Summary
このレポートでは、短い持続軽麻酔下マウスにおける腰椎脊髄におけるsiRNAのローカライズされたトランスフェクションのための髄腔内針穿刺の簡便かつ迅速な技術が記載されている。
Abstract
このレポートでは、カテーテル注入のすなわち独立した非侵襲的な方法で、急性くも膜下針注射技術に関するステップバイステップガイドを、説明しています。この手術法の技術的な制限は、手のフィネスにある。注射は、特に訓練された実験のために、迅速であり、この技術では、組織破壊が最小であるので、反復注射が可能であり、外来ツールにさらに免疫反応が起こらず、それによってより良く読み出すより具体的に与えること（ 例えばカテーテル）。脊髄変調の。物質の適用は、主として脊髄の標的領域に制限されるので、薬物は、大用量で適用する必要はなく、他の組織でのより重要なのは望ましくない効果は、全身送達で観察されるように、1を回避することができる2。また、我々はpolyethylenimの助けを借りて、核酸のin vivoトランスフェクションで、この手法を組み合わせるINE（PEI）の薬理学的薬剤の配信だけでなく、遺伝子、RNA、およびタンパク質モジュレーターを経由して 、脊椎の機能を研究するための多大な汎用性を提供し、試薬3、。
Introduction
脊髄は加工や痛みを伴う（侵害受容性）の入力4-7の送信を含む主要な生物学的プロセスおよび生理的機能の様々な非常に重要な中心地です。様々な実験技術は、髄腔内カテーテル8、脊髄マイクロインジェクション、および髄腔内注射針9の慢性的注入として、脊髄の薬理学的調節を容易にするために開発されてきた。それぞれの手法には独自の利点と欠点があり、実験パラダイムによっては一つの技術は、他よりも適しているかもしれません。髄内へのカテーテルの慢性的注入はラットにおいて容易に実現可能であるのに対して、この方法は、サイズの制限が指定され、マウスでは非常に困難である。成功率は非常に低く、運動障害は、しばしば、マウスにおいて厳しく限定さ硬膜下腔カテーテルのかさばる存在に起こる。また、薬の長期的な配信が頻繁な血液凝固にレンダリングされる慢性的に注入されたカテーテルの。最後に、免疫反応が一般的です。
これらの問題は、マウスの脊髄への薬物および試薬の迅速かつ解剖学的に制限されたアプリケーションを可能にしますpreimplantedカテーテルの非存在下で針を介して急性髄腔内注射の方法を使用して回避することができる。この方法は、完全に脊椎低減投与量および制限副作用を可能にする調節、ならびに物質がない送達する能力の特異性のような他の全身送達経路（ 例えば 、経口、静脈内、腹腔内等 ）上の髄腔内送達の利点を保持する髄腔内注射の間、針が硬膜と脊髄の間に挿入されているため、通常は血液脳関門を通過しない。しかしながら重要なことには、髄腔内送達の他の方法と比較して、髄腔内注射針注入法では、多数のアプリケーションを可能にする、最小侵襲性で任意のかなりの組織損傷を引き起こしたり、異物の移植による免疫反応を惹起せずに同じ動物。ただし、有効性を可能にするために、針の非常に正確な標的化のための技術的なスキルが必要です。
ここでは、視覚的に具体的に腰部脊髄を標的化するための最適な成功率を達成するための方法を示す。この実験で選択される注射部位は、脊髄脊椎を損傷する可能性を最小限にするために、終了に近いところ、L5およびL6脊椎動物列間の溝である。また、我々は、siRNAを用いた脊髄中の遺伝子をノックダウンするために、この技術の使用を示す。
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Protocol
すべての動物に使用する手順は、ローカルの管理組織（Regierungspräsidiumカールスルーエ、カールスルーエ、ドイツ）が定める倫理指針に従った。
1。のsiRNA / PEI複合体の調製
以下のようなsiRNA / PEI複合体溶液を製造業者の指示を用いて調製される。
- 溶液A：端体積の四分の一までの無菌水を有するsiRNAの所望の量（必要な場合）で希釈し、端体積の半分まで10％グルコース溶液を上にして、さらにこれを希釈する。ボルテックス優しく上下にピペッティングにより混和する。 siRNAの最適量は、経験的に決定される必要があるが、動物あたり10μlの複合体溶液中の1μgのsiRNAは、最適化のための良い出発点である。
- 溶液B：エンドボリュームの4分の1に滅菌水を上にして、PEI試薬の必要な量を希釈し、最終体積の半分、10％グルコース溶液を上にしてこれをさらに希釈する。渦GEntlyまたは上下にピペッティングにより混和する。
注意：PEI試薬の量は、トランスフェクションの効率に影響の複合体中のイオンバランスを決定します。同様に、PEI溶液の最適量は、経験的に決定されなければならない。私たちの手では、最適量は1μgのsiRNAのあたりのPEI溶液を0.12μLです。 - 溶液Bと溶液Aを混合一斉に、穏やかにボルテックス。
- 使用前にRTで15分間混合液をインキュベートする。この複合体は、4℃でRTで2時間および24時間安定である
2。髄膜注射
- それが正向反射の兆候を示していないまで、3％イソフルランでマウスを麻酔。加えて、さらなる麻酔の状態を確実にするために、テールおよび/または足のピンチレフをチェック。
- 針挿入時に良好な視覚化を容易にするために、尾の付け根付近の動物の後方端部に毛皮の約2 cm 2とを剃る。
- マウスを所定の位置に手順の間に継続的なイソフルランの投与のためのノーズコーン、1.5％イソフルランを削減し、目の潤滑剤で、マウスの目をカバーしています。
- 針に30のG 0.5に添付25μlのハミルトンシリンジを使用したsiRNAの混合溶液を使用する準備が準備します。
- 最も顕著な1であること、静かにそれを押すことで、この領域を中心に、脊椎動物の列を修正する必要のある、L6の棘突起の位置を確認します。
- 慎重にL5およびL6椎骨の溝との間に針を挿入し、このサインが硬膜内空間での針の成功エントリを示すのでテールフリックを観察。
ヒント：指の爪を使用して、1が同様に溝を見つけることができるはずです。 - テイルフリックが観察されたら、すぐに、しかし慎重に、一方の手で針位置を固定し、他方をゆっくりと物質の所望量を注入する。
ヒント：5〜10μlの間のボリュームがボリュームとして最適である5未満＆＃181、Lは信頼性が低く、10μLよりも大きなボリュームがあまりにも多くの圧力につながる。 - 噴射が行われた後、麻酔から回復するためにケージに戻ってマウスを移動します。
- 標的遺伝子の最適なダウンレギュレーションを達成するために、この注射を少なくとも2回以上24時間毎に繰り返します。
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Representative Results
成功した注入を例証するために、我々は成体のC57Bl6マウス（8〜10週齢）にファストグリーンFCF染料を使用してこの手法を行った。動物は、染料が拡散し、次いでCO 2過剰投与により殺しするのに十分な時間を提供するために、注入後数分間回復させた。その後、脊椎動物の列には、解剖し脊髄を露出させた。拡散色素に対応する青色の斑点は、注射部位をマーク。脊髄への損傷の兆候は、この手法（ 図1A）の最小限の侵襲性を確認した、見られなかった。注入された色素は、わずか数分の注入（ 図1B）の後に、脊髄の胸部領域まで到達し、吻側注射部位から拡散。また硬膜外腔の染料の成功注入は、内部（ 図1C）、脊髄の染色表面によって証明ではなく、可能性があります。
ビボトランスフェクションのに非常に有効なsiRNAを可能にしました。 siRNAを髄腔内送達した後（3回、一回ごとに24時間）、背L3-L5脊髄組織に由来する溶解物に対してターゲット蛋白質（ここではWAVE1）の発現がタンパク質レベルで約70％に減少した（ 図2A、N = 20）だけでなく、mRNAレベルでの（ 図2B、N = 6）。また、同様の大きさのダウンレギュレーションはまた、腹側部分の溶解物に見られる（ 図2C、n = 4）をすることができる。興味深いことに、やや強いダウンレギュレーションもまた、（ 図2D、n = 4）の頸髄の溶解物において見られた。しかし、同様の方法は、脊髄10の外部組織における遺伝子をダウンレギュレートするために使用されているという事実にもかかわらず、我々の手でこのダウンレギュレーションは、脳（ 図2E、n = 4）にも、DRの溶解液では観察されなかったGsは（ 図2F、n = 4）であった。
図1。ファストグリーン染料と非侵襲的な、急性髄腔内注射の後、顕微鏡下で解剖し、脊髄。 、組織損傷の目に見える兆候は、色素涙点でマークされた、注射部位に見られない。、B、吻側方向への色素が徐々に拡散することを示し、注射後の脊髄数分切除。白いボックスには、腰部をマークし、星は、注射部位をマークします。C、脊髄（セグメントL3-L5）の表面に特異的な染色が、脊髄のではないインテリア。 R =吻側、C =尾、CC =中心管。 こちらをクリック拡大画像を表示します。
図2。その後 、背側と腹側、 脊髄（ここでWAVE1）ターゲットタンパク質の正常なダウンレギュレーションは、髄腔内siRNA送達後のマウスに髄腔内対照siRNAまたはsiRNAは3回連続して、24時間、PEI試薬と混合WAVE1を標的とするいずれかを注射した腰椎脊髄のセクション（セグメント3-5）、頸髄、脳とDRGをウェスタンブロッティングおよび定量RT-PCRを、切除し、溶解し、実施した。AB、ウェスタンブロッティング（N = 20）と定量RT-PCR（N =腰椎脊髄の背側部分の溶解物からの6）の定量化、腹側のL3〜L5脊髄、頸髄、脳とのDRG respeの溶解物から、CFウェスタンブロッティング定量化ctively（n = 4）であった。分析では、対応のないスチューデントのt検定（* P≤0.05、** P≤0005）であった。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
従って、髄腔内注射針の上記の技術は、有効な高速、特異的に局在し、かつ非破壊的である。技術的には、この手順の最も重要な側面は、溝に針の挿入のポイントです。それは、この手順は非常に穏やかに手と忍耐で行われていることが重要です。多くの外科的処置と同様に、トレーニングが成功した注入速度を向上させます。実際の実験中に、この手法は、直接注射が成功したか否かを確認するために、明白な指標を提供しないので、これもまた重要である。正しい針の挿入の唯一の目に見える指標は、バスレフとして観測されるテールフリックです。
この方法は、完全にそのような投与量および低減を制限する副作用を可能にする脊椎変調の特異性のような他のsystemical送達経路（ 例えば 、経口、静脈内、腹腔内等 ）、上髄腔内送達の利点を保持する。ファーthermore、髄腔内注射は、通常、髄腔内注射の際ので、血液脳関門を通過しないれる物質の送達を可能にする、針が硬膜と脊髄の間に挿入される。しかし、重要なことに、髄腔内送達の他の方法と比較して、髄腔内注射針注入法は、任意のかなりの組織損傷を引き起こしたり、異物の移植による免疫反応を惹起することなく、同じ動物において多数の用途を可能にする、最小侵襲性である。
全体として、本稿では、どこのin vivo siRNAトランスフェクションおよび脊髄内の特定の遺伝子のノックダウンでは、だけでなく、急性くも膜下針注射への基本的なステップバイステップのガイドを示しただけでなく、この技術の即興の例を報告しているコードを達成することができる。薬理学的試薬およびPEI促進siRNA送達の送達の他に、髄腔内針注射方法は、otのを容易にするために使用することができるこのようなウイルス媒介遺伝子送達11として遺伝子導入の彼女のタイプ。十分な専門知識が得られていると、この手順は、覚醒、nonanesthetizedマウスに4,12麻酔なしで行うことができる。これは過度のストレスを防止するためにpreacclimatizedであるマウスを提供行動パラダイムに薬理学的薬剤の急性効果を研究するために、例えば、有効になります。
このように、急性髄腔内注射は、脊髄後角での研究のための非常に有用なツールを構成しており、技術の汎用性は実験者が自分の目的に合わせてカスタマイズし、即興することができます。
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Disclosures
著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In Vivo-jetPEI | Polyplus | 201-10G | |
| WAVE1 siRNA | Santa Cruz | sc-36832 | |
| Control siRNA-A | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Anti-ß-Tubulin III antibody | Sigma | T2200 | |
| Anti-WAVE1 antibody | R&D Systems | AF5514 | |
| Fast green dye | Sigma | F-7252 | |
| Isoflurane | Baxter | ||
| Isoflurane setup | Dräger Lübeck | ||
| Shaver | Wella | ||
| Hamilton syringe Gastight 1702 | Hamilton | ||
| 30 G 1/2 in 13 mm Needle | BD Microlance | 304000 | |
| Microscope Leica MS5 | Leica | ||
| WAVE1 forward primer for qRT-PCR | Sigma | cacagagcctcaggacagg | |
| WAVE1 reversed primer for qRT-PCR | Sigma | cttttcaccaacggcatctt | |
| FastStart Essential DNA Green Master | Roche | 6402712001 |
References
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