نقدم مجموعة من المجهر البرد الإلكترون، والدهون تكنولوجيا النانو، وتحليل بنية تطبيقها لحل هيكل غشاء محدد من شكلين FVIII مثلي للغاية: الإنسان والخنازير. يوصف المنهجية التي وضعت في المختبر لدينا لتنظيم حلزوني وهما وظيفية أشكال FVIII المؤتلف على الأنابيب النانوية الدهون سالبة الشحنة (LNT).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
منظمة حلزونية من الدم التخثر عامل الثامن على الدهون الأنابيب النانومترية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
البرد المجهر الإلكتروني (البرد EM) 1 هو نهج قوية للتحقيق في الهيكل الوظيفي للبروتينات والمجمعات في حالة وغشاء البيئة المائية 2.
تخثر العامل الثامن (FVIII) 3 هو متعدد المجال بروتين سكري بلازما الدم. عيب أو نقص FVIII هو سبب لنوع الهيموفيليا A - اضطراب نزيف حاد. عند تنشيط بروتين، FVIII بربط البروتيني سيرين عامل IXA على غشاء الصفيحات المشحونة سلبا، وهو أمر حاسم لتخثر الدم الطبيعي 4. على الرغم من الدور المحوري يلعب FVIII في تجلط الدم، المعلومات الهيكلية للدولة ملزمة لها غشاء غير مكتملة 5. التركيز FVIII المؤتلف هو الدواء الأكثر فعالية ضد نوع الهيموفيليا A ويمكن التعبير المتاحة تجاريا على حد سواء FVIII تشكيل المجمعات وظيفية مع الإنسان عامل IXA 6،7 الإنسان أو الخنزير. "> في هذه الدراسة نقدم مجموعة من المجهر البرد الإلكترون (البرد EM)، تطبيق تكنولوجيا النانو الدهون وهيكل تحليل لحل هيكل غشاء محدد من شكلين FVIII مثلي للغاية: الإنسان والخنازير والمنهجية التي وضعت في المختبر لدينا لتنظيم حلزوني وهما وظيفية أشكال FVIII المؤتلف على الأنابيب النانوية الدهون سالبة الشحنة (LNT) يوصف. توضح النتائج أن ممثل نهجنا هو حساسة بما فيه الكفاية لتحديد الاختلافات في تنظيم حلزونية بين اثنين غاية مثلي في تسلسل (تسلسل 86٪ الهوية وترد) البروتينات. بروتوكولات تفصيلية لتنظيم حلزونية، البرد EM والإلكترون التصوير المقطعي (ET) الحصول على البيانات. وثنائي الأبعاد (2D) وتطبيق ثلاثي الأبعاد (3D) تحليل هيكل للحصول على اعادة البناء 3D من الإنسان والخنزير ويناقش FVIII-LNT. تظهر الهياكل FVIII-LNT الإنسان والخنازير قدم المحتملة للمنهجية المقترحة لcalculatه لمنظمة غشاء محدد وظيفية من عامل تخثر الدم الثامن في ارتفاع القرار.
المقدمة
عامل تخثر الدم الثامن (FVIII) هو بروتين سكري كبيرة من الأحماض الأمينية 2،332 نظمت في ستة مجالات: A1-A2-B-A3-C1-C2 3. على الثرومبين تفعيل FVIII بدور العامل المساعد للعامل IXA داخل مجمع Tenase غشاء محدد. ملزمة من FVIII المنشط (FVIIIa) لFIXA بطريقة اعتمادا غشاء يعزز كفاءة FIXA بروتين أكثر من 10 5 مرات، وهو أمر حاسم لكفاءة تخثر الدم 4. على الرغم من الدور المهم الذي يلعبه في FVIII تخثر وتشكيل Tenase المعقدة، وغشاء محدد وظيفية هيكل FVIII هو لم تحل بعد.
لمعالجة ذلك، واحد الأنابيب النانوية الدهون طبقة ثنائية (LNT) الغنية في فسفاتيديل (....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد نموذج
- تبادل عازلة الإنسان FVIII-14 وبدد الخنزيري FVIII-15 BDD ضد العازلة HBS-كا (20 ملي HEPES، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5 مم CaCl 2، ودرجة الحموضة = 7.4) والتركيز إلى 1.2 ملغ / مل. الحفاظ على حل البروتين في -80 درجة مئوية.
- تحضير الأنابيب النانوية الدهون (LNT) عن طريق خلط GalactosylCeramide (GC) وفسفاتيديل (PS) في 01:04 ث / ث نسبة في الكلوروفورم. تتبخر الكلوروفورم تحت الأرجون وذوبان في الدهون العازلة HBS إلى 1 ملغ / مل. الحفاظ على حل LNT في 4 در....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
نظمت FVIII الخنازير والإنسان المؤتلف بنجاح حلزوني على المتهمين LNT طبقة ثنائية واحدة سلبا، تشبه سطح الصفائح الدموية تفعيلها. وكان تنظيم حلزونية من الإنسان والخنزير FVIII-LNT متسقة من خلال الميكروسكوب الرقمي جمعها (الشكل 2). تم اختيار LNT التحكم والإنسان وFVIII-LNT أنابيب حلزونية الخنازير ومجزأة مع واجهة المستخدم الرسومية e2helixboxer.py ومجموعات البيانات الأولية التي تم إنشاؤها باستخدام واجهة المستخدم الرسومية e2workflow.py، الخيار الجسيمات واحدة .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا العمل ويقدم منهجية للتمييز بين اثنين غشاء محدد المنظمات البروتينات مثلي للغاية: FVIII الإنسان والخنازير على الأنابيب النانوية الدهون في الظروف التي واجهتها في الجسم البشري الذاتي تجميعها.
في الإجراء وصفها، وتنظم الإنسان وFVIII الخنازير بنجاح حلزوني على الأنابيب النانوية الدهون، والتي هي الخطوة الأكثر أهمية. الخطوة الحاسمة المقبلة هو الحفاظ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن الكتاب أن لديهم أي مصلحة مالية المتنافسة والتي يمكن الاتصال مباشرة فيما يتعلق بأي من الإجراءات التي نشرت في هذا المخطوط.
شكر وتقدير
ويدعم هذا العمل من خلال منحة تنمية ساينتست الوطني من جمعية القلب الأمريكية: 10SDG3500034 وUTMB-الأهلي بدء الأموال إلى SSM. يعترف الكتاب المرافق البرد EM والحوسبة العلمية في مركز سيلي لعلم الأحياء الهيكلي في UTMB ( www.scsb.utmb.edu )، وكذلك الدكاترة. ستيف ووتك إد Egelman للمساعدة في الخوارزميات إعادة الإعمار حلزونية 2D و 3D.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| JEM2100 مع LaB6 | JEOL Ltd. | يعمل JEM-2100 | عند 200 كيلو فولت |
| مع برنامج TEMCON | JEOL Ltd. | ||
| Gatan626 حامل التبريد | Gatan، Inc. | 626.DH | تم تبريده إلى -175 درجة ؛ C |
| مع وحدة التحكم في درجة الحرارة | Gatan، Inc. | ||
| جاتان 4K × 4K CCD | Gatan، Inc. | US4000 | 4,096 x 4,096 بكسل عند 15 & mu; م / بكسل الدقة المادية |
| Solarus نموذج 950 منظف البلازما | Gatan، Inc. | ||
| Vitrobot Mark IV | FEI | ||
| مطلي بالكربون 300 شبكة نحاسية 3 مم | Ted Pella | 01821 | تم تنظيف البلازما لمدة 10 ثوان على طاقة عالية |
| Quantifoil R2 / 2 300 شبكة | علوم المجهر الإلكتروني | Q225-CR2 | شبكات النحاس المطلية بالكربون 300 شبكة مع ثقوب أقطار 2 مم ؛ |
| أسيتات يورانيل ثنائي هيدرات | تيد بيلا | 19481 | محلول 1٪ ، مصفى |
| Galactosyl ceramide | Avanti Polar Lipids Inc. | 860546 | |
| Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids Inc. | 840035 | |
| برنامج EM Digital Micrograph | Gatan، Inc. | http://www.gatan.com/DM/ | |
| EM تحميل برنامج EMAN | مجانا | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/ < / a> | |
| EM برنامج Spider | تحميل | http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html< / a> | |
| EM برنامج تحميل | مجاني | البرامج المتاحة من إدوارد إتش إيجلمان http://people.virginia.edu/~ehe2n/ | |
| برنامج EM (IMOD) | تحميل | مجاني | http://bio3d.colorado.edu/imod/ ؛ برنامج < / a> |
| EM (SerialEM)تحميل | ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/< / a> | ||
| UCSF-Chimera | تحميل | < href = "http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html" >http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html< / أ> |
المراجع
- Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 37, 3-13 (2004).
- Fujiyoshi, Y., Unwin, N. Electron crystallography of proteins in membranes. Current opinion in structural biology. 18, 587-592....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
