Här beskriver vi ett protokoll som bygger på epigenetisk omprogrammering av mänskliga embryonala stamceller (hESCs) mot att generera en homogen population av skelettmuskelgångare som enligt tillåtodlingsbetingelser bildar tredimensionella kluster av kontraktila myofibers (myospheres), som rekapitulera biologiska funktioner i människo skelettmuskulaturen.
Generation av en homogen och riklig population av skelettmuskelceller från mänskliga embryonala stamceller (hESCs) är ett krav för cellbaserade terapier och för en "sjukdom i en skål" modell för mänskliga neuromuskulära sjukdomar. Stora hinder, såsom låg överflöd och heterogena populationen av intresse, samt en brist på protokoll för bildandet av tredimensionella kontraktila strukturer, har begränsat de tillämpningar av stamceller för neuromuskulära sjukdomar. Vi har utformat ett protokoll som övervinner dessa begränsningar genom ektopisk införa definierade faktorer i hESCs – muskeln bestämningsfaktorn MyoD och SWI / SNF kromatin remodeling komplex komponent BAF60C – som har möjlighet att programmera hESCs i skelettmuskelceller. Här beskriver vi det protokoll som upprättades för att generera hESC-derived myoblasts och främja deras klustring i tredimensionella miniatyriserade strukturer (myospheres) som funktionellt härma miniatyriserade muskler 7 </sup>.
På grund av sin unika förmåga att själv förnya bibehållen pluripotens är mänskliga embryonala stamceller (hESCs) anses vara en ovärderlig resurs i regenerativ medicin. Stamcells medierad återplantering av sjuka muskler och hESC-eller inducerade pluripotenta stamceller (IPSC)-härledda generation muskler för in vitro-modellering sjukdom är viktiga mål för studier som syftar till att identifiera behandlingar och belysa patogenesen av många neuromuskulära sjukdomar. Emellertid har dessa studier ifrågasatts av motståndet av hESCs att konvertera in i skelettmuskelceller och av bristen på information om den molekylära regleringen av hESC-engagemang för skelett myogenes. I själva verket, tidigare försök att generera muskelgångare från hESCs avslöjade att endast embryoid kropp (EB)-härledda avkommor eller mesenkymala celler är kompetent att aktivera skelett myogenes efter ektopisk uttryck för transkriptionsaktivatorer (t.ex.PAX3 eller Myf5) 1-3 eller genom exponering för specifika odlingsbetingelser 4-5.
Vi har tidigare visat att SWI / SNF-komponent, BAF60C (kodas av SMARCD3), är en viktig del av den transkription maskiner som gör MyoD-medierad aktivering av muskel-specifika loci 6. Vi har nyligen upptäckt att den selektiva avsaknaden av BAF60C ger på hESCs motståndet mot MyoD-medierad aktivering av skelett myogenes 7 som annars observeras i BAF60C uttrycker somatiska celler 8-10, en process som vanligtvis benämns myogena konvertering. Tvångs uttryck för BAF60C möjliggör MyoD att direkt aktivera skelett myogenes i hESCs, på särskilda odlingsbetingelser, med BAF60C och MyoD om en epigenetisk signatur som begår hESCs mot myogenic härstamning 7. Notera avslöjade tidigare proteomik analys selektiv saknas BAF60C, bland SWI / SNF-komponenter, i ekonomiska och sociala råd 11. Vi använde denna kunskap för att införa en epigenetisk engagemang hESCs på myogenic härstamning, vilket leder till uppkomsten av en homogen population av skelett myoblasts som kan aggregeras för att bilda tredimensionella sammandragande strukturer (myospheres) som funktionellt härma miniatyriserade muskler 7. Faktum är vår metod för att generera muskelgångare från hESCs förlitar sig på den epigenetiska engagemang hESCs till myogenic härstamning, som är fenotypiskt latent tills cellerna utsätts för differentieringssignaler, till exempel cell aggregering och kultur i differentieringsmedium (se specifikt protokoll). Denna strategi möjliggör utbyggnaden av en homogen population av hESCs som epigenetiskt är engagerade i skelettmuskulaturen härstamning och lämplig för bildande av tredimensionella kontraktila myospheres som rekapitulera histologiska och funktionella egenskaper hos skelettmuskler. De myospheres ger det första beviset på miniatyriserade muskler exploaterbara för en "sjukdom i en skål" modell av muskelsjukdomar. Då genereras från patientens härrör iPSCs, dessa myospheres har potential att belysa långvariga utvecklings frågor och patogenesen av sällsynta sjukdomar, förutom att erbjuda den enorma potential som ett verktyg för hög throughput screening av terapeutiska föreningar. Vi noterar också att en omedelbar avläsning av myosphere analys skulle kunna tillhandahållas av immunohistokemi på sektioner, som beskrivs i en JUPITER protokoll från Gomes et al. 12
Protokollet föreslås här beskriver hur man skapar tredimensionella kluster av kontraktila myofibers (myospheres) direkt från hESCs. Den strategi som föreslås har motstycke och extraordinära potential att producera mini muskler i suspension som kan vara lämpligt som en "sjukdom i en skål" modell för både screeninganalyser och utvecklingsstudier. Dessutom är metoden att generera myospheres från hESCs enkel och kräver inte någon FACS-sortering steg under differentiering, som normalt har en negativ inverkan på avkastningen av celler som återvunnits. Dessutom skulle en sorteringsförfarande under differentiering störa aggregering eftersom det innebär en dissociation av EB i enskilda celler.
Den föreslagna metoden bygger på den epigenetiska reprograming av hESCs med specifika faktorer, MyoD och BaAF60C som inte uttrycks i pluripotenta embryonala stamceller. MyoD och BAF60C tillhandahålla den "kärna" proteinkomplex thvid markerar iska loci från vilken transkription fortsätter att aktivera skelett myogena programmet. De två faktorer som levereras till cellerna med hjälp av lentivirala infektioner och det är därför viktigt att uppnå en hög effektivitet för infektion av båda faktorerna i alla celler. Detta kan uppnås genom att använda hög titer virus eller virus utrustade med selektionsmarkörer. Odlingsbetingelser spelar också en viktig roll för att optimera omfattningen av myogena differentiering. Vi föreslår ett serumbaserat differentiering protokoll för differentiering av MyoD/BAF60C uttrycka hESCs i kluster av myogena prekursorer följt av inkubation i serumfritt definierat medium (innehållande insulin transferrin – ITS) för att uppnå omvandling av myogenic prekursorer in i skelett myotuber. Det är emellertid möjligt att andra definierade medier kan uppnå en lika stor eller bättre myogenic differentiering. En strömbegränsning av protokollet är att det bygger på användning av fetalt bovint serum, som, förutom att innehållaning många animaliska proteiner och ämnen, visar mycket-till-många variationer. Detta kan leda till lägre effektivitet eller heterogenitet myogena omställning inom myospheres. Att notera, inte alla EB-liknande strukturer som härrör från BAF60/MyoD-expressing hESCs är myospheres; nämligen vissa är EB-liknande aggregat helt består av myofibers. Antalet myospheres normalt härrör från hESCs uttrycker BAF60C och MyoD kan variera från 30 till 60% som uppskattas genom immunfärgning på EB avsnitt utförs i slutet av protokollet (se resultat). En potentiell metod för att berika en odlingsskål för endast myospheres skulle vara att använda en myogena reporter. Detta skulle underlätta kasta bort de delvis eller inte differentierade EB-liknande kluster och välja bara de myospheres.
Slutligen skulle en bättre förståelse för mekanismerna bakom de tidsmässiga kraven i de faktorer som införs vara användbart för att förbättra leveranssätt. Till exempel, om BAF60C och MyoD krävs endast för shOrt tid att "sparka" cellerna i rätt riktning, kan metoder baserade på modifierade mRNA leverans tillämpas. Däremot, om de faktorer som krävs för en längre tid innan cellerna utnyttja deras endogena proteiner, en episomal strategi kan rekommenderas för att eliminera variationer och okontrollerade effekter på grund av integrationen i genomet. Slutligen kan vi konstatera att det är obligatoriskt att uttrycka BAF60C före eller samtidigt som MyoD (aldrig efter) för att uppnå hESC omvandling till skelettmuskulaturen. Kravet på förhands uttryck av BAF60C bygger förmodligen på sin roll i förväg sätta den epigenetiska landskapet för korrekt MyoD kromatin distribution genom genomet 6,15. Som sådan, kan framtida protokoll förbättras genom föreningar eller andra manipulationer som främjar BAF60C uttryck i hESCs.
The authors have nothing to disclose.
PLP är en Associate Utredare av Sanford barns hälsa Research Center. Detta arbete har stötts av följande bidrag till PLP: R01AR056712, R01AR052779 och P30 AR061303 från National Institute of Health / National Institute of Arthritis och muskuloskeletala och hudsjukdomar (NIAMS), MDA och Sanford Children Health Research Award. Detta arbete har delvis gynnats av forskningsfinansiering från Europeiska gemenskapens sjunde ramprogram i projektet FP7-Hälsa – 2009 ENDOSTEM 241.440 (Aktivering av kärl tillhörande stamceller och muskelstamceller för reparation och underhåll av muskelvävnad) SA stöddes av. CIRM gemenskap.
6 well plate | Corning | 3506 | |
6 well low attachment plate | Corning | 3471 | |
GFR Matrigel | BD Biosciencies | 356231 | |
MEFs (growth arrested)14 | |||
Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | |
DMEM-F12 | Invitrogen | 15-090-CV | |
KOSR | Invitrogen | 10828-028 | |
1mM L-glutamine (100X) | Invitrogen | 35050-61 | |
Pen/Strep (100X) | Invitrogen | 15070-063 | |
2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-050 | |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | |
N2-supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
TrypLE express | Invitrogen | 12605-010 | |
FBS | HyClone | SH30396.03 | |
HS | Invitrogen | 16050114 | |
hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-100 | |
bfgf | Sigma | 4114-TC | |
mTeSR1 | Stemcell Technologies | 5850 | |
Anti-MyoD | BD Biosciences | 554130 | |
Anti-MyHC | DSHB | MF20 | |
Anti-myogenin | DSHB | F5D |