Her beskriver vi en protokoll basert på epigenetisk reprogrammering av humane embryonale stamceller (hESCs) mot å generere en homogen befolkning av skjelettmuskel progenitors at under ettergivende kultur forhold danner tre-dimensjonale klynger av kontraktile myofibers (myospheres), som rekapitulere biologiske trekk ved menneskelig skjelettmuskulatur.
Generering av en homogen og rikelig populasjon av skjelettmuskel-celler fra humane embryoniske stamceller (hESCs) er en forutsetning for celle-basert terapi og for en "sykdom i et fat" modell for human neuromuskulære sykdommer. Store hindringer, slik som lav mengde og heterogenitet av populasjonen av interesse, så vel som en manglende protokoller for dannelse av tredimensjonale kontraktile strukturer, har begrensede anvendelser av stamceller for neuromuskulære lidelser. Vi har laget en protokoll som overvinner disse grensene ved ektopisk innføring av definerte faktorer i hESCs – muskelen besluttsomhet faktor MyoD og SWI / SNF kromatin remodeling kompleks komponent BAF60C – som er i stand til å omprogrammere hESCs i skjelettmuskelceller. Her beskriver vi protokollen etablert for å generere hESC-avledet myoblasts og fremme deres clustering inn tridimensional miniatyriserte strukturer (myospheres) som funksjonelt ligne miniatyriserte skjelettmuskulaturen 7 </sup>.
På grunn av sin unike evne til å selv fornye og samtidig beholde pluripotency, er humane embryonale stamceller (hESCs) ansett som en uvurderlig ressurs i regenerativ medisin. Stamcelle mediert repopulation av syke muskler og hESC-eller indusert pluripotent stamceller (iPSC)-avledet generasjon av skjelettmuskulaturen for in vitro sykdom modellering er sentrale mål for studier med sikte på å identifisere behandlinger og belyse patogenesen av mange nevromuskulære sykdommer. Imidlertid har disse studiene blitt utfordret av motstanden av hESCs å konvertere til skjelettmuskelceller og av det sparsommelige opplysninger om den molekylære reguleringen av hESC-satsing mot skjelett myogenese. Faktisk, tidligere forsøk på å generere skjelettmuskelstamfedre fra hESCs viste at bare embryoid kroppen (EB)-avledet progenies eller mesenchymalceller er kompetente til å aktivere skjelett myogenese følgende ektopisk uttrykk for transkripsjonsaktivatorer (f.eksPax3 eller Myf5) 1-3 eller ved eksponering for spesifikke kultur vilkår 4-5.
Vi har tidligere vist at SWI / SNF komponent, BAF60C (kodet av SMARCD3), er en avgjørende del av transkripsjons maskiner som gjør at MyoD-mediert aktivering av muskelspesifikke loci seks. Vi har nylig oppdaget at selektiv fravær av BAF60C confers på hESCs motstanden mot MyoD-mediert aktivering av skjelett myogenese 7 som ellers er observert i BAF60C uttrykker somatiske celler 8-10, en prosess som vanligvis kalles myogenic konvertering. Tvunget uttrykk for BAF60C gjør MyoD å direkte aktivere skjelett myogenese i hESCs, på spesifikke kultur vilkår, med BAF60C og MyoD innføre en epigenetisk signatur som begår hESCs mot myogenisk avstamning 7. Av notatet, forrige proteomikk analyser avslørte selektiv fravær av BAF60C, blant SWI / SNF komponenter, i ESCs 11. Vi brukte denne kunnskapen til å pålegge en epigenetisk engasjement hESCs på myogenisk avstamning, som fører til generering av en homogen populasjon av skjelett myoblasts som kunne samles for å danne tredimensjonale kontraktile strukturer (myospheres) som funksjonelt ligner miniatyriserte skjelettmuskulaturen 7. Faktisk, vår metode for å generere skjelettmuskelstamfedre fra hESCs avhengig av epigenetisk engasjement hESCs til myogenisk avstamning, som er fenotypisk latent inntil cellene blir utsatt for differensiering signaler, for eksempel celle aggregering og kultur i differensiering medium (se spesifikk protokoll). Denne strategien tillater utvidelse av en homogen populasjon av hESCs som epigenetically forpliktet til skjelettmuskulatur avstamning og egnet til dannelse av tredimensjonale kontraktile myospheres som rekapitulere histologiske og funksjonelle egenskaper av skjelettmuskler. De myospheres gi den første bevis for miniatyriserte muskler utnyttbare for en "sykdom i en skål" modell av muskelsykdommer. Når generert fra pasient avledet iPSCs, disse myospheres har potensial til å belyse langvarige utviklingsspørsmål og patogenesen av sjeldne sykdommer, i tillegg til å tilby et stort potensial som et verktøy for high throughput screening av terapeutiske forbindelser. Vi ser også at en umiddelbar avlesning av myosphere analyse kunne bli gitt av immunhistokjemi på seksjoner, som beskrevet i en Jove protokollen ved Gomes et al. 12
Protokollen foreslått her beskriver hvordan å generere tredimensjonale klynger av kontraktile myofibers (myospheres) direkte fra hESCs. Den foreslåtte strategi har de enestående og usedvanlig potensial til å produsere mini muskler i suspensjonen som kan være egnet som en "sykdom i en tallerken"-modellen for både screening-analyser og utviklingsstudier. Dessuten er metoden for å generere myospheres fra hESCs enkel og krever ingen FACS-sortering trinn i løpet av differensiering, som typisk har en negativ innvirkning på utbyttet av celler gjenvunnet. Dessuten ville en sorteringsprosedyren under differensiering forstyrre aggregering siden det innebærer en dissosiasjon av EB til enkeltceller.
Den foreslåtte metoden er basert på epigenetisk reprograming av hESCs med spesifikke faktorer, MyoD og BaAF60C, som ikke er uttrykt i pluripotent embryonale stamceller. MyoD og BAF60C gi "kjernen" protein kompleks thved merkene det genomiske loci for transkripsjon fortsetter å aktivere skjelett myogenic program. De to faktorene blir levert til cellene ved hjelp av lentiviral infeksjoner, og det er derfor kritisk for å oppnå en høy effektivitet for infeksjon av begge faktorer i alle celler. Dette kan oppnås ved hjelp av høye titer virus eller virus utrustet med seleksjonsmarkører. Dyrkningsbetingelser spiller også en viktig rolle i å optimalisere graden av myogenic differensiering. Vi foreslår en serum-baserte differensiering protokoll for differensiering av MyoD/BAF60C uttrykke hESCs i klynger av myogeniske forløpere, etterfulgt av inkubasjon i serum-free definert medium (som inneholder insulin transferrin – ITS) for å oppnå konvertering av myogeniske forløpere til skjelett myotubes. Det er imidlertid mulig at andre definerte medier kan oppnå en likeverdig eller bedre myogenisk differensiering. En strømbegrensning av protokollen er at den er avhengig av bruk av fetalt bovint serum, som, foruten å inneholdeing mange animalske proteiner og stoffer, viser mye-til-mange variasjoner. Dette kan føre til lavere effektivitet eller heterogenitet av myogenic konvertering innen myospheres. Av notatet, ikke alle EB-lignende strukturer som stammer fra BAF60/MyoD-expressing hESCs er myospheres; nemlig noen er EB-lignende tilslag fullt sammensatt av myofibers. Antallet myospheres normalt avledet fra hESCs uttrykker BAF60C og MyoD kan variere fra 30 til 60% som anslått av farging på EB seksjoner utført på slutten av protokollen (se resultater). En potensiell tilnærming til å berike en kultur parabolen for bare myospheres ville være å bruke en myogenic reporter. Dette vil legge til rette for å forkaste de delvis eller ikke differensiert EB-lignende klynger og velge bare myospheres.
Til slutt vil en bedre forståelse av mekanismene bak tidsmessige krav til faktorer innført være nyttig å forbedre metoden for levering. For eksempel er hvis BAF60C og MyoD kreves bare for short tid til å "kick" cellene i riktig retning, kan metoder som er basert på modifisert mRNA levering anvendes. Derimot, hvis forhold er nødvendig for en lengre tid før cellene utnytte deres endogene proteiner, en episomal tilnærming ville være anbefalt å eliminere variabilitet og ukontrollerte virkninger på grunn av integrasjon inn i genomet. Til slutt konstaterer vi at det er obligatorisk å uttrykke BAF60C før eller samtidig som MyoD (aldri etter) for å oppnå hESC konvertering til musklene. Kravet om forutgående uttrykk for BAF60C antagelig avhengig av sin rolle i pre-sette epigenetisk landskapet for riktig MyoD kromatin distribusjon gjennom genomet 6,15. Som sådan, kan fremtidige protokoller forbedres ved å anvende forbindelsene eller andre manipulasjoner som fremmer BAF60C ekspresjon i hESCs.
The authors have nothing to disclose.
PLP er førsteamanuensis Investigator av Sanford Barnas Health Research Center. Dette arbeidet har vært støttet av følgende tilskudd til PLP: R01AR056712, R01AR052779 og P30 AR061303 fra National Institute of Health / National Institute of leddgikt og muskel-og hudsykdommer (NIAMS), MDA og Sanford Barn Health Research Award. Dette arbeidet har blant annet dratt nytte av forskningsmidler fra Det europeiske fellesskaps sjuende rammeprogram i prosjektet FP7-Helse – 2009 ENDOSTEM 241440 (Aktivering av blodkar forbundet stamceller og muskel stamceller for reparasjon og vedlikehold av muskelvev) SA ble støttet av. CIRM fellesskap.
6 well plate | Corning | 3506 | |
6 well low attachment plate | Corning | 3471 | |
GFR Matrigel | BD Biosciencies | 356231 | |
MEFs (growth arrested)14 | |||
Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | |
DMEM-F12 | Invitrogen | 15-090-CV | |
KOSR | Invitrogen | 10828-028 | |
1mM L-glutamine (100X) | Invitrogen | 35050-61 | |
Pen/Strep (100X) | Invitrogen | 15070-063 | |
2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-050 | |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | |
N2-supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
TrypLE express | Invitrogen | 12605-010 | |
FBS | HyClone | SH30396.03 | |
HS | Invitrogen | 16050114 | |
hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-100 | |
bfgf | Sigma | 4114-TC | |
mTeSR1 | Stemcell Technologies | 5850 | |
Anti-MyoD | BD Biosciences | 554130 | |
Anti-MyHC | DSHB | MF20 | |
Anti-myogenin | DSHB | F5D |