Summary
We presenteren een combinatie van cryo-elektronenmicroscopie, lipide nanotechnologie en structuuranalyse aangebracht op het membraan gebonden structuur van twee zeer homologe FVIII vormen lossen: mens en varken. De in ons laboratorium ontwikkeld om de twee functionele recombinante FVIII vormen spiraalvormig organiseren negatief geladen lipide nanotubes (LNT) methode wordt beschreven.
Abstract
Cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) 1 is een krachtige aanpak om de functionele structuur van eiwitten en complexen in een gehydrateerde toestand en membraan milieu 2 onderzoeken.
Coagulatie Factor VIII (FVIII) 3 is een multi-domein bloedplasma glycoproteïne. Gebrek of tekort aan FVIII is de oorzaak voor Hemofilie type A - een ernstige bloeden stoornis. Na proteolytische activatie FVIII bindt aan de serineprotease Factor IXa op de negatief geladen bloedplaatjes membraan, dat essentieel is voor normale bloedstolling 4. Ondanks de centrale rol FVIII speelt bij de bloedstolling, structurele informatie voor zijn membraangebonden staat onvolledig 5. Recombinant FVIII concentraat is de meest effectieve middel tegen type Hemofilie A en in de handel verkrijgbaar FVIII kan worden uitgedrukt als mens of varken, beide aldus functionele complexen met humaan Factor IXa 6,7.
"> In deze studie presenteren we een combinatie van cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM), lipide nanotechnologie en structuuranalyse aangebracht op het membraan gebonden structuur van twee zeer homologe FVIII vormen lossen. Mens en varken De in ons laboratorium ontwikkelde methodologie de twee functionele recombinante FVIII vormen spiraalvormig organiseren negatief geladen lipide nanotubes (LNT) wordt beschreven. De representatieve resultaten demonstreren dat onze benadering voldoende gevoelig voor de verschillen in de schroeflijnvormige ordening tussen twee zeer homologe worden (86% sequentie identiteit definiëren ) eiwitten. Gedetailleerde protocollen voor de spiraalvormige organisatie, Cryo-EM en electron tomography (ET) gegevensverzameling krijgen. de tweedimensionale (2D) en driedimensionale (3D) structuuranalyse toegepast op de 3D reconstructies van mens en varken vinden FVIII-LNT wordt besproken. De gepresenteerde mens en varken FVIII-LNT structuren tonen het potentieel van de voorgestelde methodologie om berekend wordene de functionele, membraan-gebonden organisatie van bloed stollingsfactor VIII, met een hoge resolutie.Introduction
Bloed stollingsfactor VIII (FVIII) is een groot glycoproteïne van 2332 aminozuren georganiseerd in zes domeinen: A1-A2-B-A3-C1-C2-3. Na activatie FVIII Trombine fungeert als cofactor voor Factor IXa bij de membraangebonden TENase complex. Binding van geactiveerde FVIII (FVIIIa) naar FIXa in een membraan afhankelijk wijze verhoogt FIXa proteolytische rendement meer dan 10 5 maal, wat essentieel is voor een efficiënte bloedstolling 4. Ondanks de belangrijke rol speelt bij coagulatie FVIII en TENase complexvorming, het functionele membraan gebonden FVIII structuur nog worden opgelost.
Om dit aan te pakken, hebben enkele lipide dubbellaag nanobuisjes (LNT) rijk aan fosfatidylserine (PS) kan binden met hoge affiniteit FVIII 8, 9 en lijkt het geactiveerde bloedplaatjes oppervlak ontwikkeld 10. Opeenvolgende spiraalvormige ordening FVIII gebonden aan LNT is bewezen doeltref zijnve voor de structuurbepaling van FVIII-membraan gebonden toestand door Cryo-EM 5. Gefunctionaliseerde LNT zijn een ideaal systeem om eiwit-eiwit en eiwit-membraan interacties schroeflijnvormig georganiseerde membraan geassocieerde proteïnen Cryo-EM 11, 12. Cryo-EM heeft het voordeel boven traditionele structurele werkwijzen zoals röntgenkristallografie en NMR, als het monster wordt bewaard in het dichtst bij de fysiologische omgeving (buffer, membraan, pH), zonder toevoegingen en isotopen. Bij FVIII, bestuderen van de membraangebonden structuur met deze techniek is nog fysiologisch relevant, aangezien LNT lijken dicht door grootte, vorm en samenstelling van de pseudopodia van de geactiveerde bloedplaatjes waar TENase complexen assembleren in vivo.
Gebreken en tekort aan FVIII oorzaak hemofilie A, een ernstige bloeden aandoening die 1 op de 5000 mannen van de menselijke bevolking 4, 6. De meeste effectieve therapie voor Hemofilie A is levenslang toedienen van recombinant FVIII (hFVIII). Een belangrijke complicatie van de recombinante FVIII Hemofilie A therapie is de ontwikkeling van remmende antilichamen tegen de menselijke vorm die ongeveer 30% van hemofilie A patiënten 13. In dit geval is fVIII van varken (pFVIII) concentraat gebruikt, omdat varkens FVIII displays laag kruisreactiviteit met remmende antilichamen tegen humane factor VIII en vormen functionele complexen met humaan FIXa 7. Vaststelling van de membraangebonden organisatie van zowel varkens en menselijke FVIII vormen is belangrijk om de structurele basis van FVIII cofactorfunctie en implicaties bloed hemostase begrijpen.
In deze studie beschrijven we een combinatie van lipide nanotechnologie, Cryo-EM en structuuranalyse ontworpen om de membraangebonden ordening twee zeer homologe FVIII vormen lossen. De gepresenteerde Cryo-EM databank 3D structuren schroeflijnvormig georganiseerd Porcine en humane FVIII op negatief geladen LNT tonen het potentieel van de voorgestelde nanotechnologie als basis voor structuurbepaling van FVIII en membraangebonden stollingsfactoren en complexen in een fysiologische omgeving membraan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Monstervoorbereiding
- Bufferuitwisseling humane FVIII-BDD 14 en varkens-FVIII BDD 15 tegen HBS-Ca-buffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, pH = 7,4) en concentreer tot 1,2 mg / ml. Houd de eiwitoplossing bij -80 ° C.
- Bereid lipide nanotubes (LNT) door mengen galactosylceramide (GC) en fosfatidylserine (PS) en 1:04 w / w ratio chloroform. Damp het chloroform onder argon en de lipiden oplosbaar in HBS-buffer tot 1 mg / ml. Houd de LNT oplossing bij 4 ° C.
2. Cryo-elektronen microscopie van FVIII-LNT
- Cryo-EM Monsterbereiding
- Gloedlossing de 300 mesh Quantifoil R2 / 2 koperen roosters (carbon kant naar boven) in een mengsel van O 2 en H 2 gas voor 10 sec bij 50 W.
- Meng de FVIII en LNT oplossingen HBS-buffer Ca 1:1 w / w ratio en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Breng een druppel van 2,5 ulvan FVIII-LNT monster naar de hydrofiele elektronenmicroscopie rooster in de Vitrobot Mark IV vochtige kamer (100% luchtvochtigheid).
- Blot en flits bevriezen de grid (een vlek voor 3,5 sec, vlek kracht 1) in vloeibare C 2 H 6, afgekoeld door vloeibare N 2 tot amorfe ijs te verkrijgen.
- Store roosters in opbergdozen onder vloeibare N2 (LN2).
- Cryo-EM Data Collection
OPMERKING: De JEM2100-LaB6 (2010) is voorzien van een TEMCON besturingssysteem bestaat uit een computer met elektronenmicroscoop, een scherm met ramen lezen vacuümsysteem, verlichtingssysteem, HT, lens stromen en zo-on en twee panelen: links en rechts, geplaatst aan beide zijden van de kolom. De bundel verschuiving X, Y knoppen (SHIFT Y, SIFT Y) en de multifunctionele (DEF / STIG) knoppen zijn op beide panelen. Op het linker paneel is de verlichting (omhoog dimmen) knop. Op het paneel rechts: de vergroting (MAG / CAM LENGTH) en scherpstelling (FOCUS) knoppen en de drie imaging (MAG1, mag2, LOWMAG) en een diffractie (DIFF) modi knoppen. We krijgen onze data in MAG1 bij alpha 2. De minimale dosis belichtingcondities (MDS) vereist voor Cryo-EM data-acquisitie worden ingesteld met F1 tot en met F6 knoppen, bovenste rij op rechter paneel. In dit protocol de generieke instellingen worden gebruikt: F1 - hoger / lager scherm, F2 - ZOEK-modus, F3 - FOCUS mode, F4 - FOTO-modus, F5 - MDS OFF / ON en F6 - BEAM BLANK, gebruikt om het monster te beschermen tegen straling beschadigen afbuigen van de bundel.- Plaats de cryo-houder in de cryo-station en vul de Dewar van de houder en de cryo-station met LN2. Wanneer de temperatuur bereikt -192 ° C, open blind op de houder tip, plaats eerder bevroren Cryo-EM rooster in de daarvoor bestemde plaats en beveiligen met een ring klem.
- Plaats de cryo-houder in de elektronenmicroscoop. Vul het Dewar van de cryo-houder en de anti-Contaminator kamer met LN2. Wacht totdat de houder te stabiliseren gedurende 30-60 minuten. Druk op F6 op enzet de gloeidraad op. Als de gloeidraad verzadigd is, drukt u op F6 uit en open blind op de houder aan het net te bekijken.
- Druk Lage Mag / alpha 1 (vastgesteld op 200X mag) en lokaliseren gebieden met dun ijs op de grid.
- Schakel naar MAG 1/alpha 2 tot minimale dosis (MDS) in te stellen en het verwerven van Cryo-EM gegevens bij lage elektron doses, zonder beschadiging van het monster.
- Druk op F2 om onderzoek in te stellen. Stel vergroting op 40.000 x. Vergroten bundel met brigtness knop om minimale elektron dosis ~ 0,04 e - / Å 2 · s. Druk DIFF om naar diffractie modus. Zet camera lengte tot 120 cm met MAG / CAM LENGHT knop. Toon gebieden op het rooster binnen de vooraf geselecteerde gebieden in LOWMAG dat lipide nanobuisjes in de gaten van de koolstoffilm hebben.
- Druk op F4 om de fotomodus vastgesteld op 40.000 X vergroting en stel belichting met HELDER knop bij doses van 16-25 e - / Å 2 · s. Druk Standaard Focus om de scherpte-voorwaarden te stellen het aanpassen van de Z-hoogtevan het monster met de Z-UP / DOWN (RECHTS bedieningspaneel). Stel defocus tussen -1,5 en -2,5 urn.
- Lijn SEARCH en FOTO modus door het tekenen van een plein in het venster Live View op de digitale camera-monitor in ZOEK-modus die overeenkomt met het gebied dat moet worden afgebeeld in de fotomodus.
- Druk op F3 om Scherpstelinstelling vastgesteld op 100.000 X vergroting. Focus verlichting aan de CCD-chip dekken (~ 4-5 cm straal) en de as af te bestralen gebied af te beelden in de fotomodus. Pas defocus te ~ -1.5 en -2.5 urn met de FOCUS knop en correct voor astigmatisme van het beeld met DEF / STIG knoppen.
- Selecteer de FVIII-LNT in ZOEK-modus af te beelden door het verwerven van live beelden in het venster Live View op de digitale camera. Centreer de FVIII-LNT op het plein getrokken op de LIVE VIEW venster.
- Neem een digitaal beeld op de CCD camera bij 52.000 X effectieve vergroting en 0,5 sec belichting door te schakelen naar de fotomodus en te klikken op de AcquirE-knop op de digitale microscoop camera monitor. Het beeld acquisitie voorwaarden worden gesteld, zoals de bundel blanco (SHUTTERS) alleen open wanneer het beeld wordt verkregen in de fotomodus.
- Controleer de kwaliteit en defocus van de verworven afbeelding door op CTRL-F om het verkrijgen van een Fast Fourier Transform (FFT).
3. 3D reconstructie
OPMERKING: De beeldanalyse software die wordt gebruikt voor de 2D-en 3D-analyse: EMAN2 en IHRSR zijn vrij beschikbaar. EMAN2 kan worden gedownload van http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install. De IHRSR software kan worden verkregen van professor Egelman: egelman@virginia.edu. De uiteindelijke IHRSR verfijningen worden uitgevoerd op de Texas Advanced Computing centrum cluster: http://www.tacc.utexas.edu/ aan de Universiteit van Texas, Austin. De 3D-reconstructie-algoritme zoals afgebeeld op figuur 1 bestaat uit twee stappen: eerste de keuze van een homogene reeks spiraalvormige segmenten (deeltjes) met de 2D verwijzing gratis alignment (RFA) algoritmen geïmplementeerd in EMAN 2, tweede bereiken van een 3D-reconstructie op basis van de spiraalvormige parameters en terug projectie algoritmen opgenomen in IHRSR. De eerste stap maakt gebruik van de ontwikkelde voor het selecteren van homogene deeltjes sets voor 3D-reconstructie met Single Particle SPA (algoritmes) waarvoor EMAN2 is specifiek ontwikkeld en verspreid programma: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2. Deze stap is aangepast aan de cryo-EM gegevens. De tweede stap wordt bereikt met de IHRSR algoritme, dat specifiek is voor het type spiraalvormige samenstellingen verkregen met de recombinante Factor VIII vormen. Dit algoritme is uitgebreid gedocumenteerd door de wetenschappelijke literatuur 12.
- Voer 2D beeldanalyse met de EMAN2 wetenschappelijke beeldverwerking suite: http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html 16 tot homogene deeltjes (spiraalvormige segment) sets voor spiraalvormige reconstructie selecteren.
- Selecteer Cryo-EM micro-opnamen met straight en goed georganiseerde spiraalvormige buizen met de digitale camera software en visualisatie tools.
- Omkeren, normaliseren en het filter voor X-ray pixels in de e2workflow.py GUI, enkel deeltje reconstructie optie (spr): http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager
- Importeer het omgekeerde, genormaliseerd en X-ray pixel gefilterde beelden in de e2helixboxer.py GUI. Selecteer FVIII-LNT spiraalvormige buizen en segment op 256 x 256 pixels (2.9 Å / pix) met 90% overlap met: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer
- Evalueer de onscherpte van de oorspronkelijke micro-opnamen en het contrast transfer functie (CTF) correctie (alleen fase correctie) van toepassing op de spiraalvormige segmenten van dezelfde micro-opnamen met de e2ctf.py optie opgenomen in het e2workflow.py: http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf.
- Genereer initiële deeltjes (spiraalvormige segmenten) stelt in de e2workflow.py GUI - SPR optie: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow.
- Bereken 2D klasse gemiddelden met de e2refine2d.py algoritme toepassen verwijzing gratis k-gemiddelde classificatie homogene datasets met dezelfde LNT en de mate van spiraalvormige orde (figuur 2) diameter selecteren, volgt het script: 'e2refine2d.py - iter = 8 - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - path = r2d_001 - ingang = INPUT.hdf - NCLs = 51 - simcmp = dot - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp = dot - classraligncmp = fase - classiter = 2 - classkeep = 0,8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = gemiddelde - normproj-classkeepsig ', de NCLs waarde dienovereenkomstig te veranderen.
- Classificeren de in 'NCLs = 151' 150 klassen over 8 iteraties met 'classkeep = 0,8' eerste gegevens, wat betekent dat deeltjes met minder dan 80% gelijkenis met de klasse gemiddelde zijn uitgesloten van de betreffende klasse. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d
- Deeltjes samenvoegen van klasgemiddeldenmet uitgesproken spiraalvormige diffractie in e2display.py tussenliggende dataset te creëren.
- Classificeren van de set in 50 klassen 'NCLs = 51' naar klassen met dezelfde diameter en de mate van orde differentiëren tussenliggende data.
- Deeltjes samenvoegen van klassen met dezelfde diameter en de mate van orde in e2display.py om de uiteindelijke dataset voor de drie-dimensionale reconstructie te maken: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector.
- Voer schroefvormige reconstructie met iteratief Helical Real Space Reconstruction (IHRSR) dat is beschreven in Egelman 17, 18.
- Schatten de opkomst, Az (A) van de FVIII-LNT helix uit de gecombineerde Fourier-transformatie van de deeltjes in de uiteindelijke dataset.
- Definieer de azimuthoek ΔΦ (º) door het uitvoeren van parallelle IHRSR verfijningen met een constante Az, toenemende ΔΦ van 576; tot 60 ° in stappen van 5 °.
- Run 100 opeenvolgende IHRSR cycli voor elk laatste set met een karakterloze cilinder als een eerste volume en de eerste spiraalvormige parameters Az en ΔΦ zoals gedefinieerd in 3.2.1 gegevens. en 3.2.2.
- Inspecteer de laatste delen van convergentie van de spiraalvormige parameters en de correspondentie tussen klasse gemiddelden van de 2D-indeling van de uiteindelijke dataset en de projecties van de uiteindelijke IHRSR reconstructie.
- Impose symmetrie de definitieve 3D-reconstructies, overeenkomend met de asymmetrische eenheid verdeling waargenomen in de definitieve asymmetrische 3D-volumes: 4-voudig voor de humane FVIII-LNT en 5-voudig voor varkens FVIII-LNT. Voer nogmaals een 100 verfijning cycli tot een uiteindelijke symmetrized 3D reconstructie te genereren.
- Bereken de Fourier Shell Correlatie curve voor beide volumes door eerst het scheiden van de overeenkomstige gegevens in even en oneven: 'e2proc2d.py <infile> <outfile> - split = 2 '. Dan start 100 IHRSR opeenvolgende verfijningen zoals beschreven in 3.2.3. Bereken de FSC van de 3D-volumes gemaakt op basis van de even en oneven datasets: 'e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc'.
- Visualiseren en Segment de FVIII-LNT volumes in UCSF hersenschim.
- Open de laatste delen van stap 3.2.5. in UCSF Chimera en zet de contour niveau tot 0,005 in het TOOLS> datavolume> Volume Viewer optie.
- In TOOLS> datavolume> SEGMENT MAP, select volume in SEGMENT tabblad kaart en klik op segment segment het volume.
- Segmenten groep die overeenkomt met een eenheid cel door te selecteren met CTRL + SHIFT en klikken groep.
- Kleur de segmenten door eenheidscel en Helix met ACTIES> COLOR optie om de structurele kenmerken te benadrukken.
4. Electron tomography
- Negatief gekleurde FVIII-LNT Monsterbereiding
- <li> Bereid FVIII-LNT monsters voor de Cryo-EM-experimenten.
- Glimontladingen koolstof beklede 300-mesh koperen rooster (carbon naar boven) in een mengsel van O2 en H2-gas gedurende 10 seconden bij 50 W als voor Cryo-EM experimenten.
- Breng een druppel van 2,5 ul FVIII-LNT ophanging met 6-nm colloïdaal goud nanodeeltjes aan het net, dep de overtollige vloeistof en negatief vlekken door het toepassen van 5 pi 1% uranylacetaat oplossing gedurende 2 minuten. Dep de overtollige vloeistof en lucht drogen het rooster.
- Breng het rooster in de interne tilt houder.
- Plaats de houder in de elektronenmicroscoop.
- Verzamel tilt serie automatisch met de SerialEM software 19 bij 2 ° stappen over een hoek van -60 ° tot +60 ° en beelden opnemen met een CCD-camera bij 52.000 X effectieve vergroting, -6 tot -10 urn defocus en elektronen dosis van 150 - 170 electrons / Å 2 · s per tomogram.
Opmerking: Reconstrueer de pFVIII-LNT en hFVIII-LNT gekanteld serie verworven in 4.2. met de optie ETomo van de IMOD software volgt de tutorial: http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html
- Met behulp van een terminal venster, open het tomogram in 3DMOD. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html.
- Bin het tomogram door 4 met de IMOD BINVOL gebieden de omvang van het tomogram verminderen.
- Kies de juiste hoek met de lipide nanobuis langs de Y-as in de binned tomogram met de opdracht IMOD ROTATEVOL roteren.
- Draai de volledige tomogram met het commando IMOD ROTATEVOL.
- Snijd de geselecteerde lipide nanobuis georiënteerd langs de Y-as met de IMOD CLIP AFM.WIJZ commando.
- Open de bijgesneden sub-tomogram met 3DMOD.
- Klik op de tomogram naar de regeling van factor VIII-moleculen samen te visualiserenDe segmenten in Z-as en langs de Y-as in de sub-tomogram volume.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Recombinant mens en varken FVIII succesvol spiraalvormig georganiseerd negatief geladen enkele dubbellaag LNT, lijkt het geactiveerde bloedplaatjes oppervlak. De schroeflijnvormige ordening van de mens en varken FVIII-LNT was consistent in de opgevangen digitale microfoto (figuur 2). De controle LNT en de mens en varken FVIII-LNT spiraalvormige buizen werden geselecteerd en gesegmenteerd met de e2helixboxer.py GUI en initiële data sets gemaakt met de e2workflow.py GUI, Single deeltje optie (tabel 1).
De spiraalvormige volgorde van de membraangebonden mens en varken FVIII-LNT werd geëvalueerd van de Fourier transformatie van de klasgemiddelden de e2display.py GUI (EMAN2) (Figuur 3). De lipidendubbellaag de beste controle LNT 2D klasse gemiddelden is goed gedefinieerd. De binnenste en buitenste laag en een lagere dichtheid van het membraan hydrofobe kern zijn duidelijk zichtbaar (
Initiële 3D reconstructies van de mens en varken FVIII-LNT werden uitgevoerd met 1000 representatieve deeltjes van de uiteindelijke mens en varken FVIII-LNT datasets. Honderd opeenvolgende IHRSR iteraties werden uitgevoerd voor elke 3D-reconstructie met een karakterloze cilinder (160 Å binnenste en 500 A buitendiameter), als initiële volume. De axiale stijging (Az) berekend uit de gecombineerde Fourier-transformatie van de schroeflijnvormige segmenten (deeltjes set) gelijk aan 41 A voor humane FVIII-LNT en 36 A voor varkens FVIII-LNT (Figuren 4A en 4B). De initiële zichthoek (ΔΦ) gedefinieerd op basis van de iteratieve zoektocht wordt geschat op 40,0 ° voor de menselijke FVIII-LNT en bij 35,0 ° voor de varkens FVIII-LNT. De laatste delen worden geïnspecteerd op de convergentie van de spiraalvormige parameters en de correspondentie tussen klasse gemiddelden en projecties van de uiteindelijke Reconstruction, ook naar aanleiding van de in punt 5 beschreven criteria. De geselecteerde 3D-reconstructies en bijbehorende spiraalvormige parameters worden opgelegd als eerste volumes en de eerste spiraalvormige parameters voor een tweede IHRSR verfijning van 100 cycli die geconvergeerd naar een vier-start spiraalvormige organisatie voor het menselijk FVIII-LNT met Az = 41,1 Å en ΔΦ = 42,0 ° en een vijf-start spiraalvormige organisatie voor de varkens FVIII-LNT met Az = 35,5 Å en ΔΦ = 34,8 °. Een laatste 100 IHRSR iteraties het opleggen van een 4-voudige en een 5-voudige spiraalvormige symmetrie voor de mens en varken FVIII-LNT reconstructies respectievelijk worden uitgevoerd met initiële volumes en bijbehorende spiraalvormige parameters van de laatste asymmetrische IHRSR verfijningen (figuren 4C en 4D). De laatste delen tonen 8 menselijke FVIII en 10 varkens FVIII membraangebonden moleculen georganiseerd rond het spiraalvormige as (figuur 5A). Ieder mensFVIII molecuul vertaald 41,2 A en geroteerd 42.0 ° van de vorige en elk varken factor VIII molecuul wordt vertaald 35,9 A en 35,2 graden gedraaid vanuit de vorige, overeenkomende met de spiraalvormige parameters van de definitieve 3D-reconstructies (Figuur 5B).
De gereconstrueerde elektron tomograms bevestigen het verschil in ordening tussen de schroeflijnvormige mens en varken FVIII-LNT verkregen op dezelfde proefomstandigheden. Vergelijking van de bovenaanzichten van de gereconstrueerde tomograms en 3D-volumes van de spiraalvormige reconstructie gezien in de richting loodrecht op de spiraalvormige as bevestigt verder de juistheid van de 3D-reconstructies verfijnd met de IHRSR schroeflijnvormige parameters (figuur 6). De asymmetrische 2D eenheidscel afmetingen voor de menselijke FVIII-LNT 3D-reconstructie zijn: a = 17.8 nm, b = 8,2, γ = 84 ° en voor de varkens FVIII-LNT 3D-reconstructie: a =18,4, b = 7,2 en γ = 70 ° (figuur 6). De eenheidscel afmetingen van humane FVIII georganiseerd membraangebonden 2D kristallen zijn: a = 8,1, b = 7,0 en γ = 67 °, wat overeenkomt met het oppervlak met een FVIII molecuul gezien naar het membraan-oppervlak 20. Vergelijking van de eenheid afmetingen tussen FVIII georganiseerd 2D cilindrische kristallen geeft aan dat zowel mens en varken factor VIII moleculen vormen dimeren wanneer spiraalvormig georganiseerd op LNT oppervlak.
Figuur 1. Structuur analyse stroomschema. De stappen gevolgd voor de 2D-indeling analyse op basis van referentie-vrije uitlijningsalgoritmen in EMAN2 16 geïmplementeerd worden blauw omcirkeld. De stappen gevolgd voor de 3D-analyse uitgevoerd met de iteratieve spiraalvormige echte ruimte reconstructiealgoritmen (IHRSR) zijn rood omcirkeld. De iteratieve cycli IHRSR aangeduid met onderbroken pijlen.
Figuur 2. Cryo-EM digitale micrografen. (4096 x 4096 pixels, 2.9 Å / pix) van lipide nanobuisjes (LNT) met en zonder gebonden FVIII. A. Controle LNT. B. Human FVIII-LNT. C. Varkens FVIII-LNT . De rand van het gat in de koolstoffilm waarin de FVIII-LNT gesuspendeerd in amorfe ijs wordt aangeduid met een witte ster. De eiwitten en lipiden dichtheden in zwart. De vergrote weergave (inlegwerk) van 512 x 512 bebouwde gebieden (wit gestippelde vierkant) illustreren het verschil in de spiraalvormige organisatie van de mens en varken FVIII, respectievelijk. De schaal bar is 100 nm.ig2highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Vertegenwoordiger 2D klasse gemiddelden (bovenste rij) en de bijbehorende Fourier transformaties (onderste rij) van de middelste deeltje sets (tabel 1) ingedeeld in 50 klassen. A. Controle LNT B. Human FVIII-LNT C. Varkens FVIII-LNT. Nummer van de klasse en het aantal deeltjes in elke klasse zijn aangegeven. Het verschil in spiraalvormige volgorde tussen de mens en varken FVIII is duidelijk te zien op de afbeeldingen en bevestigd door de diffractie patronen verkregen uit de Fourier-transformaties van deze beelden. Klik hier om te bekijkengrotere versie van deze figuur.
Figuur 4. 3D spiraalvormige reconstructies van mens en varken FVIII-LNT. A. Gecombineerde Fourier-transformatie uit 1000 spiraalvormige segmenten. De eerste en tweede laag lijn zijn gecentreerd op 1/82 Å -1 en 1/41 Å -1 voor menselijke FVIII-LNT, en op 1/72 Å -1 en 1/36 Å -1 voor varkens FVIII-LNT (wit pijlen). B. Oppervlakte voorstelling van de mens in roze (Az = 41,1 Å, ΔΦ = 42,0 º) en varkens in het blauw (Az = 35,9 Å, ΔΦ = 35,2 º) FVIII-LNT 3D spiraalvormige reconstructies. Beide volumes worden gepresenteerd op 0.005 contour niveau (minimale dichtheid is 0 en maximale dichtheid 0,02, zoals berekend in UCSF Chimera, Volume kijker optie 21). De lengte van de FVIII-LNT buis is 256 pixels bij 2.9 Å / pix. C. Fourier Shell Correlatie (FSC) percelen voor mens en varken FVIII-LNT met een resolutie van 20,5 Å op FSC = 0,5.
Figuur 5. Spiraalvormige organisatie van mens en varken FVIII-LNT. Gesegmenteerde oppervlak voorstelling van mens en varken FVIII-LNT spiraalvormige reconstructies, zie figuur 4B. De hoeveelheden zijn gesegmenteerd na instelling 4-voudige symmetrie menselijke FVIII-LNT en 5-voudige symmetrie varkens FVIII-LNT. De asymmetrische eenheden zijn kleurcode geel-rood voor de humane FVIII-LNT en blauw-groen voor de varkens FVIII-LNT. A. Bekeken langs de spiraalvormige as aangeduid met een vierkant voor de mens en alseen vijfhoek voor de varkens FVIII-LNT. De humane FVIII-LNT structuur toont 8 moleculen georganiseerd rond de buitenste membraan LNT en varkens FVIII structuur toont 10 moleculen georganiseerd rond de buitenste LNT membraan, aangeduid met getallen. B. bekeken loodrecht op de spiraalvormige as. Het menselijke FVIII-LNT is een 4-start spiraalvormige structuur en de varkens FVIII-LNT is een 5-start spiraalvormige structuur. De individuele een start helices zijn aangegeven met nummers en kleurcode. We hebben benadrukt een van de helices van elke structuur met een (*) en groene lijnen. De schaal bar is 20 nm.
Figuur 6. Vergelijking tussen de schroeflijnvormige en tomografische 3D-reconstructies. Het humane FVIII-LNT (A) en varkens-FVIII LNT (C) schroefvormige 3D reconstructies getoond veroorzakerndicular de spiraalvormige as. Elke eenheid cel en individuele helices hebben een kleurcode als in figuur 5. B. en D. dichtheid zijn voorstellingen van de 3D tomografie reconstructies, gezien loodrecht op de spiraalvormige as. De 2D-rooster als gevolg van de spiraalvormige plaatsing van de FVIII moleculen wordt getoond met groene lijnen.
| MONSTERS | CLNT | hFVIII-LNT | pFVIII-LNT |
| Initial Micrografen | 61 | 474 | 542 |
| Initial Particle sets | 29.113 | 60395 | 64.665 |
| Defocus (nm) | -4051 ± 502 | -3643 ± 737 | -3.443 ± 1.086 |
| Intermediate Particle sets | 25.907 | 27.305 | 22.773 |
| Final Particle sets | 25.907 | 10,455 | 10,430 |
Tabel 1. 2D statistische analyse na het algoritme weergegeven in het stroomschema in figuur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit werk een methode gepresenteerd om tussen twee membraangebonden organisaties sterk homoloog eiwit: mens en varken FVIII zelf-geassembleerde op lipide nanobuizen aangetroffen in het menselijk lichaam omstandigheden.
In de beschreven procedure, zijn mens en varken FVIII succes spiraalvormig georganiseerd lipide nanobuisjes, dat is de meest kritische stap. De volgende belangrijke stap is om het monster in dunne amorfe ijs in de buurt van vloeibare N 2 temperatuur te behouden door flits bevriezen. Het behoud van het monster in amorfe ijs en LN2 temperatuur blijft de spiraalvormige buizen gehydrateerd en het eiwit-lipide macromoleculaire assemblages fysiologisch actief. De laatste belangrijke stap is het verwerven van Cryo-EM gegevens van voldoende kwantiteit en kwaliteit voor een hoge-resolutie 3D-structuur op buurt LN2 temperatuur. Verzamelen van gegevens op in de buurt van LN2 temperatuur verder voorkomt uitdroging van het monster in de hoge vacuum van de microscoop en stralingsschade van de elektronenbundel.
De membraangebonden structuur van de FVIII berekenen de eerste cruciale stap is om homogene deeltjes (schroeflijnvormige segmenten) sets verkrijgen door toepassing 2D hand vrij indeling en combineren deeltjes uit klassen met dezelfde diameter en mate van ordening. De tweede belangrijke stap is om de juiste oorspronkelijke volume en spiraalvormige parameters (opkomst en zichthoek) voor de spiraalvormige reconstructie leggen. De derde en laatste cruciale stap is de helixstructuur gevalideerd door vergelijking van de 3D-kaarten verkregen door spiraalvormige en tomografie (zonder opgelegde symmetrie) reconstructies van hetzelfde monster.
De gepresenteerde methode is uniek in zijn vermogen om de functionele structuur van membraan-geassocieerde eiwitten nagenoeg de fysiologische omstandigheden oplossen. De LNT ontwikkeld in ons laboratorium kunnensucces gebruikt als een platform voor schroeflijnvormige ordening functionele membraangebonden bloedstollingsfactoren en tot betere resolutie dan voor FVIII georganiseerd membraangebonden 2D kristallen en als enkele deeltjes. Ons doel is het verder vergroten van de resolutie van onze spiraalvormige reconstructies door verbetering van de homogeniteit en de kwaliteit van het uiteindelijke deeltje sets. Het verzamelen van meer Cryo-EM microfoto bij beter Cryo-EM voorwaarden (Veldemissie pistool, energie filter, DE camera detectoren) van FVIII-LNT helixfilamenten en dus ook grotere initiële deeltje sets voor de 2D-reconstructie zal dit te bereiken. Verbetering van de FVIII-LNT spiraalvormige montage en 3D reconstructie algoritmen zal ons toelaten om sub-nanometer en in de buurt van atomaire resolutie, die ondubbelzinnig de membraan-gebonden organisatie van deze kritiek voor de bloedstolling eiwit zal bepalen verkrijgen.
Organiseren spiraalvormig homologe FVIII vormen geeft ons ook de kansenty te karakteriseren hoe verschil in sequentie kan correleren met verschillen in structuur en functie. Het oplossen van de mens en varken FVIII membraangebonden structuren van de in dit artikel beschreven methoden kunnen helpen bij het identificeren van de sequenties, die toen wijzigde de recombinant FVIII functie te verbeteren. Deze kennis zal belangrijke klinische implicaties voor drug discovery zowel trombose en hemostase velden in te hebben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financieel belang en ze kunnen direct worden benaderd over een van de gepubliceerd in dit manuscript procedures.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door een Nationaal Scientist Development subsidie van de American Heart Association: 10SDG3500034 en UTMB-NCB beginnen te SodM up fondsen. De auteurs erkennen de Cryo-EM en Scientific Computing faciliteiten op het Sealy Center for Structural Biology bij UTMB ( www.scsb.utmb.edu ), evenals Drs. Steve Ludtke en Ed Egelman voor hulp bij de 2D-en 3D spiraalvormige reconstructie algoritmen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| JEM2100 with LaB6 | JEOL Ltd. | JEM-2100 | operated at 200 kV |
| with TEMCON software | JEOL Ltd. | ||
| Gatan626 Cryo-holder | Gatan, Inc. | 626.DH | cooled to -175 °C |
| with temperature controler unit | Gatan, Inc. | ||
| Gatan 4K x 4K CCD camera | Gatan, Inc. | US4000 | 4,096 x 4,096 pixel at 15 μm/pixel physical resolution |
| Solarus Model 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. | ||
| Vitrobot Mark IV | FEI | ||
| Carbon coated 300-mesh 3 mm copper grid | Ted Pella | 01821 | plasma cleaned for 10 sec on high power |
| Quantifoil R2/2 300 mesh | Electron Microscopy Sciences | Q225-CR2 | Carbon coated 300-mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes |
| Uranyl acetate dihydrate | Ted Pella | 19481 | 1% solution, filtered |
| Galactosyl ceramide | Avanti Polar Lipids Inc. | 860546 | |
| Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids Inc. | 840035 | |
| EM software Digital Micrograph | Gatan, Inc. | http://www.gatan.com/DM/ | |
| EM software EMAN | free download | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/ | |
| EM software Spider | free download | http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | |
| EM software IHRSR | free download | Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/ | |
| EM software (IMOD) | free download | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | |
| EM software (SerialEM) | free download | ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/ | |
| UCSF-Chimera | free download | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html |
References
- Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 37, 3-13 (2004).
- Fujiyoshi, Y., Unwin, N. Electron crystallography of proteins in membranes. Current opinion in structural biology. 18, 587-592 (2008).
- Toole, J. J., et al. Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophilic factor. Nature. 312, 342-347 (1984).
- Fay, P. J. Factor VIII structure and function. International journal of hematology. 83, 103-108 (2006).
- Stoilova-McPhie, S., Lynch, G. C., Ludtke, S. J., Pettitt, B. M. Domain organization of membrane-bound factor VIII. Biopolymers. , (2013).
- Pipe, S. W. Hemophilia: new protein therapeutics. Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. American Society of Hematology. Education Program. 2010, 203-209 (2010).
- Gatti, L., Mannucci, P. M. Use of porcine factor VIII in the management of seventeen patients with factor VIII antibodies. Thrombosis and haemostasis. 51, 379-384 (1984).
- Parmenter, C. D., Cane, M. C., Zhang, R., Stoilova-McPhie, S. Cryo-electron microscopy of coagulation Factor VIII bound to lipid nanotubes. Biochemical and biophysical research communications. 366, 288-293 (2008).
- Parmenter, C. D., Stoilova-McPhie, S. Binding of recombinant human coagulation factor VIII to lipid nanotubes. FEBS letters. 582, 1657-1660 (2008).
- Wassermann, G. E., Olivera-Severo, D., Uberti, A. F., Carlini, C. R. Helicobacter pylori urease activates blood platelets through a lipoxygenase-mediated pathway. Journal of cellular and molecular medicine. 14, 2025-2034 (2010).
- Wilson-Kubalek, E. M., Chappie, J. S., Arthur, C. P. Helical crystallization of soluble and membrane binding proteins. Methods in enzymology. 481, 45-62 (2010).
- Egelman, E. H. Reconstruction of helical filaments and tubes. Methods in enzymology. 482, 167-183 (2010).
- Lusher, J. M. Development and introduction of recombinant factor VIII--a clinician's experience. Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 18, 483-486 (2012).
- Thim, L., et al. Purification and characterization of a new recombinant factor VIII (N8). Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 16, 349-359 (2010).
- Doering, C. B., Healey, J. F., Parker, E. T., Barrow, R. T., Lollar, P. High level expression of recombinant porcine coagulation factor VIII. The Journal of biological chemistry. 277, 38345-38349 (2002).
- Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of structural biology. 157, 38-46 (2007).
- Egelman, E. H. A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods. Ultramicroscopy. 85, 225-234 (2000).
- Egelman, E. H. The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers. Journal of structural biology. 157, 83-94 (2007).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of structural biology. 152, 36-51 (2005).
- Stoilova-McPhie, S., Villoutreix, B. O., Mertens, K., Kemball-Cook, G., Holzenburg, A. 3-Dimensional structure of membrane-bound coagulation factor VIII: modeling of the factor VIII heterodimer within a 3-dimensional density map derived by electron crystallography. Blood. 99, 1215-1223 (2002).
- Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of structural biology. 157, 281-287 (2007).
