcell neurosfär anhängare monolager subventrikulära zonen gyrus dentatus vuxen musErratum
Formal Correction: Erratum: One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice
Posted by JoVE Editors on 11/26/2014.
Citeable Link.
A correction was made to One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice. Many micro symbols were changed into milli symbols by accident: In the Protocols, sections 1.1, 1.3, 3.6, 3.7, 6.2, 6.6, 8.1, 9.1.6, 9.2.2, and 9.2.5 need to be fixed, as does Figure 1 description in the Results section.
Protocol section 1.1 was changed from:
At least two days prior to commencing the experiment, prepare Poly-D-lysine (PDL)/Laminin coated plates for adherent monolayer cultures. To prepare wells/flasks add enough PDL (10 mg/ml in dH2O) to coat the surface and incubate overnight at room temperature. Remove the solution from the dish and wash the dish three times with dH2O. Allow to air dry. Add Laminin (5 mg/ml in cold DMEM:F12) and incubate at 37 °C overnight. Remove the Laminin and either use the plates immediately or store with the Laminin at -20 °C until required.
to:
At least two days prior to commencing the experiment, prepare Poly-D-lysine (PDL)/Laminin coated plates for adherent monolayer cultures. To prepare wells/flasks add enough PDL (10 µg/ml in dH2O) to coat the surface and incubate overnight at room temperature. Remove the solution from the dish and wash the dish three times with dH2O. Allow to air dry. Add Laminin (5 µg/ml in cold DMEM:F12) and incubate at 37 °C overnight. Remove the Laminin and either use the plates immediately or store with the Laminin at -20 °C until required.
Protocol section 1.3 was changed from:
On the day of dissection, prepare the appropriate amount of culture medium by mixing Neural Basal Medium with 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 µg/ml heparin, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml purified mouse receptor-grade epidermal growth factor (EGF), and 20 ng/ml recombinant bovine fibroblast growth factor (FGF-2). Warm the culture medium to 37 °C in a water bath.
to:
On the day of dissection, prepare the appropriate amount of culture medium by mixing Neural Basal Medium with 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 mg/ml heparin, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml purified mouse receptor-grade epidermal growth factor (EGF), and 20 ng/ml recombinant bovine fibroblast growth factor (FGF-2). Warm the culture medium to 37 °C in a water bath.
Protocol section 3.6 was changed from:
Add growth medium to a total volume of 5 ml and pass the cell suspension through a 40 mm sieve to remove debris and undissociated tissue clumps.
to:
Add growth medium to a total volume of 5 ml and pass the cell suspension through a 40 µm sieve to remove debris and undissociated tissue clumps.
Protocol section 3.7 was changed from:
Centrifuge at 300 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the resulting pellet in 200 ml growth medium.
to:
Centrifuge at 300 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the resulting pellet in 200 µl growth medium.
Protocol section 6.2 was changed from:
Add 50 ml Accutase and incubate at 37 °C for 2-3 min (checking to see if the cells are rounded and detached).
to:
Add 50 µl Accutase and incubate at 37 °C for 2-3 min (checking to see if the cells are rounded and detached).
Protocol section 6.6 was changed from:
For subsequent passages, resuspend cells in 200 ml growth medium and count using a hemocytometer. Plate at 1 x 104 cells/cm2 in the appropriate sized coated well or flask.
to:
For subsequent passages, resuspend cells in 200 µl growth medium and count using a hemocytometer. Plate at 1 x 104 cells/cm2 in the appropriate sized coated well or flask.
Protocol section 8.1 was changed from:
Dilute the dissociated SVZ or DG tissue from one animal in 20 ml of culture medium and plate 200 ml/well across a 96-well plate using a 10 ml multidoser pipette.
to:
Dilute the dissociated SVZ or DG tissue from one animal in 20 ml of culture medium and plate 200 µl/well across a 96-well plate using a 10 ml multidoser pipette.
Protocol section 9.1.6 was changed from:
Remove 10 ml of the cell suspension and mix with an equal volume of trypan blue and perform a live cell count using a hemocytometer.
to:
Remove 10 µl of the cell suspension and mix with an equal volume of trypan blue and perform a live cell count using a hemocytometer.
Protocol section 9.2.2 was changed from:
Add 100 ml of 0.05% Trypsin-EDTA to each well to be passaged and incubate at room temperature for 3 min.
to:
Add 100 µl of 0.05% Trypsin-EDTA to each well to be passaged and incubate at room temperature for 3 min.
Protocol section 9.2.5 was changed from:
Transfer the 200 ml containing the dissociated neurosphere to a new well of a 24-well plate containing 1.5 ml of growth medium. Incubate at 37 °C with 5% CO2 until secondary neurospheres form.
to:
Transfer the 200 µl containing the dissociated neurosphere to a new well of a 24-well plate containing 1.5 ml of growth medium. Incubate at 37 °C with 5% CO2 until secondary neurospheres form.
Figure 1 description was updated from:
Figure 1. Adult mouse precursor cells can be cultured as adherent monolayer cultures (A) or as neurospheres (B: SVZ, C: DG). Scale bar is 50 mm.
to:
Figure 1. Adult mouse precursor cells can be cultured as adherent monolayer cultures (A) or as neurospheres (B: SVZ, C: DG). Scale bar is 50 µm.
