私たちは、オピオイド誘発性痛覚過敏およびマウスにおける耐性の発生を調べるためのプロトコルを記述します。ナイーブおよびモルヒネで処置した動物の熱的および機械的な侵害刺激反応の測定に基づいて、疼痛感受性(痛覚過敏)の増加を定量化および慢性アヘン剤投与に関連した痛覚脱失(許容範囲)が減少することを可能にする。
オピオイド誘発性痛覚過敏と寛容深刻な動物およびヒトにおける鎮痛剤としてアヘンの臨床的有効性に影響を与える。両方の現象の根底にある分子機構はよく理解されておらず、その解明は動物モデルの研究から、適切な実験プロトコルの設計の恩恵を受けられるはずです。
ここでは、誘導記録し、野生型マウスに尾の浸漬とテール圧力テストを使用して、鎮痛耐性を証明するためだけでなく、モルヒネ誘発痛覚過敏を定量化するための方法論的なアプローチを説明します。ビデオに示すように、プロトコルは、5つの連続ステップに分割される。取扱いおよび馴化相の動物の基礎侵害受容応答を安全に決定を可能にする。両方の熱的、機械的感受性の増加によって示されるように、慢性モルヒネ投与は、かなりの痛覚過敏を誘発するのに対し、後の鎮痛タイムコースの比較急性またはREPeatedモルヒネ治療は明らかに鎮痛応答振幅の減少によって明らか耐性の発生を示している。このプロトコルは、同様に、痛覚及びモルヒネ鎮痛作用の調節における個々の遺伝子の役割を評価するために、遺伝的に改変されたマウスに適合させることができる。それはまた、アヘン鎮痛剤の有効性を改善するために潜在的治療薬の有効性を調べるためのモデル系を提供する。
オピオイド誘発性痛覚過敏(OIH)と鎮痛耐性動物とヒト1-3のアヘン剤の臨床的有効性を制限する。前炎症性4,5またはプロ侵害受容(抗オピオイド)6,7システムの関与は、現在の仮説を検討する。 OIHと寛容のメカニズムの解明は、適切な動物モデル、実験プロトコルおよび分子ツールを使用して、 インビボおよびインビトロのアプローチにおいての組み合わせを必要とする。
行動薬理学は、実験動物における鎮痛および痛覚過敏状態を監視し、定量化するための支配的なパラダイム(ラット、マウス)である。動物の便利な身体部位(後足、尾)に侵害刺激(熱的、機械的または化学的)の適用が容易で採点することができる侵害防御撤退につながる。
ここではOIHを誘導記録し、定量化するための方法論的なアプローチを提案し、野生型マウスにおける寛容、尾の浸漬及びテール圧力試験を用いて。手順は、マウスにおける熱的及び機械的侵害受容応答値の、容易に高感度で再現性のある測定を可能にする。ビデオプロトコルで示されているように、C57BL / 6マウスは、慢性モルヒネ投与後に有意な痛覚過敏を経験し、数日間、これを維持する。熱的及び機械的侵害受容の両方の値が有意にナイーブ動物に対するベースライン測定と比較して、低減される。また、当社の実験設備は、OIHの開発に加えて、モルヒネに対する鎮痛応答(寛容)の減少を監視することができます。提示されたデータは、これは文献1,10-12で争われているが、痛覚過敏と寛容は、8,9共通の細胞および分子機構を含むことができるという見解を支持している。最後に、このプロトコルは、同様に変調における個々の遺伝子の役割を評価するために、遺伝的に改変されたマウスに適応させることができる痛みのTiONから。それはまた、アヘン鎮痛効果を向上させるために潜在的治療薬の有効性を評価するためのモデル系を提供する。
重要なステップ
痛覚測定のための動物モデルの選択
マウス系統間の侵害受容および鎮痛感度のばらつきはモダリティ(熱的、化学的、機械的)、期間(急性、トニック、、(レビュー14〜16)、その病因が異なる様々な疼痛モデルを使用してレビュー(侵害受容性、炎症性、神経障害性)を検討されている慢性)および投与部位(皮膚、皮下、内臓)。他の株と比較した場合、彼らは高い基礎侵害受容感度17,18およびアヘン剤14,19に適度な鎮痛反応を示すように、C57BL/6Jマウス(ジャクソン研究所のための「J」)は、痛みの研究のための人気の動物モデルとなりました。慢性的なモルヒネ処置後、それらはまた、有意な鎮痛耐性20,21、21,22痛覚過敏および依存20,23を発症する。
NT ">ここでは、実験はC57BL/6Nタックマウスに対して実施したB6系統の独立したブランチに所属する(「Taconicsファームのタック」「国民健康研究所のための「N)。C57BL / 6マウスは長い間されているが交換可能であると考え、最近の研究では、C57BL/6JとC57BL/6N 24株の中の重要な動作の違いを指摘した。具体的には、熱、痛みを急性する(TAC 1を含む)の3 C57BL/6Nの亜の低い感度は、とみなすことができるこの表現型をテストするための利点がある。雄マウスは、若年男性25上で実行され、動物モデルとしてマウスを用いて、疼痛の研究の大部分として選択した。ビューの鎮痛または痛覚過敏の点から検討するとき我々の手で、彼らは堅牢で再現性のあるデータを提供した。時折、我々はC57BL/6Nの女性がTITとTPTテストの両方で、より変動応答を提供する傾向に気づいた。この観察は、かもしれないが雌のホルモン状態にリンクされ、自然の変化を反映して、痛みや鎮痛における性差の基礎となる全体的なメカニズムはまだ論争の問題のまま。この熱い議論のいくつかの側面を簡単にセクションの次の「技術の限界」で提示されます。
動物の馴化
マウスは、最初の1週間の間に動物施設に慣れることができました。他の任意の行動の研究と同様に、試験は3日馴化期間( 図1、ステップA)に従って実施した。侵害受容試験は、ストレスに敏感であるように、第一の対策は特に非馴化マウス26,27に、後続のものよりも長い待ち時間を与えることができる。馴化工程は、その日のうちに、より安定した侵害受容応答値の獲得を可能にし、日の間2〜4を示す 。侵害受容性および鎮痛に対するサーカディアン効果を減少させる感度28,29は 、全てのtestingsは午前10時と午後4時の間で行われた。
侵害受容性のテストの選択
侵害受容性のテストは、レビュー26,27,30(熱的、機械的、化学的または電気的刺激のいずれかを使用しています。異なる侵害受容モダリティが異なる侵害受容繊維18,31,32を通じて処理されることができるように彼らの選択が非常に重要です。
我々は、熱の例として、ランダルおよびセリット35から適応、尾部浸漬試験(TIT)33、D'のダムールおよびSmith 34によって開発された古典的なテイルフリック試験の修正バージョン、及びテール圧力試験(TPT)を選択し、マウスではモルヒネ誘発鎮痛、痛覚過敏と寛容を研究するための機械的様相。両方のテストは、広くラットで使用されている。カットオフ時間を体系的に組織損傷のリスクを回避または制限するために定義された。
モルヒネインダクタED鎮痛、痛覚過敏と寛容
それは強力な鎮痛およびOIH-誘導因子であるように、モルヒネ、プロトタイプのMU-アヘンアゴニストは、ヒトおよびマウス1,2,36の両方で、ここで選択した。モルヒネの鎮痛効力は、マウス系統、投与経路、および侵害受容様式に応じて変化することが知られている。 C57BL / 6マウスにおいて、信頼性の鎮痛は、通常、1〜20 mg / kgの用量範囲14,21内のモルヒネの皮下注射後に得られる。したがって、我々は、熱痛覚19,21から評価、そのED 50値(7月20日mg / kg)の近くに5 mg / kgで、モルヒネの単回投与(SC)後の急性鎮痛を勉強することにしました。
繰り返されるモルヒネ投与は、多くの場合、および痛覚過敏(痛みを伴うstimulに悪化感度(用量反応曲線の右方向へのシフトから、あるいは鎮痛応答振幅または持続時間の減少のいずれかから証明)鎮痛耐性を伴うi)は、基礎侵害受容価値の減少からも明らか。両方の不利な現象は治療期間におよび侵害受容モダリティ21にアヘン選択されている化合物およびその投与量の性質上、げっ歯類の系統に依存します。例えば、寛容と痛覚過敏を研究する実験的パラダイムが高く、定数(一日あたり20から40 mg / kg)を毎日投与することからなる22以上エスカレートするの(最大50あるいは200 mg / kg)の20,21モルヒネの投与量。 8日間にわたって、したがって、我々は日々のモルヒネ投与(SC 5 mg / kg)を通って、C57BL / 6マウスにおいて、痛覚過敏および耐性の発生を促進した。この適度なモルヒネ投与量は、より良い模倣診療所の使用に高いものよりも好まれた。
東工大運用ウィンドウのセットアップ
東工大で可能な落とし穴は、げっ歯類26,37の体温調節における尾の役割に関連している可能性があります。周囲温度がnociceptの重要な要因であるようにアイブ応答変動は、実験全体を通して38(ここでは21℃)で一定に保たれるべきである。熱強度は、通常は5から10秒27の中に侵害受容性応答を検出するように設定されている。短いものは、試験の差分電力を低減することができるのに対し、実際には、より大きな待ち時間は、侵害刺激とは無関係の動物の動きを監視するためのリスクを高めることができる。私たちは、48℃の一定温度TIT測定を実施し尾の引っ込め潜伏時間は9秒(基礎侵害受容値)に近く、25秒4秒(痛覚過敏)から変化させた(最大鎮痛;カットオフ)。実用的な理由に加えて、一定温度での侵害受容応答値の測定は、先験的ことにより、データの解釈を容易にする、侵害受容器および回路の同一のレパートリーを含むことができる。
可能な修正
鎮痛およびOIH measuremeため東工大運用ウィンドウの最適化NTS
鎮痛反応に着目すると、低いベースライン値(より高い熱強度)は応答遅れの検出に有利に働くことができる。次に、疼痛刺激の結果又はOIHの開発に対処するために、より高いベースライン値(より低い熱強度、ここで48°C)は図4より速い応答の検出を容易にすることができる。
モルヒネ誘発鎮痛、:私たちは5ミリグラム/堅牢な鎮痛応答図3を誘導し、(反復投与の際に)重要な痛覚過敏の図4を促進するための便利な投与量をキログラムでモルヒネを見つけたものの、(重要なステップの前に述べたように、その投与量は、適合させることができる痛覚過敏と寛容)。例えば、低用量、高用量は、痛覚過敏の発症を加速し、その振幅を増大させるように選択することができるのに対して(それによってカットオフ限界を回避する)鎮痛振幅を減少させるために使用されてもよい。
オベRALL、「侵害受容窓」の最適化が検討されたマウスの遺伝的背景に適応し、考慮に侵害受容器や回路の明確な配列の関与の可能性を取る必要があります。
代替アヘン作動薬(フェンタニル、レミフェンタニル)
最も臨床的に使用されるアヘンアゴニストとしては、μ-オピオイド受容体を標的とするが、それらはin vitroおよびin vivoの両方でそれらの薬理学的特性に関してかなり異なる。例えば、レミフェンタニルおよびフェンタニルは、モルヒネとは著しく対照的に、完全なアゴニストとして振る舞い、μ-オピオイド受容体39の内在化を推進しています。レミフェンタニルは数分41の超短半減期を有し、一方、モルヒネやフェンタニルなどの麻薬性鎮痛薬は、時間40の範囲で半減期を有する。ヒトでは、OIHのための最良の証拠は、短時間作用型Cを含む、手術中にアヘンを受けた患者からのものであるこのようなレミフェンタニル2,42などompounds。このように、フェンタニルとレミフェンタニルはTITとTPTパラダイムの下で、マウスでの痛覚過敏および耐性の発生を研究するためあまりに貴重なツールかもしれません。
OIHの誘導の代替モード(急性投与対慢性)
OIHは1,2非常に低いか、非常に高い用量であれ、アヘン剤の投与の結果として、人間と動物モデルで見られます。私たちは、モルヒネの中程度の用量でのマウスの慢性処置後のOIH開発にここに報告する。 C57BL/6Nマウスの処置の数日は明確で再現性の痛覚過敏状態の図4を証明する必要があった毎日のモルヒネの注射が適切に移植されたモルヒネペレットと置き換えることができる:それらの除去の際に、熱痛覚過敏および機械的異痛の両方が既にマウスにおいて報告されている43。微小浸透圧ポンプを通るアヘンの注入は別の可能性あり 44。げっ歯類では、長期的な痛覚過敏も達成可能人間手術36,45,46でこのμ-オピオイド作動薬の使用を模倣するプロトコルを使用してフェンタニルの急性投与に従っている。
技術の限界
痛みのための動物種とモデル
数々のマウス系統の比較研究は、4日間のモルヒネ治療22次の疼痛刺激17,31,47の侵害受容応答のとOIHレベルの大きな変動の証拠を提供した。動物モデル(マウスおよびラット)で痛みの処理および変調のメカニズムは、慢性疼痛患者に関連するかどうかは、基本的かつ開かれた質問のままです。このように、多くの注意が動物データの解釈にと人間16のための彼らの予測妥当性に留意する必要があります。
痛みと鎮痛における性差
ntent ">痛みのための動物モデルのほとんどの前臨床研究では、この選択バイアスにもかかわらず、新たなビューがオピオイドを開発するために麻薬性鎮痛薬49,50、少ない傾向へのよりよい応答として、男性を検討することであった。男性のげっ歯類16,25,48に行われているしかしながら、侵害受容および鎮痛薬の有効性に関する性差などで再開しない彼らの女性の対応(レビュー54)よりも誘発される痛覚過敏51,52とモルヒネ鎮痛53に対してより寛容はパラダイム'フリーサイズ'。実際、豊富なデータは、現在非常に多くの変数が、このようなオピオイド薬の有効性と選択性、侵害受容性分析、遺伝的背景、年齢、gonadoホルモン状態や社会的相互作用48,54など性差の大きさと方向に影響を与える可能性があることを示す。ヒトでは、臨床的な痛みを女性でより一般的ですが、この事実は、実際のセックスの違いを反映しているかどうか議論の48,55,56の問題のまま。Foをメタアナリシスは、女性57で有意に高いオピオイドの有効性を指摘した患者、制御されたサブジェクトに対して実行のに対してRたとえば、50の臨床試験のグローバルな分析は、男女間の鎮痛作用に有意差がないことを示した。著しくなっているものとは対照的である後者の観察を、げっ歯類で発見、再びこのような相違の16,48,55,57の原点に関するいくつかの問題を提起する。全体として、鎮痛における性差は存在しないとメリットがさらに根本的なメカニズムと臨床的意義に焦点を当てています。侵害受容性テストについて
尾の撤退テストは脊髄反射であるが、それは脊柱上の影響58を受ける可能性がある。東工大は、ラットに対して実行することは比較的容易であるが、マウスではより多くの専門知識が必要です。潜在的な難しさは、望ましくない応力を引き起こすことなく正しい姿勢でマウスを維持することである。提案されたプロトコルは、に応じて調整することができるコホートサイズ。 16匹(8コントロールと8治療)は簡単に限り、その基礎侵害受容応答値の測定などの管理されている(第一東工大を使用し、マウスの全シリーズのためのTPT)は懸念の下にあります。鎮痛時間経過のモニタリングは、付与の時間間隔(ここでは30分)以内に正確なタイムスケジュールの確立と(最初東工大、TPT)試験することができる動物の最大数を評価することが必要です。動物の全体のコホートは、このように実験者が運動の制限を尊重することができるようにサブグループに分割されてもよい。
オルタナティブ/既存の方法に関する技術の重要性
マウスに対するラットでOIH
ラットは広範囲に急性または慢性のアヘン政権46,59-61以下、オピオイド鎮痛、痛覚過敏と寛容を研究するために使用されてきた。実際に、いくつかの実用的な理由から、それらはより優れて考えることができる痛みの実験16,61のための動物モデルとしてのマウス。しかし、最近まで、遺伝子改変されたラットの世代は簡単手続きではなかった。数多くの遺伝子改変されたマウス系統がすでに利用可能であるように、我々のモデルは、マウスでのOIHと耐性発現の多数の個々の遺伝子の寄与を研究する機会を提供しています。
他の侵害受容性のテストと比較TITとTPT
東工大は、テールフリック試験の変形で、最も明らかな違いは、刺激の領域である。輻射熱とは対照的に、熱水への尾の浸漬は、その温度の迅速かつ均一な増加をもたらす。温痛覚試験(ホットプレートまたはハーグリーブス試験)の他の形態に比べて、乳を横切り、被験者の中に両方かなり再現性のある結果を提供します。
TPTはおそらく含ま機械的侵害受容26,27,35の研究のための非常に人気のあるテストですその後、明確な侵害受容性繊維と高分子トランスデューサTIT 32。それは、迅速かつ信頼性の高い測定59を提供しますが、実験者と大型動物のコホートからのいくつかの専門知識が必要です。本研究で使用した無痛覚の代替として、歪みゲージに頼る他の手順または装置は、(総説27)存在する。 TPTは、von Freyフィラメントは、通常、機械的異痛(レビュー27)を評価するものと解釈されるのに対し、機械的痛覚過敏を研究するために最も適しています。
このテクニックをマスターした後、将来のアプリケーションまたは方向
ここで提示した実験OIH /公差モデルは、同様に、疼痛の調節における個々の遺伝子の役割を評価するために、遺伝的に改変されたマウスに適合させることができる。それはまた、慢性の痛みを和らげるために潜在的治療薬の有効性を調べるためのモデル系を提供する。
The authors have nothing to disclose.
私たちは、先生JLに感謝します。 Galzi(UMR7242 CNRS、ストラスブール、フランス)彼のサポートのため。
この作品は、CNRS、INSERM、大学デストラスブール、アルザスバイオバレーとCONECTUSからの補助金によって、通信社ナショナル·デ·ラ·ルシェルシュ(ANR 08 EBIO 014.02)Conseilの地域ダルザス(Pharmadol)、欧州共同体Urbaineデストラスブール(Pharmadol)によってサポートされていましたICFRC(Pharmadol)、OSEO(Pharmadol)、方向ジェネラル·デ·Entreprises(Pharmadol)。
Name | Company | Catalog Number | Comments/description |
C57BL/6N Tac mice | Taconic, Ry, Denmark | C57BL/6N Tac B6-M | Male mice (25-30g) |
Morphine hydrochloride | Francopia, Paris, France | CAS n° 52-26-6 | Delivered with special authorization |
Syringes (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050000 | Polypropylene; Sterile; Volume : 1 ml |
Needles (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050101 | G26 ½ (Terumo reference : NN2613RO1) |
Mouse restrainer | Home-made | – | Two metallic grids (5x11cm) assembled with adhesive tape and staples. |
Thermostated water bath GR150 | Grant Instruments, Cambridge, UK | GP 0540003 | |
Analgesimeter | Panlab, Barcelona, Spain | LE 7306 | |
Kaleidagraph software | Synergy software, Reading, PA, USA | Kaleidagraph 4.03 | Scientific graphing |
STATview software | Free download; Statistics |