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Summary
यहाँ हम subventricular क्षेत्र और व्यक्तिगत वयस्क चूहों की दांतेदार गाइरस से, पक्षपाती monolayers या neurospheres रूप में या तो, तंत्रिका अग्रदूत सेल संस्कृतियों के एक साथ पीढ़ी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन.
Abstract
neurosphere परख और पक्षपाती monolayer संस्कृति प्रणाली संभावित विट्रो में वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के (प्रसार या भेदभाव) निर्धारित करने के लिए मूल्यवान उपकरण हैं. ये assays तंत्रिका अग्रदूत सेल प्रसार और भेदभाव पर exogenous कारकों के प्रभाव को निर्धारित करने और निरंतर अंश से अधिक assayed किया जा सकता है कि तंत्रिका अग्रदूत सेल लाइनों उत्पन्न करने के लिए आनुवंशिक रूप से अलग या विभिन्न इलाज जानवरों से अलग कोशिकाओं के अग्रदूत संभावित तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. neurosphere परख पारंपरिक रूप से मुख्य रूप से वे प्राथमिक ऊतक से अलग और मस्तिष्क के ऊतकों में अग्रदूत सेल नंबर की एक त्वरित अनुमान देने का प्रमुख लाभ दिया जा सकता है, जिसके साथ निश्चित मार्कर की कमी के कारण, स्टेम सेल के बाद अस्थायी पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है व्यक्तिगत जानवरों से निकाली गई. पक्षपाती monolayer संस्कृतियों, इसके विपरीत, पारंपरिक रूप से व्यक्ति पशुओं के बीच प्रसार की तुलना करने के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहे हैंप्रत्येक संस्कृति आम तौर पर 5-8 के बीच जानवरों के संयुक्त ऊतक से शुरू की है. हालांकि, वे neurospheres के विपरीत, वे अग्रदूत साबित कोशिकाओं के एक ज्यादातर सजातीय जनसंख्या से मिलकर और एकल कक्षों में भेदभाव प्रक्रिया के बाद के लिए उपयोगी होते हैं कि प्रमुख लाभ है. यहाँ, हम पहली बार के लिए, व्यक्ति पशुओं से पक्षपाती संस्कृतियों, विस्तार से, neurosphere संस्कृतियों की पीढ़ी का वर्णन है और. इस subventricular क्षेत्र (SVZ) और इलाज या आनुवंशिक रूप से अलग माउस लाइनों की दांतेदार गाइरस (डीजी) दोनों में प्रसार और / या भेदभाव की क्षमता की बनती विश्लेषण, साथ ही पशु के उपयोग में एक महत्वपूर्ण कमी सहित कई महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है.
Introduction
neurosphere परख 1,2 और पक्षपाती monolayer संस्कृति 3,4, दोनों 1990 के दशक में विकसित की है, अभी भी इन विट्रो तंत्रिका स्टेम सेल assays में सोने के मानक रहते हैं. इन assays में, प्राथमिक ऊतक एक विशेष मस्तिष्क क्षेत्र से सूक्ष्म विच्छेदित है, मुक्त अस्थायी या तो कारक -2 (FGF2) बनाने के लिए एक एकल कक्ष निलंबन और mitogens epidermal वृद्धि कारक (EGF) और fibroblast वृद्धि की उपस्थिति में सुसंस्कृत में अलग समूहों (neurospheres) या पक्षपाती monolayers. दोनों प्रणालियों के फायदे और नुकसान और सावधानी से विचार करने के लिए एक नंबर एक या अन्य प्रणाली को चुना है पहले संबोधित करने की है कि प्रश्न करने के लिए दिया जाना चाहिए है.
Neurospheres अग्रदूत सेल संख्या और क्षमता में अंतर का एक सीधा पढ़ने के लिए बाहर की अनुमति. इसके अलावा, neurospheres भी अपने सामान्य बाहरी वातावरण से निकाल दिया जब कोशिकाओं के आंतरिक विनिर्देश अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण हैं. Extrinइस प्रकार से cues बस मध्यम विकास के लिए ब्याज की कारक जोड़ने और उत्पन्न neurospheres की संख्या और आकार बढ़ाता द्वारा अध्ययन किया जा सकता है. neurospheres की बड़ी खामी हालांकि, वे सतह 5 पर उन लोगों की तुलना में अधिक विभेदित किया जा रहा neurospheres (विशेष रूप से बड़े neurospheres) के केंद्र में कोशिकाओं के साथ, अपने स्वयं के आला कि फार्म है. Neurospheres स्टेम सेल, प्रतिबद्ध progenitors, और विभेदित कोशिकाओं और neurospheres भीतर सेल सेल बातचीत स्टेम कोशिकाओं के रखरखाव प्रतिक्रिया का मिश्रण होते हैं. Neurospheres सच स्टेम कोशिकाओं 6-8 की केवल एक छोटा सा संख्या में होते हैं यही कारण है.
पक्षपाती monolayer संस्कृतियों भी विवो प्रसार में मॉडल के लिए एक अच्छा इन विट्रो प्रणाली प्रदान करते हैं. कोशिकाओं को और अधिक अलग और सजातीय रहते हैं जिसमें पक्षपाती संस्कृतियों, neurosphere की विषम प्रकृति को खत्म कर सकते हैं. इन विकास परिस्थितियों अग्रदूत साबित कोशिकाओं rapi पैदा करनाdly और लगभग सभी कोशिकाओं को विभाजित और विशेषता तंत्रिका अग्रदूत मार्करों nestin, Sox2, और BLBP व्यक्त कर रहे हैं. neurosphere परख की तुलना में monolayer संस्कृति प्रणाली का बड़ा नुकसान व्यक्तिगत अग्रदूत व्युत्पन्न क्लोन और निगरानी की मात्रा निर्धारित करने में असमर्थ रहे हैं.
अलगाव रणनीतियों की उपज अक्सर गरीब किया गया है क्योंकि संस्कृतियों के दोनों प्रकार के लिए सबसे प्रोटोकॉल की एक खामी है, जानवरों की अपेक्षाकृत बड़ी संख्या का उपयोग करने के लिए आवश्यकता हो गया है. उसी समय, यह वयस्क neurogenesis के रूप में अच्छी तरह से व्यक्तिगत पूर्व vivo मॉडल के लिए की जरूरत है, जिसके परिणामस्वरूप मस्तिष्क 9 के वैयक्तिकरण के लिए योगदान देता है कि स्पष्ट हो गया है. इस रिपोर्ट में वर्णित के रूप में इन आवश्यकताओं "एक माउस, एक संस्कृति" प्रोटोकॉल से मुलाकात कर सकते हैं.
निम्न Visual प्रोटोकॉल SVZ और महानिदेशक व्यक्ति पशुओं के रूप में या तो पक्षपाती एम दोनों से तंत्रिका अग्रदूत संस्कृतियों के एक साथ पीढ़ी का वर्णनonolayers या neurospheres के रूप में. व्यक्तिगत जानवरों से संस्कृतियों की पीढ़ी को व्यक्तिगत रूप से पशुओं का इलाज या विभिन्न व्यक्तिगत ट्रांसजेनिक या जंगली प्रकार चूहों के बीच तुलना के लिए आवश्यक हैं जब विशेष रूप से उपयोगी है. इस प्रोटोकॉल में विस्तृत वयस्क चूहों से SVZ और महानिदेशक क्षेत्रों के एक साथ microdissection के लिए निर्देश, एक एकल कक्ष निलंबन में उनके हदबंदी, पक्षपाती monolayer संस्कृतियों या neurospheres और multipotentiality और दीर्घकालिक क्षमता का विश्लेषण रूप में या तो इन विट्रो संस्कृति, दो कार्डिनल शामिल एक हड्डी फाइड स्टेम सेल के गुण.
Protocol
1. बुनियादी सेटअप और संस्कृति के माध्यम से तैयार करना
- कम से कम दो दिन पहले प्रयोग शुरू करने से, पाली-D-लाइसिन (पीडीएल) / laminin पक्षपाती monolayer संस्कृतियों के लिए प्लेटें लेपित तैयार करते हैं. कुओं / बोतल कोट सतह के लिए पर्याप्त पीडीएल (DH 2 हे में 10 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ने के लिए और कमरे के तापमान पर रातोंरात सेते तैयार करने के लिए. डिश से समाधान निकालें और DH 2 ओ के साथ पकवान तीन बार धोने शुष्क हवा करने की अनुमति दें. Laminin (ठंड DMEM में 5 मिलीग्राम / एमएल: F12) जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते. Laminin निकालें और या तो तुरंत प्लेटों का उपयोग करें या जब तक आवश्यक -20 डिग्री सेल्सियस पर laminin के साथ दुकान.
- गोल किनारों बनने तक एक लौ में कांच पाश्चर pipettes घूर्णन द्वारा "मध्यम" और "" छोटे तंग करती है साथ आग पॉलिश pipettes तैयार करें. बाँझ आटोक्लेव.
- विच्छेदन के दिन, 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 मिलीग्राम / एमएल हेपरिन, साथ तंत्रिका बेसल मध्यम मिश्रण से संस्कृति के माध्यम से उचित मात्रा में तैयार 50 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 20 एनजी / एमएल शुद्ध माउस रिसेप्टर ग्रेड epidermal वृद्धि कारक (EGF), और 20 एनजी / एमएल पुनः संयोजक गोजातीय fibroblast वृद्धि कारक (FGF-2). एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस के लिए संस्कृति के माध्यम गर्म.
- SVZ हदबंदी के लिए, 0.05% trypsin EDTA के लिए तैयार है और 0.125 मिलीग्राम / एमएल Trypsin 0.01 मिलीग्राम / एमएल DNaseI युक्त अवरोध करनेवाला. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए इन समाधान संतुलित करना
- एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप सेट और मस्तिष्क (कैंची और छोटा सा रंग) को हटाने और SVZ और महानिदेशक dissections (स्केलपेल, 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी 27 जी सुई, 1 एक्स # 7 संदंश, 1 एक्स # 5/45 के लिए करने के लिए आवश्यक उपकरण तैयार 70% इथेनॉल में भिगोने से संदंश).
2. वयस्क माउस दिमाग और SVZ / डीजी Microdissections की कटाई
- उपयुक्त संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार एक वयस्क (8 सप्ताह पुराने) चूहों anesthetize. ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन करना.
- क्षेत्र बाँझ और फर की मात्रा को कम करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ सिर स्प्रे कि एककैंची और मस्तिष्क को dheres. का प्रयोग तेज कैंची मस्तिष्क स्तंभ के आधार पर पशु वध करना.
- हर आंख गुहा में कैंची का एक छोटा सा जोड़ी में से एक ब्लेड रखने और coronally काटने से दो घ्राण बल्ब के बीच खोपड़ी कटौती, खोपड़ी के आधार पर सिर पकड़. . कैंची के कोण अंतर्निहित मस्तिष्क को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए संभव के रूप में उथले है सुनिश्चित: अगला, सावधानी बाण के समान सीवन के साथ खोपड़ी के माध्यम से एक अनुदैर्ध्य काट द्वारा पीछा खोपड़ी के आधार पर दो पार्श्व में कटौती, बनाते हैं.
- कैंची की ब्लेड या घुमावदार संदंश की एक जोड़ी के साथ या तो खोपड़ी वापस छीलने से मस्तिष्क बेनकाब. ठंड पीबीएस में एक छोटा सा रंग और जगह का उपयोग कर खोपड़ी से मस्तिष्क को मुक्त.
- रक्त और फर दूर करने के लिए पीबीएस के साथ दिमाग कुल्ला.
- पीबीएस युक्त एक 10 सेमी प्लास्टिक पेट्री डिश के लिए दिमाग स्थानांतरण
- कम बढ़ाई पर एक विदारक खुर्दबीन के नीचे मस्तिष्क युक्त पेट्री डिश प्लेस और बीआरएआई की स्थितिअपने उदर की सतह पर एन. सेरिबैलम से स्थिति में मस्तिष्क जबकि पकड़े ठीक घुमावदार संदंश का प्रयोग घ्राण बल्ब हटा दें.
- पृष्ठीय पहलू पर मस्तिष्क घुमाएँ और एक स्केलपेल का उपयोग ऑप्टिक chiasm के स्तर पर मस्तिष्क के माध्यम से एक राज्याभिषेक काट कर
- SVZ microdissect करने के लिए (अधिक विस्तृत निर्देशों के लिए, Azari एट अल. 10 भी देखें), कटौती राज्याभिषेक सतह से ऊपर की तरफ का सामना कर रहा है, ताकि मस्तिष्क की विजय - स्तम्भ हिस्से जगह और एक उच्च वृद्धि पर खुर्दबीन ध्यान केंद्रित. निकालें और ठीक घुमावदार संदंश का उपयोग पट त्यागें.
- तुरंत ऊतक में तुरंत महासंयोजिका और अन्य लगभग 1 मिमी के तहत पार्श्व वेंट्रिकल की पार्श्व कोने में ठीक घुमावदार संदंश की एक जोड़ी में से एक ब्लेड की नोक रखकर SVZ (निलय आसपास के ऊतक की पतली परत) काटना निलय से सटे. डिश के आधार की ओर और ventr के उदर पहलू की ओर संदंश नीचे प्रेसICLE ऊतक का एक छोटा सा त्रिकोणीय टुकड़ा दूर करने के लिए. बर्फ पर एक पेट्री डिश में विच्छेदित SVZ रखें.
- डीजी microdissect करने के लिए (अधिक विस्तृत निर्देशों के लिए, Hagihara एट अल. 11 भी देखें), पेट्री डिश और एक स्केलपेल का उपयोग अनुदैर्ध्य विदर के साथ काटा में मस्तिष्क की दुम भाग जगह है.
- एक विच्छेदन खुर्दबीन के तहत, संदंश का उपयोग सेरिबैलम और diencephalon हटा दें.
- डीजी के आसपास सीमाओं अब दिखाई दे रहे हैं तो माइक्रोस्कोप refocus. दांतेदार गाइरस निकालने के लिए, महानिदेशक और अम्मोनियों के सींग के बीच सीमा पर एक 27 जी सुई और स्लाइड की नोक डालें. ठीक संदंश का प्रयोग, आसपास के ऊतकों से महानिदेशक को मुक्त.
3. SVZ ऊतक हदबंदी
- कोई बड़े टुकड़े रहना जब तक लगभग 1 मिनट के लिए एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग ऊतक क़ीमा.
- Prewarmed 0.05% trypsin EDTA के 1 मिलीलीटर का उपयोग कर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब कीमा बनाया हुआ ऊतक स्थानांतरण और में 7 मिनट के लिए सेतेएक पानी के स्नान 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट
- , Enzymatic प्रतिक्रिया रोक DNaseI युक्त trypsin अवरोध के 1 मिलीलीटर जोड़ने और ट्यूब flicking द्वारा सामग्री मिश्रण करने के लिए.
- 5 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा निलंबन गोली और सतह पर तैरनेवाला त्यागने
- मध्यम विकास के 1 मिलीलीटर में गोली Resuspend और धीरे एक P1000 विंदुक सावधानी का उपयोग कर नीचे लगभग 7-10x ऊपर pipetting और से अलग कर देना. Triturating अधिक बढ़ कोशिका मृत्यु का कारण बन सकता है और नकारात्मक बाद सेल के विकास पर असर होगा.
- 5 मिलीलीटर की कुल मात्रा को मध्यम विकास जोडें और मलबे और undissociated ऊतक clumps को दूर करने के लिए एक 40 मिमी चलनी के माध्यम से सेल निलंबन गुजरती हैं.
- 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 200 मिलीलीटर मध्यम विकास में जिसके परिणामस्वरूप गोली resuspend.
4. डीजी ऊतक हदबंदी
- कोई बड़े टुकड़े रहना और स्थानांतरण तक लगभग 1 मिनट के लिए एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग ऊतक क़ीमाprewarmed PDD एंजाइम मिश्रण (Papain 2.5 यू / एमएल, Dispase 1 यू / एमएल, DNaseI 250 यू / एमएल) में. ट्यूब हर 3-5 मिनट inverting द्वारा मिश्रण, 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेते हैं.
- यंत्रवत् एक मध्यम बोर का उपयोग ऊतक अलग कर देना, धीरे नीचे 10x ऊपर pipetting और से, पाश्चर पिपेट पॉलिश आग.
- ट्यूब हर 3-5 मिनट inverting द्वारा मिश्रण, 37 डिग्री सेल्सियस पर एक और 10 मिनट के लिए सेते हैं.
- इसके अलावा यंत्रवत् एक छोटे बोर का उपयोग ऊतक अलग कर देना, आग धीरे नीचे 10x ऊपर pipetting और से पाश्चर पिपेट पॉलिश.
- 5 मिनट के लिए 130 XG पर अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला निकालें और 1 मिलीलीटर बफर समाधान (1x HBSS, 30 मिमी ग्लूकोज, 2 मिमी HEPES (पीएच 7.4), 26 मिमी 3 NaHCO) में गोली resuspend. बफर समाधान के साथ 10 मिलीलीटर अप करें.
- 5 मिनट के लिए 130 XG पर अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला निकालें और 20% Percoll के 5 मिलीलीटर में गोली resuspend. (0.5 10x पीबीएस के मिलीलीटर के लिए 100% Percoll के 4.5 मिलीलीटर जोड़ने, Percoll 90% तैयार करने के लिए फिर आगे 20% करने के लिए इस पतला3.9 मिलीलीटर 1x पीबीएस) के लिए 1.1 मिलीलीटर 90% Percoll जोड़कर.
- 15 मिनट के लिए 450 XG अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला निकालें और 10 एमएल बफर में गोली resuspend.
- 5 मिनट के लिए 130 XG पर अपकेंद्रित्र.
- 200 μl मध्यम विकास में गोली Resuspend.
5. पक्षपाती Monolayer संस्कृतियों का सृजन
- एक 96 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से लेपित एक एकल पीडीएल / laminin में अलग SVZ या डीजी ऊतक प्लेट और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- कोशिकाओं लेपित सतह का पालन किया है एक बार लगभग 24 घंटे चढ़ाना के बाद, आगे की अतिरिक्त मलबा हटाने के लिए मध्यम विकास का आदान प्रदान.
- हर बाद 3-4 दिन, वृद्धि कारकों की भरपाई करने के लिए नए सिरे से मध्यम से मध्यम विकास के आदान प्रदान के आधा.
- . कोशिकाओं लगभग 80% confluency तक पहुँचने और passaged होने के लिए तैयार नोट कर रहे हैं जब तक दोहराएँ: चढ़ाना और पहले पारित होने के बीच के समय 2-3 सप्ताह का समय लग सकता है.
- संस्कृतियों लगभग 80% confluency तक पहुँचने जब अच्छी तरह से मध्यम हटाने और पीबीएस के साथ धो लो.
नोट: कोशिका मृत्यु के स्तर में वृद्धि, यह कोशिकाओं की टुकड़ी और neurosphere गठन के लिए और इसके अलावा में नेतृत्व कर सकते हैं के रूप में कोशिकाओं 90 confluency% से अधिक की अनुमति न दें. - 50 मिलीलीटर Accutase जोड़ें और 2-3 मिनट (कोशिकाओं गोल और अलग कर रहे हैं, तो देखने के लिए जाँच) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- एक 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए कोशिकाओं को हटाने और अच्छी तरह से पीबीएस के साथ एक बार धोने और एक ही ट्यूब को हस्तांतरण.
- 5 पीबीएस के साथ मिलीग्राम और 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र 300 XG के लिए कोशिकाओं पतला.
- पहले पारित होने के लिए, 1 मिलीलीटर कोशिकाओं को कमजोर और एक 24 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से लेपित एक पीडीएल / laminin में थाली.
- बाद के मार्ग के लिए, 200 मिलीलीटर मध्यम विकास और गिनती एक hemocytometer का उपयोग में resuspend कोशिकाओं. प्लेट 1 में 10 x 4 कोशिकाओं उचित आकार लेपित अच्छी तरह से या कुप्पी में / 2 सेमी. मैं>
7. पक्षपाती Monolayer संस्कृतियों की भिन्नता
- 20 एनजी / एमएल EGF और 10 एनजी / एमएल bFGF युक्त मध्यम विकास में 1 एक्स 10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी की एक घनत्व पर पीडीएल / laminin लेपित coverslips पर पक्षपाती monolayer संस्कृतियों, थाली proliferating कोशिकाओं को अलग करने के लिए.
- कोशिकाओं लगभग 80% confluency (आमतौर पर 2 दिन) तक पहुँचने, मध्यम 5 एनजी / एमएल bFGF और 0 एनजी / एमएल EGF युक्त मध्यम विकास की जगह.
- 5 एनजी / एमएल bFGF में 2 दिनों के बाद, एक और 3 दिनों के लिए दोनों mitogens के अभाव में मध्यम विकास के साथ मध्यम जगह नोट:. इस अवधि के दौरान कोशिका मृत्यु का एक महत्वपूर्ण राशि घटित होगा.
- 5 दिनों के कुल के बाद, कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ तय तो किसी भी मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए पीबीएस के साथ विभेदित कोशिकाओं धो लो.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर पीबीएस में वेल्स में किसी भी पीएफए और दुकान coverslips हटाने के लिए पीबीएस के साथ फिर से धो लें
- संस्कृति के माध्यम से 20 मिलीलीटर में एक जानवर से अलग SVZ या डीजी ऊतक पतला और एक 10 मिलीलीटर multidoser पिपेट का उपयोग कर एक 96 अच्छी तरह से थाली भर में 200 मिलीग्राम / अच्छी तरह से थाली.
- डीजी व्युत्पन्न neurospheres के लिए SVZ व्युत्पन्न neurospheres और 10-12 दिनों के लिए 6-7 दिनों के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
नोट: ये सिफारिश ऊष्मायन बार से अधिक समय के लिए विकास अतिवृद्धि का परिणाम देगा और neurospheres और / या, सहज लगाव और भेदभाव के केंद्र में कोशिका मृत्यु को बढ़ावा मिलेगा. - गणना और एक ईमानदार प्रकाश माइक्रोस्कोप के लिए फिट एक ऐपिस रेखाजाल का उपयोग neurospheres के व्यास उपाय
9. Neurospheres Passaging
प्राथमिक neurospheres गिना गया है और उनके आकार दर्ज करने के बाद वे एक भी neurosphere या एक थोक संस्कृति के साथ या तो शुरुआत कई मार्ग में विस्तार किया जा सकता है.
- थोक संस्कृति neurosphere विस्तार
- एक थोक संस्कृति के रूप में पारित होने के संयुक्त neurospheres करने के लिए, 5 मिनट के लिए 300 XG पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र के लिए स्थानांतरण, थाली से neurospheres युक्त मध्यम निकालें.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और prewarmed 0.05% trypsin EDTA के 1 मिलीलीटर में neurospheres resuspend और 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- DNaseI युक्त trypsin अवरोध करनेवाला के एक बराबर मात्रा में जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से.
- 300 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला निकालें और मध्यम विकास के 1 मिलीलीटर जोड़ें.
- Neurospheres अलग कर देना करने के लिए एक P1000 विंदुक के साथ ऊपर और नीचे लगभग 10x Triturate.
- सेल निलंबन के 10 एमएल निकालें और trypan नीले रंग की एक समान मात्रा के साथ मिश्रण और एक hemocytometer का उपयोग एक जीवित कोशिका गिनती प्रदर्शन करते हैं.
- उचित आकार के सेल में अच्छी तरह से संस्कृति या कुप्पी में / 2 सेमी 1 एक्स 10 4 कोशिकाओं के घनत्व पर कोशिकाओं reseed.
- 37 में सेते डिग्री सेल्सियस5% सीओ 2 के साथ माध्यमिक neurospheres फार्म तक.
- सिंगल neurosphere विस्तार
- पारित होने के लिए व्यक्ति neurospheres एक एकल neurosphere होते हैं कि कुओं का चयन और ध्यान से neurosphere परेशान बिना प्रत्येक अच्छी तरह से मध्यम विकास के लगभग 160 μl हटाने और त्यागें.
- प्रत्येक अच्छी तरह से passaged जा करने के लिए 0.05% trypsin EDTA के 100 मिलीलीटर जोड़ें और 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- प्रतिक्रिया को रोकने के लिए DNAseI युक्त अवरोध करनेवाला trypsin के 100 μl जोड़ें.
- महीन चुर्ण बनाना लगभग 10 बार और neurosphere अलग तोड़ने के लिए एक P200 विंदुक के साथ नीचे.
- मध्यम विकास की 1.5 एमएल युक्त एक 24 अच्छी तरह से थाली का एक नया अच्छी तरह से करने के लिए अलग neurosphere युक्त 200 मिलीलीटर स्थानांतरण. माध्यमिक neurospheres फार्म तक 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
नोट: दीर्घकालिक क्षमता, एक सच्चे तंत्रिका एस के प्रमुख गुणों में से एक निर्धारित करने के लिएमंदिर सेल, neurospheres कम से कम 5-10 मार्ग के लिए passaged किया जाना चाहिए. यह भी इस तरह के परिणाम 12-14 का में हिस्सा विवादास्पद व्याख्या पर साहित्य देखें.
10. Neurosphere संस्कृतियों की भिन्नता
प्राथमिक या passaged neurospheres multipotentiality निर्धारित करने के लिए भेदभाव किया जा सकता है.
- उनकी संस्कृति थाली या कुप्पी से निलंबन में neurospheres निकालें और एक 10 सेमी प्लास्टिक पेट्री डिश को हस्तांतरण.
- एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे एक P20 पिपेट का उपयोग मध्यम से लगभग 15-20 neurospheres हटाने और वृद्धि कारक है और एक पीडीएल / laminin लेपित coverslip के बिना संस्कृति के माध्यम युक्त एक 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए स्थानांतरण.
- 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 7 दिनों के लिए अलग है.
- कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 4% पीएफए के साथ तय तो किसी भी मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए पीबीएस के साथ भेदभाव neurospheres धो लें.
- आर पीबीएस के साथ फिर से धो लें4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर पीबीएस में वेल्स में किसी भी पीएफए और दुकान coverslips emove
11. Neurosphere और पक्षपाती संस्कृतियों के immunostaining
नोट: O4 एंटीबॉडी के साथ धुंधला के लिए ट्राइटन अवरुद्ध और धुंधला कदम से न आना और एक उपयुक्त आईजीएम माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए याद है.
- कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए समाधान (पीबीएस में 10% सामान्य गधा सीरम 0.2% ट्राइटन X-100 युक्त) को रोकने में भेदभाव neurospheres या पक्षपाती monolayer संस्कृतियों युक्त coverslips सेते हैं.
- प्राथमिक bIII ट्यूबिलिन, Map2a + बी, glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) या कमरे के तापमान पर 60min के लिए O4 एंटीबॉडी युक्त ताजा अवरुद्ध समाधान में सेते हैं.
- पीबीएस के साथ 3x धो लें.
- उपयुक्त प्रतिदीप्ति संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी और 4,6-diamidino-2-phenylindole युक्त ताजा अवरुद्ध समाधान में सेते (DAPI; 1:5,000) अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए.
- अंधेरे में रात भर में प्रतिदीप्ति बढ़ते मध्यम और शुष्क हवा का उपयोग कर खुर्दबीन स्लाइड पर coverslips माउंट
- एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर देखें और छवि.
Representative Results
वयस्क माउस मस्तिष्क दोनों के दो तंत्रिकाजन्य क्षेत्रों तंत्रिका कोशिकाओं अग्रदूत होते हैं हालांकि जब इन विट्रो में सुसंस्कृत, इन कोशिकाओं को काफी अलग तरीके से व्यवहार कर सकते हैं. दोनों क्षेत्रों से उत्पन्न पक्षपाती monolayer संस्कृतियों हालांकि, SVZ व्युत्पन्न पक्षपाती संस्कृतियों तेजी से पैदा करना और 1-2 दिन पहले महानिदेशक से व्युत्पन्न उन लोगों से, औसत पर, passaged होने की जरूरत है, (चित्रा 1 ए) आकृति विज्ञान अप्रभेद्य दिखाई देते हैं. Neurospheres के रूप में, SVZ व्युत्पन्न कोशिकाओं अग्रदूत भी तेजी से पैदा करना और महानिदेशक व्युत्पन्न अग्रदूत साबित कोशिकाओं (चित्रा 1C) से बड़ी neurospheres (चित्रा 1 बी) के रूप में. SVZ व्युत्पन्न neurospheres आमतौर पर संस्कृति में 6-7 दिनों के बाद गिने जाते हैं, whilst महानिदेशक व्युत्पन्न neurospheres आमतौर पर 10-12 दिन के बाद मात्रा निर्धारित कर रहे हैं. पीढ़ी हो सकता है कि neurospheres के लगभग 10 गुना अधिक से अधिक संख्या इसका सबूत के रूप में इसके अलावा, तंत्रिका कोशिकाओं के अग्रदूत तक अधिक से अधिक संख्या, महानिदेशक की तुलना SVZ में रहते हैंइस क्षेत्र से टेड (SVZ: डीजी बनाम 1173 ± 74.9: 145.3 ± 26.4, पी = 0.0001 <; एन = समूह में 10 पशुओं, 2A चित्रा).
अध्ययन SVZ और डीजी के भीतर अग्रदूत साबित कोशिकाओं विभिन्न उत्तेजनाओं का जवाब है कि पता चला है. SVZ अग्रदूत साबित कोशिकाओं घ्राण सीखने और घ्राण संवर्धन द्वारा सक्रिय कर रहे हैं जबकि डीजी में अग्रदूत साबित कोशिकाओं, स्थानिक सीखने के लिए विशेष प्रकार से और इस तरह पर्यावरण संवर्धन और शारीरिक गतिविधि के रूप में उत्तेजनाओं से सक्रिय कर रहे हैं. इस के अनुरूप, हमें (TLW) में से एक पहले से डीजी तंत्रिका उत्तेजना 15-18 से सक्रिय किया जा सकता है कि अव्यक्त स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की आबादी है जिसमें प्रदर्शन किया. इसके विपरीत, हम SVZ अग्रदूत साबित कोशिकाओं KCl 17 के स्तर depolarizing के जवाब में neurosphere संख्या में कमी के साथ, काफी अलग इस उत्तेजना का जवाब मिल गया. यहाँ, हम इंडस्ट्रीज़ की SVZ और महानिदेशक से व्युत्पन्न अलग कक्षों का आधा चढ़ाना, इस प्रयोग को दोहराया हैKCl का स्तर और नियंत्रण KCl स्तर में अन्य आधा depolarizing में जानवरों ividual. हम (डीजी अग्रदूत साबित कोशिकाओं विध्रुवण (101.2 ± 17.4 बनाम 184.8 ± 12.5, पी = 0.005, एन = 5 जानवरों) द्वारा सक्रिय कर रहे हैं, जबकि SVZ व्युत्पन्न कोशिकाओं के प्रसार को वास्तव में काफी कमी आई है, के रूप में पहले, का प्रदर्शन 368.0 ± 62.9 बनाम 266.6 ± 41.6, पी = 0.02, एन = 5 जानवरों, चित्रा 2 बी).
दीर्घकालिक क्षमता, एक सच स्टेम सेल, एकल neurospheres या पक्षपाती monolayer संस्कृतियों के कार्डिनल सुविधाओं में से एक की पुष्टि करने के लिए कम से कम 10 अंश से अधिक यानी विस्तारित विस्तार करने में सक्षम होना चाहिए. प्रत्येक पारित होने पर, एक एकल कक्ष निलंबन की तैयारी के बाद, कोशिकाओं की संख्या में गिना जाता है और गुना विस्तार गणना की है. सैद्धांतिक सेल कुल तो पिछले पारित होने से सैद्धांतिक कुल द्वारा कि पारित होने के दौरान गुना विस्तार गुणा करके गणना की है. इस disp है बीतने संख्या के साथ एक लाइन ग्राफ के रूप में रखी (उदाहरण चित्रा 3 देखें) सैद्धांतिक कुल सेल नंबर के log10 के खिलाफ साजिश रची है. Multipotentiality पुष्टि करने के लिए, दोनों monolayer संस्कृतियों और neurospheres माइटोजन वापसी से भेदभाव किया जा सकता है और दोनों न्यूरॉन्स को जन्म देने के लिए दिखाया जाना, और glia (चित्रा 4).
.. चित्रा 1 वयस्क माउस अग्रदूत साबित कोशिकाओं पक्षपाती monolayer संस्कृतियों (ए) के रूप में या neurospheres (: SVZ, सी: बी डीजी) के रूप में संवर्धित किया जा सकता है. स्केल बार 50 मिमी है बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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चित्रा 2. गौरतलब अधिक neurospheres एकल चूहों के महानिदेशक की तुलना SVZ से उत्पन्न कर रहे हैं (एक). SVZ और महानिदेशक अग्रदूत साबित कोशिकाओं में इन विट्रो विध्रुवण (बी) के लिए अलग प्रतिक्रिया.
चित्रा 3. दीर्घकालिक potentiation पुष्टि करने के लिए, neurospheres पर 10 अंश के लिए विस्तारित कर रहे हैं.
चित्रा 4. Neurospheres bIII-tubu में भेदभाव किया जा सकता हैलिन + न्यूरॉन्स (ए: लाल), GFAP + astrocytes (ए: हरा), O4 + oligodendrocytes (बी: लाल) और Map2ab + न्यूरॉन्स (सी: लाल). बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
Discussion
इस पत्र वयस्क माउस मस्तिष्क के दो प्रमुख तंत्रिकाजन्य क्षेत्रों से तंत्रिका अग्रदूत संस्कृतियों, के रूप में पक्षपाती monolayers और neurospheres दोनों, की दीक्षा के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है. इन में इन विट्रो संस्कृति प्रणालियों में से किसी का प्रयास करते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए कि महत्वपूर्ण बिंदुओं में से एक नंबर रहे हैं. सबसे पहले, पृथक्करण विधि का चुनाव बहुत महत्वपूर्ण है और ऊतक निर्भर है. हमारे हाथ में, 0.05% trypsin EDTA SVZ ऊतक की हदबंदी के लिए बहुत प्रभावी है, और एक papain आधारित हदबंदी तकनीक का उपयोग कर जब से neurospheres के एक उच्च संख्या में परिणाम है. डीजी ऊतक की हदबंदी के लिए हालांकि, हम दृढ़ता से एक papain आधारित हदबंदी दृष्टिकोण की सिफारिश. सीधे डीजी ऊतक पर दो हदबंदी तरीकों की तुलना, हम व्यवहार्य कोशिकाओं के एक काफी कम उपज मनाया और trypsin का उपयोग करते समय लगभग कम neurospheres 10 गुना. हदबंदी में यह अंतर ऊतक compositio में अंतर के कारण हो सकता हैदोनों क्षेत्रों के बीच एन. डीजी की कॉम्पैक्ट ऊतक व्यापक neuropil से घिरा हुआ है और सेलुलर प्रक्रियाओं की व्यापक क्षति हदबंदी के दौरान हो सकता है.
नोट करने के लिए एक दूसरा महत्वपूर्ण बिंदु neurosphere परख एक दिया ऊतक के नमूने में मौजूद अग्रदूत साबित कोशिकाओं की संख्या के बारे में मात्रात्मक बयान करने के लिए उपयोगी हो सकता है, जबकि कुछ सावधानी, हालांकि, इन निरपेक्ष संख्या की व्याख्या में नियोजित किया जाना चाहिए, कि है. Neurospheres का फ्यूजन एक प्रमुख confounding कारक हो सकता है. कई अध्ययनों से न्यूरॉन्स अत्यधिक गतिशील हैं और यहां तक कि माना जाता है कि 'प्रतिरूप' शर्तों 7,19 क्या कर रहे हैं के तहत, फ्यूज कर सकते हैं कि पता चला है. परिणामस्वरूप neurosphere आवृत्ति मध्यम घटकों, विच्छेदन की प्रक्रिया और पृथक्करण की प्रक्रिया सहित कारकों पर निर्भर हो सकता है. यहां तक कि अनुभवी आकाओं के बीच माना जाता है कि समान नमूने से उत्पन्न neurospheres की संख्या में कुछ बदलाव (चित्रा 1 ए को देखने से स्पष्ट है.) अधिक उपयोगी, दिए गए दो नमूने (यानी नियंत्रण बनाम इलाज या जंगली प्रकार बनाम नाक आउट) बल्कि कुल का एक मात्रात्मक बयान से, एक ही प्रयोग के भीतर एक ही व्यक्ति द्वारा नियंत्रित के बीच अग्रदूत आवृत्ति के एक प्रत्यक्ष तुलना है अग्रदूत सेल नंबर.
यह इन दो संस्कृति प्रणालियों उत्पन्न सेल प्रकार की एकरूपता में मतभेद है कि नोट करना महत्वपूर्ण है एक विशेष रूप से प्रयोग के लिए सबसे अनुकूल है, दो संस्कृति तरीकों की जो जब फैसला. एक काफी सजातीय अग्रदूत सेल पूल (~ कोशिकाओं के 98% Sox2 +) कर रहे हैं जो बताते हैं पक्षपाती सेल संस्कृतियों, proliferating की तुलना में 20, neurospheres अधिक विषम हैं और होते हैं, साथ ही proliferating कोशिकाओं अग्रदूत, विभेदित न्यूरॉन्स, और astrocytes 21,22. यह neurospheres बड़े रूप में मार्ग के बीच विस्तारित अवधि के लिए सुसंस्कृत नहीं कर रहे हैं यह महत्वपूर्ण है कि यह अपने मूल में विभेदित सेल प्रकार मिल रहा है और अधिक होने की संभावना बन neurosphere.
हम पारंपरिक रूप से 5-8 के बीच चूहों के महानिदेशक ऊतक से पक्षपाती monolayer तंत्रिका अग्रदूत संस्कृतियों आरंभ. एक माउस के महानिदेशक या SVZ से पक्षपाती monolayer संस्कृतियों स्थापित करने का प्रयास करते हैं, इसलिए, अत्यंत सावधानी ऊतक के triturating से अधिक की वजह से अत्यधिक कोशिका मृत्यु से बचने के लिए ऊतक हदबंदी की प्रक्रिया के दौरान उठाए जाने की जरूरत है, या विस्तारित लेने विच्छेदन और अंतिम संवर्धन कदम के बीच समय की अवधि. इस प्रोटोकॉल, पहली बार के लिए, का वर्णन व्यक्ति पशुओं के SVZ और डीजी दोनों से पक्षपाती monolayer अग्रदूत संस्कृतियों की पीढ़ी. अग्रदूत प्रसार और भेदभाव की तुलना एक भी पशु आधार पर किए जाने की जरूरत है जब कई उदाहरण हैं. ये सीधे डीजी और बनती आँकड़ों का उपयोग कर व्यक्ति पशुओं के SVZ तुलना करने के लिए और व्यक्तिगत व्यवहार या शारीरिक डेटा 9 के साथ संस्कृति डेटा युग्मित करने की क्षमता शामिल है. एकल जानवर संस्कृतियों भी अलआनुवंशिक संघ अध्ययन के लिए उम्र से मिलान संस्कृति प्रति 5-8 दाताओं की एक पूल संभव नहीं है, जहां दुर्लभ ट्रांसजेनिक जानवर,, साथ ही अद्वितीय जानवरों (जैसे F2 पार या बाहर नस्ल के पशुओं) के कम उपयोग.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
TLW एक मैरी क्यूरी इंटरनेशनल आने वाली फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया. यह काम भी बुनियादी संस्थागत धन से वित्तपोषित किया गया था, Bundesministerium Bildung और Forschung (BMBF) धन और आंशिक रूप से जी.के. को प्राथमिकता रिसर्च प्रोग्राम (SFB) 655 से समर्थन के साथ फर. लेखकों की देखभाल और सभी इस अध्ययन में प्रयुक्त जानवर और Odette लीटर, Susann Ruhwald, फैनी Boehme, और सेल संस्कृति और माइक्रोस्कोपी सहायता के लिए रिचर्ड Wetzel के रखरखाव के लिए ऐनी Karasinsky धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280-5MG | |
| Laminin | Roche | 11243217001 | |
| Glass Pastuer pipettes | Volac | BS5732 | |
| DMEM:F12 (1:1) 1x | Life Technologies | 21331-020 | |
| Neural Basal Medium (1x) | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 supplements (50x) | Life Technologies | 17504-044 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-038 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Penacillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| bFGF | PeproTech | 100-18B | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| DNaseI | Roche | 10104159001 | |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| Papain | Worthington | LS003120 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| HBSS (with Calcium and Magnesium) | Life Technologies | 14025-050 | |
| Glucose | Roth | X997.2 | |
| HEPES | Sigma | H3375-500G | |
| NaHCO3 | Merck | K39347429847 | |
| 1 ml Syringes | Braun | 2016-10 | |
| 27 G Needles | Braun | 4657705 | |
| Scalpels (#22 disposable) | Braun | BA222 | |
| Dumont #7 forceps | FST | 11271-30 | |
| Dumont 5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Scissors | FST | 14060-10 | |
| Iris spatula | FST | 10093-13 | |
| 70% Ethanol | |||
| PBS | Life Technologies | 14040-091 | |
| flasks/well plates | TPP | 92696 | |
| PFA (4%) | Sigma | P6148 | |
| Hemocytometer | Marienfeld | 650010 | |
| Trypan blue (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| NDS | Millipore | 530 | |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Mouse monoclonal bIII-tubulin antibody | Promega | G712A | |
| Rabbit polyclonal glial fibrillary acidic protein antibody | Dako | 20334 | |
| O4 | R&D Systems | MAB1326 | |
| Map2a+b | Sigma | M1406 | |
| Donkey anti-mouse Cy3 antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-505-151 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa488 | Dianova | 711-545-152 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | 861405 | |
| Aqua Polymount | Polysciences Inc | 18606 | |
| 10 ml Combi tips | Eppendorf | 30089677 | |
| Plastic 10 ml and 25 ml serological pipettes | Corning | 4488/4489 | |
| EQUIPMENT | |||
| Pipetboy | Integra Biosciences | 521942 | |
| Multidoser pipette | Eppendorf | ||
| 37 °C waterbath | |||
| Dissecting microscope | |||
| 37 °C:5% CO2 incubator | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R |
References
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तंत्रिका विज्ञान अंक 84 अग्रदूत सेल neurosphere पक्षपाती monolayer subventricular क्षेत्र दांतेदार गाइरस वयस्क माउसErratum
Formal Correction: Erratum: One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice
Posted by JoVE Editors on 11/26/2014.
Citeable Link.
A correction was made to One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice. Many micro symbols were changed into milli symbols by accident: In the Protocols, sections 1.1, 1.3, 3.6, 3.7, 6.2, 6.6, 8.1, 9.1.6, 9.2.2, and 9.2.5 need to be fixed, as does Figure 1 description in the Results section.
Protocol section 1.1 was changed from:
At least two days prior to commencing the experiment, prepare Poly-D-lysine (PDL)/Laminin coated plates for adherent monolayer cultures. To prepare wells/flasks add enough PDL (10 mg/ml in dH2O) to coat the surface and incubate overnight at room temperature. Remove the solution from the dish and wash the dish three times with dH2O. Allow to air dry. Add Laminin (5 mg/ml in cold DMEM:F12) and incubate at 37 °C overnight. Remove the Laminin and either use the plates immediately or store with the Laminin at -20 °C until required.
to:
At least two days prior to commencing the experiment, prepare Poly-D-lysine (PDL)/Laminin coated plates for adherent monolayer cultures. To prepare wells/flasks add enough PDL (10 µg/ml in dH2O) to coat the surface and incubate overnight at room temperature. Remove the solution from the dish and wash the dish three times with dH2O. Allow to air dry. Add Laminin (5 µg/ml in cold DMEM:F12) and incubate at 37 °C overnight. Remove the Laminin and either use the plates immediately or store with the Laminin at -20 °C until required.
Protocol section 1.3 was changed from:
On the day of dissection, prepare the appropriate amount of culture medium by mixing Neural Basal Medium with 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 µg/ml heparin, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml purified mouse receptor-grade epidermal growth factor (EGF), and 20 ng/ml recombinant bovine fibroblast growth factor (FGF-2). Warm the culture medium to 37 °C in a water bath.
to:
On the day of dissection, prepare the appropriate amount of culture medium by mixing Neural Basal Medium with 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 mg/ml heparin, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml purified mouse receptor-grade epidermal growth factor (EGF), and 20 ng/ml recombinant bovine fibroblast growth factor (FGF-2). Warm the culture medium to 37 °C in a water bath.
Protocol section 3.6 was changed from:
Add growth medium to a total volume of 5 ml and pass the cell suspension through a 40 mm sieve to remove debris and undissociated tissue clumps.
to:
Add growth medium to a total volume of 5 ml and pass the cell suspension through a 40 µm sieve to remove debris and undissociated tissue clumps.
Protocol section 3.7 was changed from:
Centrifuge at 300 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the resulting pellet in 200 ml growth medium.
to:
Centrifuge at 300 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the resulting pellet in 200 µl growth medium.
Protocol section 6.2 was changed from:
Add 50 ml Accutase and incubate at 37 °C for 2-3 min (checking to see if the cells are rounded and detached).
to:
Add 50 µl Accutase and incubate at 37 °C for 2-3 min (checking to see if the cells are rounded and detached).
Protocol section 6.6 was changed from:
For subsequent passages, resuspend cells in 200 ml growth medium and count using a hemocytometer. Plate at 1 x 104 cells/cm2 in the appropriate sized coated well or flask.
to:
For subsequent passages, resuspend cells in 200 µl growth medium and count using a hemocytometer. Plate at 1 x 104 cells/cm2 in the appropriate sized coated well or flask.
Protocol section 8.1 was changed from:
Dilute the dissociated SVZ or DG tissue from one animal in 20 ml of culture medium and plate 200 ml/well across a 96-well plate using a 10 ml multidoser pipette.
to:
Dilute the dissociated SVZ or DG tissue from one animal in 20 ml of culture medium and plate 200 µl/well across a 96-well plate using a 10 ml multidoser pipette.
Protocol section 9.1.6 was changed from:
Remove 10 ml of the cell suspension and mix with an equal volume of trypan blue and perform a live cell count using a hemocytometer.
to:
Remove 10 µl of the cell suspension and mix with an equal volume of trypan blue and perform a live cell count using a hemocytometer.
Protocol section 9.2.2 was changed from:
Add 100 ml of 0.05% Trypsin-EDTA to each well to be passaged and incubate at room temperature for 3 min.
to:
Add 100 µl of 0.05% Trypsin-EDTA to each well to be passaged and incubate at room temperature for 3 min.
Protocol section 9.2.5 was changed from:
Transfer the 200 ml containing the dissociated neurosphere to a new well of a 24-well plate containing 1.5 ml of growth medium. Incubate at 37 °C with 5% CO2 until secondary neurospheres form.
to:
Transfer the 200 µl containing the dissociated neurosphere to a new well of a 24-well plate containing 1.5 ml of growth medium. Incubate at 37 °C with 5% CO2 until secondary neurospheres form.
Figure 1 description was updated from:
Figure 1. Adult mouse precursor cells can be cultured as adherent monolayer cultures (A) or as neurospheres (B: SVZ, C: DG). Scale bar is 50 mm.
to:
Figure 1. Adult mouse precursor cells can be cultured as adherent monolayer cultures (A) or as neurospheres (B: SVZ, C: DG). Scale bar is 50 µm.
