Summary
İnsan ve domuz: İki yüksek ölçüde homolog FVIII formlarının zara-bağlı yapısını çözmek için uygulanan Cryo-elektron mikroskobu, lipid nanoteknoloji, ve yapı analizleri bir arada mevcut. Helezonik negatif yüklü lipid nanotüpler (LNT) üzerine iki fonksiyonel rekombinant FVIII formları düzenlemek için laboratuvarda geliştirilen metodoloji açıklanmıştır.
Abstract
Kriyo-elektron mikroskobu (Cryo-EM) 1 bir hidratlı eyalet ve zar ortamı 2 protein ve komplekslerinin fonksiyonel yapısını araştırmak için güçlü bir yaklaşımdır.
Pıhtılaşma Faktör VIII (FVIII) 3 bir çok etki alanı, kan plazma glikoproteinidir. Ciddi bir kanama hastalığıdır - kusur veya FVIII eksikliği Hemofili A tipi için nedenidir. Proteolitik aktivasyonu üzerine, Faktör VIII, normal kan pıhtılaşması 4 için kritik olan, negatif yüklü trombosit membran ilgili serin proteaz Faktör IXa bağlanır. FVIII koagülasyon oynadığı önemli rolüne rağmen, zar bağlı devlet için yapısal bilgiler eksik 5'tir. Yeniden birleştirici FVIII konsantre Hemofili A tipi karşı en etkili bir ilaçtır ve ticari olarak temin edilebilen FVIII insan ya da domuz, insan Faktör IXa 6,7 ile her oluşturan işlevsel kompleksleri olarak ifade edilebilir.
"> Bu çalışmada, Cryo-elektron mikroskopisi (Cryo-EM) oluşan bir kombinasyon mevcut, lipid nanoteknoloji ve yapı analizleri, iki yüksek ölçüde homolog FVIII formlarının zara-bağlı yapısını çözmek başvuran. İnsan ve domuz laboratuarımızda gelişmiş metodoloji Sarmal olarak negatif yüklü lipid nanotüpler (LNT) üzerindeki iki fonksiyonel yeniden birleştirici FVIII formları düzenlemek için tarif edilmektedir. temsil eden sonuçlar yaklaşım sırası de yüksek ölçüde homolog iki (% 86 sekans özdeşliği arasındaki sarmal kuruluşta farklılıkları tanımlamak için yeteri kadar hassas olduğunu göstermektedir ) proteinleri. helezoni örgüt, Cryo-EM ve elektron tomografi (ET) veri toplama için ayrıntılı protokolleri., iki boyutlu (2B verilir) ve üç boyutlu (3D) yapı analizleri, insan ve domuz 3D rekonstrüksiyonlar elde etmek için uygulanır FVIII-LNT tartışılmaktadır. sunulan insan ve domuz FVIII-LNT yapılar önerilen yöntemin potansiyel calculat göstermekYüksek çözünürlükte kan pıhtılaşma faktörü VIII e fonksiyonel, zara bağlı organizasyonu.Introduction
Kan pıhtılaşması, Faktör VIII (FVIII) altı alanda düzenlenmiş 2332 amino asitlerin büyük bir glikoproteindir: A1-A2-B-A3-C1-C2-3. Trombin aktivasyon FVIII zara bağlı Tenase kompleksi içinde faktör IXa kofaktörünün olarak hareket üzerine. Bir zar-bağlı şekilde aktive FIXa FVIII (FVIIIa) bağlanması, FIXa proteolitik verimliliği etkili kan pıhtılaşmasının 4 için çok önemlidir 10'dan fazla 5 kez, geliştirir. FVIII koagülasyon ve Tenase kompleks oluşumunda oynadığı önemli rolüne rağmen, fonksiyonel membran-bağlı FVIII yapı çözülecek henüz.
Bu adres için, yüksek afiniteli 8, 9, FVIII bağlayıcı ve aktif trombosit yüzeyi benzeyen edebilen fosfatidilserin (PS) zengin bir lipid iki katmanlı nanotüpler (LNT), 10 geliştirilmiştir. LnT bağlı FVIII'ünün Ardıl sarmal örgütü effecti olduğu kanıtlanmıştırCryo-EM 5 ile FVIII membran bağlı devlet yapısının belirlenmesi için ettik. Fonksiyonel LNT Cryo-EM, 11, 12 yolu ile protein-protein ve helisel şekilde düzenlenmiş zara bağlı proteinler, protein-membran etkileşimi incelemek için ideal bir sistem bulunmaktadır. Numune fizyolojik bir ortamda (tampon, membran, pH) en yakın olarak korunur gibi Cryo-EM katkı maddeleri ve izotoplar olmadan, örneğin X-ışını kristalografisi ve NMR yapı gibi geleneksel yöntemlere göre bir avantaja sahiptir. LNT boyut, şekil ve bileşimin Tenase kompleksler in vivo monte aktif trombositlerin pseudopodia yakından benzer olarak FVIII durumunda, bu teknik ile zara-bağlı yapısını inceleyerek daha da daha fazla fizyolojik olarak önemlidir.
Kusur ve FVIII neden Hemofili A, insan nüfusu 4, 6 1 5,000 erkekleri etkileyen ciddi bir kanama bozukluğu eksikliği. Çoğu eHemofili A için etkili oldukları tedavi rekombinant insan FVIII'ünün (hFVIII) yaşam boyu uygulanmasıdır. Rekombinant FVIII Hemofili A tedavisinin önemli bir komplikasyon Hemofili A hastalarının 13 yaklaşık% 30 etkileyen insan formuna engelleyici antikorların gelişmedir. Bu durumda, domuz FVIII (pFVIII) konsantre FVIII insan ve insan FIXa 7 ile form fonksiyonel kompleksleri karşı inhibitör antikorlar ile domuz FVIII görüntüler, düşük çapraz reaktiflik olarak kullanılır. Domuz ve insan FVIII formları hem de zara bağlı örgüt kurma FVIII kofaktör fonksiyon ve kan hemostaz için etkileri yapısal temelini anlamak önemlidir.
Bu çalışmada, lipid nanoteknoloji, Cryo-EM, ve iki son derece homolog FVIII formlarının zara bağlı organizasyon çözmek için tasarlanmış bir yapı analizi bir arada tarif eder. Helezonik organize porci için sunulan Cryo-EM veri ve 3D yapılarınegatif yüklü Int üzerinde ne ve insan FVIII FVIII yapı tayini ve zara bağlı pıhtılaşma faktörleri ve fizyolojik bir ortamda zar kompleksleri için temel olarak kullanmak için önerilen nanoteknoloji potansiyelini göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Numune Hazırlama
- Tampon değişimi, insan Faktör VIII-BDD 14 ve HBS-Ca tampon maddesine karşı domuz FVIII-BDD 15 (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, pH = 7.4) ve 1.2 mg / ml 'ye konsantre edilir. -80 ° C de, protein çözeltisi Ol
- 01:04 w / kloroform w oranı en galactosylceramide (GC) ve fosfatidiliserin (PS) karıştırılması ile lipid nanotüpler (LNT) hazırlayın. , Argon altında, kloroform buharlaştırın ve 1 mg / ml 'ye HBS tampon maddesi içinde lipitleri çözünebilir. 4 ° C'de LNT çözüm tutun
FVIII-LnT 2. Cryo-elektron Mikroskopi
- Cryo-EM Numune Hazırlama
- 300 50 W da 10 saniye boyunca 2 ve O 2 H gaz karışımı içinde Quantifoil R2 / 2 bakır ızgaralar (C tarafı) ağ akıntı Glow
- 01:01 su / çimento oranı ağırlık olarak HBS-Ca tamponu içinde FVIII ve LNT çözüm karıştırınız ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
- 2.5 ul bir damlaVitrobot Mark IV nemlendirilmiş bir odada (% 100 nem) 'de hidrofil elektron mikroskobu, şebekeye FVIII-LNT numunenin.
- Leke ve flaş sıvı C 2 H 6 ızgara (3,5 saniye için bir leke, leke kuvvet 1) donma, amorf buz elde etmek için sıvı N 2 ile soğutulur.
- Sıvı N 2 (LN2) altında saklama kutuları saklayın ızgaraları.
- Cryo-EM Veri Toplama
NOT: JEM2100-LaB6 (yıl 2010) elektron mikroskobu, vakum sistemi, aydınlatma sistemi, HT, lens akımları ve böylece-okuma pencereleri ile bir ekrana, ve iki bağlı bir bilgisayardan oluşan bir TEMCON işletim sistemi ile donatılmıştır paneller: SOL ve SAĞ, sütunun her iki tarafına yerleştirilir. Kiriş vardiya X, Y düğmeleri (SHIFT Y, ELEMEK Y) ve çok fonksiyonlu (DEF / Stig) topuzlar hem paneller vardır. SOL panelinde aydınlatma (Lümen Parlaklık) topuzu. SAĞ panelde bulunmaktadır: büyütme (MAG / CAM BOYU) ve odaklama (FOCUS) topuzlar ve üç IMAGing (MAG1, MAG2, LOWMAG) ve kırılma (FARK) modları düğmeleri. Biz alfa 2 de MAG1 bizim veri elde. Cryo-EM veri toplama için gerekli minimum doz aydınlatma koşulları (MDS) SAĞ panelde F6 düğmeleri, üst satır ile F1 ile ayarlanır. Bu protokolde genel ayarları kullanılır: F1 - yükseltmek / düşük ekran, F2 - ARAMA modu, F3 - FOCUS modu, F4 - FOTO modu, F5 - MDS ON / OFF ve F6 - LEVENT BOŞ, radyasyon örneği korumak için kullanılan ışın saptırma tarafından zarar.- Cryo-istasyonuna Cryo-tutucu yerleştirin ve tutucu ve LN2 ile kriyo-istasyonunun Dewar doldurun. Sıcaklık -192 ° C, tutucu ucu açık deklanşöre ulaştığında, yeri önceden belirlenmiş yerine Cryo-EM ızgara dondurulmuş ve bir halka kelepçe ile sabitleyin.
- Elektron mikroskobu içine cryo-tutucu yerleştirin. Cryo-tutucu ve LN2 ile, anti-contaminator odasının Dewar doldurun. Tutucu, 30-60 dakika boyunca stabilize etmek için bekleyin. Basın üzerinde F6 vefilamanı açın. ızgara görüntülemek için tutucuya filaman doymuş, F6 tuşuna basın kapalı ve açık deklanşör.
- Basın Low Mag / alfa 1 (200X kadir ayarlanır) ve ızgara üzerinde ince buz alanları bulun.
- Minimum doz (MDS) modu ayarlayabilir ve numune zarar vermeden, düşük elektron dozlarda Cryo-EM veri elde etmek MAG 1/alpha 2'ye geçmek.
- F2 tuşuna basın arama modunu ayarlamak için. 40.000 x at büyütme ayarlayın. / Å 2 · s - minimal elektron doz brigtness topuzu ~ 0.04 e kirişi büyütün. Basın FARK kırılma moduna geçmek için. MAG / CAM BOYU topuzu ile 120 cm'ye kadar kamera uzunluğunu ayarlayın. Karbon film delikleri lipid nanotüpler var LOWMAG olarak önceden seçilmiş alanlarda ızgara üzerinde alanları bulun.
- F4 tuşuna basın 40,000 X büyütmede Fotoğraf modunu ayarlayın ve 16-25 e dozlarda PARLAKLIK topuzu ile aydınlatma ayarlamak için - / Å 2 · s. Z-yüksekliğini ayarlayarak odak koşullarını ayarlamak için basın Standart Odak butonunaZ YUKARI / AŞAĞI düğmeleri (SAĞ kontrol paneli) ile numune. -1.5 Ile -2.5 um arasında ayarlayın odaksızlık.
- FOTO modunda yansıması için alana gelen ARAMA modunda dijital kamera monitörde LIVE VIEW penceresinde bir kare çizerek ARAMA ve FOTO modu hizalayın.
- F3 tuşuna basın 100.000 X büyütmede Odak modunu ayarlamak için. FOTO modunda yansıması için bölgeyi ışın değil - (5 cm yarıçap ~ 4) ve eksen dışı CCD çipi kapsayacak şekilde aydınlatma odaklanın. FOCUS düğmesi ve DEF / STIG düğme ile görüntü astigmatizma için doğru olan ~ -1.5 ve -2.5 um bulanıklaştırma ayarlayın.
- Dijital kamera monitörde LIVE VIEW penceresinde canlı görüntü elde ARAMA modunda yansıması için FVIII-LNT seçin. LIVE VIEW penceresinde çizilen meydanında FVIII-LNT merkezle.
- Fotoğraf moduna geçiş ve Acquir tıklayarak 52.000 X etkin büyütme ve 0.5 sn pozlama CCD kamera, bir dijital görüntü kayıtDijital mikrograf kamera monitörde E düğmesine basın. Görüntü elde etme koşulları gibi görüntü FOTO modunda satın yalnızca açık ışın boş (KEPENK) olarak ayarlanır.
- Hızlı Fourier Dönüşümü (FFT) elde etmek için CTRL-F tuşlarına basarak elde edilen görüntünün kalitesini ve bulanıklaştırma edin.
3.. 3D İmar
NOT: 2D ve 3D analiz için kullanılan görüntü analiz yazılımı: EMAN2 ve IHRSR serbestçe kullanılabilir. EMAN2 http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install indirebilirsiniz. Egelman@virginia.edu: IHRSR Yazılım Profesör Egelman elde edilebilir. Nihai IHRSR iyileştirmeler Teksas üzerinde çalıştırılan merkezi cluster computing gelişmiş: http://www.tacc.utexas.edu/ Texas Üniversitesi, Austin. Şekil 1'de gösterilen 3 boyutlu rekonstrüksiyon algoritması iki ana adımdan oluşur: Birinci 2D referans ücretsiz alignme ile sarmal kesimleri (partiküller) homojen bir dizi seçerkennt (RFA) algoritmaları ikinci IHRSR dahil sarmal parametreleri ve arka projeksiyon algoritmalara dayalı bir 3D yeniden elde, Eman 2. uygulanmaktadır. Http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2: İlk adım Tek Parçacık SPA EMAN2 özel olarak geliştirilen ve dağıtılan edildiği için (algoritmalar) ile 3 boyutlu rekonstrüksiyon için homojen partikül kümelerinin seçilmesi için geliştirilen programlar kullanır. Bu adım, Cryo-EM verilerine adapte edilmiştir. İkinci adım, özellikle yeniden birleştirme Faktörü VIII formları ile elde edilen sarmal düzeneklerinin tipi için tasarlanmıştır IHRSR algoritması ile elde edilir. Bu algoritma, bilimsel literatürde kapsamlı olarak 12 ile belgelenmiştir.
- Homojen parçacık sarmal yeniden inşası için (sarmal segment) takımları seçmek için http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html 16: EMAN2 bilimsel görüntü-işleme suite ile 2D görüntü analizi yapın.
- Straig ile Cryo-EM mikrograflannı seçinht ve dijital kamera yazılımı ve görselleştirme araçları ile helezonik tüpler iyi organize.
- Invert, normalleştirmek ve e2workflow.py GUI X-ray piksel, tek parçacık rekonstrüksiyonu (SPR) seçeneği için filtre: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager
- E2helixboxer.py GUI, ters normalize ve X-ışını piksel filtreli görüntüleri içe. Kullanılarak% 90 örtüşme ile 256 x 256 piksel (2.9 Å / pix) de FVIII-LNT sarmal tüpler ve segmentini seçin: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer
- Orijinal mikrografiklerinden bulanıklaştırma değerlendirmek ve e2workflow.py dahil e2ctf.py seçeneği ile aynı mikrografiklerinden sarmal kesimleri kontrast transfer fonksiyonunu (CTF) düzeltme (sadece faz düzeltme) geçerlidir: http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf.
- İlk parçacıklar (sarmal kesimleri) oluşturmak e2workflow.py GUI setleri - SPR seçeneği: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow.
- Iter = 8 - 'e2refine2d.py: e2refine2d.py algoritması komut aşağıdaki, aynı çap LnT ve sarmal düzenin derecesi (Şekil 2) ile homojen veri setleri seçmek için referans ücretsiz k-ortalama sınıflandırma uygulayarak 2D sınıf ortalamaları hesaplamak - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - yolu = r2d_001 - input = INPUT.hdf - ncls = 51 - simcmp = nokta - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp = nokta - classraligncmp = faz - classiter = 2 - classkeep = 0.8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = ortalama - normproj-classkeepsig ', buna göre ncls değerinin değiştirilmesi.
- Sınıf ortalamasının daha az% 80 benzerliği ile parçacıkların belirli bir sınıfın dışındadır, yani 'classkeep = 0,8' 8 yineleme üzerinde 150 sınıfların '= 151 NCIS' ayarlanan ilk verileri sınıflandırmak. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d
- Sınıf ortalamaları partikülleri birleştirmeara veri kümesi oluşturmak için e2display.py içinde belirgin sarmal sapması ile.
- Düzenin aynı çap ve derecesi ile sınıfları ayırt etmek için 50 sınıfların '= 51 NCIS'e' ayarlanan ara veri sınıflandırır.
- Http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector: üç boyutlu rekonstrüksiyon için nihai veri seti oluşturmak için e2display.py düzenin aynı çap ve derecesi ile sınıflardan parçacıkları birleştirme.
- Egelman 17, 18 anlatıldığı gibi, iteratif Helisel Gerçek Uzay Rekonstrüksiyon (IHRSR) algoritması ile sarmal yeniden gerçekleştirin.
- Yükselişi tahmin, birleştirilen Fourier FVIII-LNT sarmalın Δz (A), son veri setinde parçacıkların dönüşümü.
- 5 ila ΔΦ artan, sabit Δz ile paralel IHRSR refinements çalıştırarak azimuthal açısını ΔΦ (º) tanımlayın76; 5 ° artışlarla 60 °.
- Bir başlangıç hacminin bir özelliği olmayan silindir ve 3.2.1 'de tarif edildiği gibi başlangıç parametreleri sarmal Δz ve ΔΦ seti, her son veri 100 ardışık IHRSR döngüleri çalıştırın. ve 3.2.2.
- Sınıf nihai veri setinin 2D sınıflandırmadan ortalamalar ve nihai IHRSR yeniden gelen projeksiyonlar arasındaki sarmal parametreleri ve yazışma yakınsama için son hacimleri kontrol edin.
- Nihai asimetrik 3B hacminde görülen asimetrik birim dağılımına karşılık gelen nihai 3B rekonstrüksiyon simetri empoze: insan FVIII-Int 4-kat ve domuz FVIII-Int boyunca 5 kat. Son bir simetriklestirilir 3D yeniden oluşturmak için başka bir 100 arıtma döngüleri çalıştırın.
- 'E2proc2d.py <infile> <outfil: ilk, hatta tek ve belirlenen ilgili veri ayırarak hem hacimleri için Fourier Shell korelasyon eğrisini hesaplamake> - bölünmüş = 2 '. 3.2.3 'de tarif edildiği gibi O 100 IHRSR ardışık iyileştirmeler çalıştırın. Tek ve çift veri setlerinden oluşturulan 3D hacimlerinin FSC hesaplayın: 'e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc'.
- Ucsf kimerada FVIII-LNT hacimleri görselleştirmek ve Segment.
- Adım 3.2.5 den son hacimleri açın. UCSF Chimera ve ARAÇLAR> SES DATA> SES İZLEYİCİ seçeneğinde 0.005 kontur seviyesini ayarlayın.
- ARAÇLAR> SES DATA> BÖLÜMLERE MAP, MAP BÖLÜMLERE sekmesinde seçin hacmi ve segmentinde ses segment tıklayın.
- Grup kesimleri CTRL + SHIFT ve tıklayarak grup ile seçerek bir birim hücreye karşılık.
- Birim hücre tarafından segmentleri renk ve yapısal özelliklerini vurgulamak için EYLEMLER> RENK seçeneği ile helix.
4. Elektron Tomografi
- Olumsuz Vitray FVIII-LNT Numune Hazırlama
- <li> Cryo-EM deneyler gibi FVIII-LNT örnekleri hazırlayın.
- Kriyo-EM deneyleri için 50 ° W olarak, O, 2 ila 10 saniye boyunca 2 H gaz karışımı içinde, karbon kaplı 300 meşlik bakır ızgara (C tarafı üstte) tahliye Glow.
- Şebekeye 6-nm koloidal altın nano partiküller ile 2.5 ul FVIII-LNT süspansiyonu bir damla, fazla sıvıyı leke ve negatif 2 dakika boyunca 5 ul% 1 uranil asetat çözeltisi uygulayarak leke. Izgara kuru aşırı sıvı ve havayı kurulayın.
- Tek eğim tutucu içine ızgara aktarın.
- Elektron mikroskobunda tutucu aktarın.
- 52.000 X etkili büyütmede bir CCD kamera ile +60 ° ve kayıt görüntüleri -60 ° 'lik bir açı aralığında 2 ° artışlarla SerialEM yazılımı 19 otomatik eğim serisi toplamak, -6 -10 mikron flulaştırmayla ve 150 elektron doz - 170 electrons / Å 2 · s tomografisinde başına.
Not: 4.2 edinilen pFVIII-LNT ve hFVIII-LNT eğik serisini yeniden yapılandırma. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html: öğretici aşağıdaki IMOD yazılımın ETomo seçeneği ile
- Bir terminal penceresini kullanarak, 3DMOD yılında tomogram açın. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html.
- Bin IMOD BINVOL ile 4 ile tomogram tomografisinde boyutunu azaltmak için emrediyorum.
- IMOD ROTATEVOL komutunu kullanarak binned tomografisinde Y-ekseni boyunca lipid nanotüp döndürmek için doğru açıyı seçin.
- IMOD ROTATEVOL komutu ile tam tomogram döndürün.
- IMOD CLIP RESIZE komutu ile Y-ekseni boyunca yönlendirilmiş seçilen lipid nanotüp kırpın.
- 3DMOD ile kırpılmış alt tomogram açın.
- Boyunca Faktör VIII moleküllerin düzenleme görselleştirmek için tomografisinde tıklayınZ-ekseninde ve alt tomogram hacminde Y ekseni boyunca dilimleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rekombinant insan ve domuz FVIII başarılı bir şekilde negatif olarak aktive edilmiş trombosit yüzeyi benzeyen, bir iki-tabaka LNT şarj helezon şeklinde düzenlenmiştir., Insan ve domuz-FVIII Int sarmal düzenleme (Şekil 2), toplanan dijital mikrograflar ile tutarlıdır. Kontrol LNT ve insan ve domuz-FVIII LNT sarmal borular seçilir ve e2helixboxer.py GUI ve e2workflow.py GUI, tek parçacık seçeneği (Tablo 1) ile oluşturulan ilk veri setleri ile sınıflandırılmıştır.
Membrana bağlı insan ve domuz-FVIII Int ait helezoni sırası e2display.py GUI (EMAN2) (Şekil 3) ile sınıf ortalamalarının Fourier dönüşüm analizi yapıldı. Iyi kontrol LNT 2D sınıf ortalamalarında çift katlı lipid iyi tanımlanmıştır. Iç ve dış yaprakçık ve membran hidrofobik çekirdeğin daha düşük yoğunluklu (açıkça görülebilir
Insan ve domuz-FVIII Int için başlangıç 3D rekonstrüksiyonu nihai insan ve domuz-FVIII LNT veri kümelerinden 1000 temsil eden parçacıklar ile gerçekleştirilmiştir. Yüz ardışık IHRSR tekrarlamalar ilk hacmi olarak, özelliksiz bir silindir (160 Å iç ve 500 Å dış çap) her 3 boyutlu rekonstrüksiyon için çalıştırıldı. Birleştirilen Fourier hesaplanan eksenel yükselmesi (Δz) sarmal kesimleri (parçacıklar set) dönüşümü domuz FVIII-Int insan faktör VIII-Int, 36 boyunca 41 Â eşittir (Şekil 4A ve 4B). Yinelemeli arama tanımlanır ilk azimuthal açısı (ΔΦ) insan FVIII-LnT için 40.0 ° C'de ve domuz FVIII-LnT için 35.0 ° olarak tahmin edilmektedir. Nihai hacimleri son Reconstr gelen sınıf ortalamaları ve projeksiyonlar arasındaki sarmal parametreleri ve yazışma yakınsaması için denetlenmektediruction, aynı zamanda 5 'de tarif edilen kriterlere göre. Seçilen 3D rekonstrüksiyon ve sarmal parametreleri uygun bir başlangıç hacimleri ve Δz = 41.1 Å ve ΔΦ ile insan FVIII-LnT için dört başlatmak sarmal organizasyon yaklaşmıştır 100 devirden ikinci IHRSR arıtma için ilk sarmal parametreler olarak dayatılan = 42.0 ° ve Δz = 35.5 Å ve ΔΦ = 34.8 ° ile domuz FVIII-LnT için beş-start sarmal organizasyon. , 4-kat ve insan ve domuz-FVIII LNT rekonstrüksiyon için bir 5-kat simetri empoze sarmal bir son 100 IHRSR tekrarlamalar sırasıyla ilk ve son hacim asimetrik IHRSR iyileştirmeler (Şekil 4C ve 4D) için karşılık gelen helisel parametreler ile gerçekleştirilmektedir. Nihai hacmi 8 insan FVIII ve sarmal eksen (Şekil 5A) etrafında düzenlenmiş 10 domuz FVIII zara bağlı molekülleri gösterir. Her insanFaktör VIII molekülü, 41.2 çevrilmiş ve bir öncekinden itibaren 42.0 ° döndürülür ve her bir domuz molekülünün FVIII 35.9 tercüme edilir ve nihai 3D rekonstrüksiyonu (Şekil 5B) ve sarmal parametrelerine karşılık gelen, bir öncekinden itibaren 35.2 derece döndürülerek edilir.
Yeniden elektron tomografi aynı deney koşullarında elde edilen insan ve domuz-FVIII Int arasındaki sarmal kuruluşta farkı teyit etmektedir. Sarmal eksenine dik yönden bakıldığında sarmal yeniden gelen yeniden tomogram ve 3D miktarlar En iyi görüş karşılaştırılması, bundan başka, sarmal IHRSR parametrelerin (Şekil 6) ile rafine 3D rekonstrüksiyonlar doğruluğunu doğrular. İnsan FVIII-LNT 3D rekonstrüksiyon için asimetrik 2D birim hücre boyutları: a = 17.8 nm, b = 8.2, γ = 84 ° ve domuz FVIII-LNT 3D rekonstrüksiyon için: a =18.4, b = 7.2 ve γ = 70 ° (Şekil 6). Zara-bağlı 2D kristaller düzenlenen insan FVIII birim hücre boyutları: a = 8.1, b = zar yüzey 20 doğru inceledikleri bir Faktör VIII molekülünün kapladığı yüzeyin tekabül eder 67 ° 7.0 ve γ. 2D ve sarmal kristaller düzenlenen FVIII arasında birim hücre boyutlarının karşılaştırılması helezon şeklinde LNT yüzeyinde düzenlenmiş olduğu zaman insan ve domuz FVIII molekülleri, dimerler gösterir.
Şekil 1.. Yapısı analizi akış şeması. Adımlar EMAN2 16 uygulanan referans ücretsiz hizalama algoritmaları dayalı 2B sınıflandırma analizinde izlenen mavi çember vardır. 3D analizi iteratif sarmal gerçek ile yürütülen için adımlar takip uzay rekonstrüksiyon algoritmaları (IHRSR) kırmızı daire vardır. Iteratif IHRSR döngüleri kesik oklarla gösterilir.
Şekil 2.. Cryo-EM dijital mikrograflan. (4.096 x 4.096 piksel, 2.9 Å / pix) lipid nanotüpler (LNT) ait. A. Kontrol LNT. B. İnsan FVIII-LNT. C. Domuz FVIII-Int ve bağlı FVIII olmadan . FVIII-LNT amorf buz içinde süspansiyon haline getirilmiş olduğu karbon filmde deliğin kenarı beyaz bir yıldız ile belirtilmiştir. Protein ve lipid yoğunlukları siyah renktedir. X 512 512 büyütülmüş görünümleri (takmalar) (beyaz kare kesikli) sırasıyla, insan ve domuz FVIII'ünün sarmal organizasyonunda farkı göstermektedir alanlar kırpılmış. Ölçek çubuğu 100 nm.ig2highres.jpg "target =" _blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 3.. Temsilcisi 2D sınıf ortalamaları (üst sıra) ve ara parçacık kümeleri (Tablo 1) den gelen Fourier Dönüşümü (alt sıra) 50 sınıfları. A. Kontrol LNT B. İnsan FVIII-LNT C. Domuz FVIII-LNT sınıflandırılır. Sınıf sayısı ve her bir sınıfa dahil parçacıkların sayısı belirtilir. Insan ve domuz FVIII arasındaki sarmal sırayla fark açıkça görüntülerinde görülen ve bu görüntülerin dönüşümleri Fourier elde kırınım desenleri ile teyit edilir. bir görüntülemek için lütfen buraya tıklayınızBu rakamın büyük bir versiyonu.
Şekil 4., Insan ve domuz FVIII-LNT. A. Kombine Fourier 3D sarmal rekonstrüksiyon 1000 sarmal segmentlerinden dönüşümü. Birinci ve ikinci tabaka hattı 1/82 Å merkezli -1 ve 1/41 Å -1 insan FVIII-LnT için, ve 1/72 bir -1 ve 1/36 Å -1 domuz FVIII-LNT (beyaz için vardır oklar). B. Yüzey pembe insan gösterimi (Δz = 41.1 Å, ΔΦ = 42.0 º) ve mavi (Δz = 35.9 Å, ΔΦ = 35.2 º) FVIII-LNT 3D sarmal rekonstrüksiyon içinde domuz. Her iki cilt (minimum yoğunluk ucsf Chime hesaplanan, 0 ve maksimum yoğunluk 0.02 0.005 kontur düzeyde sunulmaktadırra, Cilt görüntüleyici seçeneği 21). FVIII-LNT tüpün uzunluğu 2.9 Å / pix 256 piksel. C. Fourier Shell İlişkisi (FSC), insan ve domuz FVIII-LNT FSC 20.5 Å bir çözünürlük gösteren = 0.5 için araziler olduğunu.
Şekil 5,. Şekil 4B'de gösterilen, insan ve domuz-FVIII LNT sarmal rekonstrüksiyonlar, insan ve domuz-FVIII Int. Segmentli yüzey gösterimi Sarmal organizasyonu. Hacimleri, insan FVIII-Int ve domuz FVIII-Int 5-kat simetri ile 4-kat simetri empoze sonra bölümlenmiştir. Asimetrik birimleri renk insan FVIII-Int ve insan için bir kare ile gösterilen sarmal ekseni boyunca ve gibi domuz FVIII-LNT. A. İzlenim için mavi-yeşil için sarı-kırmızı kodludomuz FVIII-LnT için bir beşgen. İnsan FVIII-LNT yapı dış LNT zarı etrafında organize 8 molekülleri gösterir ve domuz FVIII yapının dış LNT zarı etrafında organize 10. molekülleri, sayılar ile gösterilir. B. Okunma sarmal eksenine dik gösterir. İnsan FVIII-LNT 4-start sarmal yapısı ve domuz FVIII-LNT 5-start sarmal yapıdır. Bireysel bir başlangıç heliksler numaraları ile gösterilir ve renk kodlu vardır. Bir (*) ve yeşil hatları ile her yapıdan sarmal bir vurgulamışlardır. Ölçek çubuğu 20 nm.
Şekil 6,. Sarmal ve tomografik 3D rekonstrüksiyonu. Insan FVIII-LNT (A) ve domuz FVIII-LNT (C) sarmal 3D rekonstrüksiyonu karşılaştırılması gösterilmektedir Perpesarmal eksenine ndicular. Her birim hücre ve bireysel heliksler renk kodlu Şekil olarak 5.. B vardır. ve D. sarmal eksenine dik baktı 3D tomografi rekonstrüksiyon, yoğunluğu temsilleri vardır. FVIII moleküllerin sarmal düzenlemesi yansıtan 2B kafes yeşil çizgilerle gösterilmiştir.
| ÖRNEKLERİ | clnt | hFVIII-LNT | pFVIII-LNT |
| İlk Mikrografikleridir | 61 | 474 | 542 |
| İlk Parçacık setleri | 29113 | 60395 | 64665 |
| Bulanıklaştırma (nm) | -4051 ± 502 | -3643 ± 737 | -3443 ± 1.086 |
| Intermediate Parçacık setleri | 25907 | 27305 | 22773 |
| Final Parçacık setleri | 25907 | 10.455 | 10430 |
Tablo 1. Şekil 3 akış şeması sunulan algoritmayı aşağıdaki 2D analiz istatistikleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, bir yöntem son derece homolog proteinlerin iki zara bağlı kuruluşlar arasında ayırt etmek için sunulmuştur: İnsan ve domuz FVIII kendini monte insan vücudunda karşılaşılan koşullarda lipid nanotupler on.
Açıklanan prosedür, insan ve domuz FVIII başarıyla en kritik adımdır, lipid nanotüpler helozonik düzenlenmektedir. Sonraki kritik adım yakınındaki sıvı N 2 sıcaklıkta flaş donma sonucu ince amorf buz örnek korumaktır. Amorf ve buz LN2 sıcaklık örnek koruma hidratlanmış sarmal borular ve protein-lipid makromoleküler düzenekleri fizyolojik olarak aktif tutar. Son kritik adım yakın LN2 sıcaklığında yüksek çözünürlüklü 3D yapısı için yeterli miktar ve kalitede Cryo-EM veri elde edilir. Yakın LN2 sıcaklığında veri toplama daha yüksek v numunenin kurumasını engellerelektron ışınından mikroskop ve radyasyon hasarı acuum.
FVIII membran-bağlı yapısını hesaplamak için ilk önemli adım 2D referans ücretsiz sınıflandırma uygulanması ve düzenin aynı çap ve derecesi ile sınıflardan parçacıkları birleştirmek ile homojen parçacıklar (sarmal kesimleri) setleri elde etmektir. İkinci kritik adım sarmal yeniden inşası için doğru başlangıç hacmine ve sarmal parametreleri (yükseliş ve yön açısı) empoze etmektir. Üçüncü ve son kritik adım (dayatılan simetri olmadan) sarmal ve elektron tomografisi aynı örnekte rekonstrüksiyonu ile elde edilen 3D haritaları karşılaştırarak sarmal yapısını doğrulamak için.
Sunulan yöntemi, yaklaşık olarak fizyolojik koşullar altında zara bağlı proteinlerin işlevsel yapısını çözmek için kapasitesi benzersizdir. Laboratuvarımızda geliştirilen LNT olabilirbaşarılı bir şekilde fonksiyonel bir zara-bağlı, kan pıhtılaşma faktörlerinin sarmal bir organizasyon için bir platform olarak kullanılan ve zara bağlı 2D kristaller ve tek parçacıklar olarak düzenlenmiştir FVIII için daha iyi çözünürlük elde etmek. Hedefimiz son parçacık setleri homojenliği ve kalitesini geliştirerek sarmal rekonstrüksiyonların çözünürlüğü artırmak için. 2B yeniden inşası için büyük bir başlangıç parçacık setleri dahil bu nedenle daha iyi Cryo-EM koşulları (Alan emisyonu tabanca, enerji filtresi, DE kamera dedektörleri) FVIII-LNT sarmal liflerinden ve daha Cryo-EM mikrograflarıdır Toplama bu başaracaktır. FVIII-LNT sarmal montaj ve 3D rekonstrüksiyon algoritmaları geliştirerek bize alt nanometre ve net bir şekilde kan pıhtılaşma proteini için bu kritik membran bağlı organizasyonu tanımlamak olacaktır atomik çözünürlükte, yakın elde etmek için izin verir.
Helezonik homolog FVIII formları düzenleyerek de bize fırsatlar sun verirty sekansında farklılık yapısı ve fonksiyonu farklılıklara ilişkili nasıl karakterize etmek için. Bu makalede anlatılan yöntemler ile, insan ve domuz FVIII zara-bağlı yapılar özümleme yapılması ne zaman yeniden birleştirici FVIII işlevini geliştirecektir dizileri belirlemek yardımcı olabilir. Bu bilgi hem tromboz ve Hemostaz alanlarda ilaç keşfi için önemli klinik etkileri olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali ilgi var ve onlar bu yazının yayınlanmış işlemlerin herhangi ilgili olarak doğrudan temasa geçilebilir beyan.
Acknowledgments
10SDG3500034 ve UTMB-NCB SSM'ye fonları başlatmak: Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği Ulusal Bilim Geliştirme hibe ile desteklenmektedir. Yazarlar Sealy UTMB Structural Biyoloji Merkezi'nin (en Cryo-EM ve Bilimsel Hesaplama tesisleri kabul www.scsb.utmb.edu ) yanı sıra, Dr. 2D ve 3D sarmal rekonstrüksiyon algoritmaları ile yardım Steve Lüdtke ve Ed Egelman.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| JEM2100 with LaB6 | JEOL Ltd. | JEM-2100 | operated at 200 kV |
| with TEMCON software | JEOL Ltd. | ||
| Gatan626 Cryo-holder | Gatan, Inc. | 626.DH | cooled to -175 °C |
| with temperature controler unit | Gatan, Inc. | ||
| Gatan 4K x 4K CCD camera | Gatan, Inc. | US4000 | 4,096 x 4,096 pixel at 15 μm/pixel physical resolution |
| Solarus Model 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. | ||
| Vitrobot Mark IV | FEI | ||
| Carbon coated 300-mesh 3 mm copper grid | Ted Pella | 01821 | plasma cleaned for 10 sec on high power |
| Quantifoil R2/2 300 mesh | Electron Microscopy Sciences | Q225-CR2 | Carbon coated 300-mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes |
| Uranyl acetate dihydrate | Ted Pella | 19481 | 1% solution, filtered |
| Galactosyl ceramide | Avanti Polar Lipids Inc. | 860546 | |
| Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids Inc. | 840035 | |
| EM software Digital Micrograph | Gatan, Inc. | http://www.gatan.com/DM/ | |
| EM software EMAN | free download | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/ | |
| EM software Spider | free download | http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | |
| EM software IHRSR | free download | Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/ | |
| EM software (IMOD) | free download | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | |
| EM software (SerialEM) | free download | ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/ | |
| UCSF-Chimera | free download | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html |
References
- Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 37, 3-13 (2004).
- Fujiyoshi, Y., Unwin, N. Electron crystallography of proteins in membranes. Current opinion in structural biology. 18, 587-592 (2008).
- Toole, J. J., et al. Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophilic factor. Nature. 312, 342-347 (1984).
- Fay, P. J. Factor VIII structure and function. International journal of hematology. 83, 103-108 (2006).
- Stoilova-McPhie, S., Lynch, G. C., Ludtke, S. J., Pettitt, B. M. Domain organization of membrane-bound factor VIII. Biopolymers. , (2013).
- Pipe, S. W. Hemophilia: new protein therapeutics. Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. American Society of Hematology. Education Program. 2010, 203-209 (2010).
- Gatti, L., Mannucci, P. M. Use of porcine factor VIII in the management of seventeen patients with factor VIII antibodies. Thrombosis and haemostasis. 51, 379-384 (1984).
- Parmenter, C. D., Cane, M. C., Zhang, R., Stoilova-McPhie, S. Cryo-electron microscopy of coagulation Factor VIII bound to lipid nanotubes. Biochemical and biophysical research communications. 366, 288-293 (2008).
- Parmenter, C. D., Stoilova-McPhie, S. Binding of recombinant human coagulation factor VIII to lipid nanotubes. FEBS letters. 582, 1657-1660 (2008).
- Wassermann, G. E., Olivera-Severo, D., Uberti, A. F., Carlini, C. R. Helicobacter pylori urease activates blood platelets through a lipoxygenase-mediated pathway. Journal of cellular and molecular medicine. 14, 2025-2034 (2010).
- Wilson-Kubalek, E. M., Chappie, J. S., Arthur, C. P. Helical crystallization of soluble and membrane binding proteins. Methods in enzymology. 481, 45-62 (2010).
- Egelman, E. H. Reconstruction of helical filaments and tubes. Methods in enzymology. 482, 167-183 (2010).
- Lusher, J. M. Development and introduction of recombinant factor VIII--a clinician's experience. Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 18, 483-486 (2012).
- Thim, L., et al. Purification and characterization of a new recombinant factor VIII (N8). Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 16, 349-359 (2010).
- Doering, C. B., Healey, J. F., Parker, E. T., Barrow, R. T., Lollar, P. High level expression of recombinant porcine coagulation factor VIII. The Journal of biological chemistry. 277, 38345-38349 (2002).
- Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of structural biology. 157, 38-46 (2007).
- Egelman, E. H. A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods. Ultramicroscopy. 85, 225-234 (2000).
- Egelman, E. H. The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers. Journal of structural biology. 157, 83-94 (2007).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of structural biology. 152, 36-51 (2005).
- Stoilova-McPhie, S., Villoutreix, B. O., Mertens, K., Kemball-Cook, G., Holzenburg, A. 3-Dimensional structure of membrane-bound coagulation factor VIII: modeling of the factor VIII heterodimer within a 3-dimensional density map derived by electron crystallography. Blood. 99, 1215-1223 (2002).
- Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of structural biology. 157, 281-287 (2007).
