Summary
Nous décrivons un protocole pour examiner l'évolution de l'hyperalgésie et de tolérance chez les souris induite par les opioïdes. Sur la base de la mesure des réponses nociceptifs thermiques et mécaniques des animaux naïfs et traités par la morphine, il permet de quantifier l'augmentation de la sensibilité à la douleur (hyperalgie) et diminuer de l'analgésie (tolérance) associée à l'administration d'opiacés chronique.
Abstract
Hyperalgésie et la tolérance induite par les opioïdes un impact fortement l'efficacité clinique des opiacés analgésiques chez les animaux et les humains. Les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les deux phénomènes ne sont pas bien compris et leur élucidation devraient bénéficier de l'étude de modèles animaux et de la conception de protocoles expérimentaux appropriés.
Nous décrivons ici une approche méthodologique pour induire, d'enregistrement et de quantifier l'hyperalgésie induite par la morphine ainsi que pour mettre en évidence la tolérance analgésique, en utilisant les tests de pression queue d'immersion et de la queue chez les souris de type sauvage. Comme le montre la vidéo, le protocole est divisé en cinq étapes séquentielles. Manipulation et habituation phases permettent une détermination sûre de la réponse nociceptive de base des animaux. L'administration chronique de morphine induit l'hyperalgésie significative comme le montre une augmentation à la fois la sensibilité thermique et mécanique, alors que la comparaison de temps-cours analgésie après aiguë ou reptraitement morphinique eated indique clairement le développement de la tolérance manifestée par une diminution de l'amplitude de la réponse analgésique. Ce protocole peut être adapté de manière similaire à des souris génétiquement modifiées afin d'évaluer le rôle des gènes individuels dans la modulation de la nociception et l'analgésie morphine. Il fournit également un système modèle pour étudier l'efficacité des agents thérapeutiques potentiels pour améliorer l'efficacité analgésique opiacé.
Introduction
Hyperalgésie induite par les opioïdes (BSI) et la tolérance analgésique limitent l'efficacité clinique d'opiacés chez les animaux et les humains 1-3. La participation des pro-inflammatoire 4,5 ou de pro-nociceptives (anti-opioïde) 6,7 systèmes sont actuellement explorées hypothèses. L'élucidation des mécanismes sous-jacents BSI et la tolérance nécessite une combinaison in vivo et in vitro dans les approches, en utilisant des modèles animaux appropriés, des protocoles expérimentaux et des outils moléculaires.
Pharmacologie comportementale est le paradigme dominant de surveiller et quantifier les Etats analgésiques et hyperalgésiques des animaux de laboratoire (rats, souris). L'application d'un stimulus nociceptif (thermique, mécanique ou chimique) à une partie du corps commode (patte arrière, la queue) de l'animal conduit à un retrait nocifensive qui peut être facilement marqué.
Nous proposons ici une approche méthodologique pour induire, d'enregistrement et de quantifier BSI etla tolérance chez les souris de type sauvage, en utilisant les tests de pression queue d'immersion et de la queue. La procédure permet une détermination facile, sensible et reproductible des valeurs de réponse nociceptifs thermiques et mécaniques chez les souris. Comme démontré dans le protocole vidéo, souris C57BL / 6 hyperalgésie expérience significative après l'administration chronique de morphine et de maintenir ce pendant plusieurs jours. Les deux valeurs nociceptifs thermiques et mécaniques sont considérablement réduits par rapport aux mesures de référence sur les animaux naïfs. En outre, notre dispositif expérimental permet de contrôler, en plus de la mise au point de OIH, la baisse de la réponse analgésique de la morphine (tolérance). Les données présentées confirment que l'hyperalgésie et la tolérance peuvent impliquer des mécanismes cellulaires et moléculaires communs 8,9, bien que cela soit contesté dans la littérature 1,10-12. Enfin, ce protocole peut être adapté de manière similaire à des souris génétiquement modifiées afin d'évaluer le rôle des gènes individuels dans la modulationtion de la douleur. Elle fournit également un système modèle pour évaluer l'efficacité des agents thérapeutiques potentiels pour améliorer les effets analgésiques opiacés.
Protocol
Toutes les expériences ont été effectuées en stricte conformité avec les directives européennes pour le soin des animaux de laboratoire (directive du Conseil des Communautés 86/609/ECC européenne) et les directives éthiques concernant la recherche sur la douleur expérimentale chez des animaux conscients 13. Des souris mâles C57BL6 / N Tac (10 semaines, 25 - 30 g) ont été logés dans une animalerie institutionnel avec un personnel de soins en charge de l'exploitation de l'installation en conformité avec les normes environnementales. Les animaux ont été logés dans des groupes (maximum de cinq souris par cage) en vertu d'un 12 h / 12 h cycle lumière / obscurité à une température constante (21 ± 1 ° C) avec un accès libre à la nourriture et de l'eau. Toutes les expériences ont été réalisées à la même période de la journée (10h00-16h00) à l'aide d'une cohorte de 16 souris. Matériaux et équipements spécifiques sont indiqués dans le tableau des matériaux.
Une procédure en cinq étapes à suivre induite par la morphine-hyperalgésie et la tolérance
Le protocole estdivisé en cinq étapes séquentielles (AE) sur une durée de 15 jours à la figure 1.
. Une souris de manutention (étape A, D-7 à J-5)
- Manipuler la souris et habituer les d'entrer librement dans le dispositif de retenue. Cette étape préliminaire réduit le stress - minimisant ainsi toute confusion avec l'analgésie induite par le stress - et permet aux animaux d'être habitués à l'enquêteur, la manutention et la manipulation dans le dispositif de retenue de la souris. Chaque souris est délicatement manipulé pendant 5 minutes chaque jour.
. 2 réponse nociceptive basale (étape B; d-4 à D-1)
- Mesurer les latences queue de sevrage à l'aide du test de queue d'immersion (TIT):
- Réglez le thermostat à 48 ° C.
- Introduire doucement la souris dans le dispositif de retenue. Trempez les 2/3 extrémité saillante de sa queue dans le bain d'eau et démarrer le chronomètre.
- Arrêter le chronomètre dès que la souris retire sa queue de l'eau chaude et enregistrer le temps de latence (en secondes). En ee absence de réaction nociceptive, 25 sec de coupure est utilisé pour prévenir des dommages aux tissus.
- Remplacer la souris dans une cage et teste la suivante jusqu'à la fin de la série.
- Répéter les mesures de la réponse nociceptive deux fois de plus, la prise de mesures à partir des animaux dans le même ordre. La latence de la réponse nociceptive (sec) pour chaque souris est déterminé comme étant la valeur moyenne de trois déterminations successives.
- Mesurer les réponses mécaniques à l'aide du test de queue de pression (TPT)
- Introduire doucement la souris dans le dispositif de retenue et de positionner sa queue sous la pointe conique de la analgésimètre.
- Appuyez sur le commutateur au pied à exercer plus de pression uniformément sur la partie proximale de la queue jusqu'à ce que la première réaction nociceptive (mal, grincement) se produit. En ce moment, l'animal réagit, enregistrer la force actuelle (en grammes) qui provoque la réponse nociceptive. En l'absence de toute réaction, une valeur de coupure de 600 g est utilisé pour éviter témettre des dommages.
- Répéter cette mesure sur les parties médianes et distales de la queue de la même souris. Un intervalle d'au moins 30 secondes est observé entre les mesures sur une souris donnée pour éviter l'adaptation ou la partialité de stress. Remplacer la souris dans une cage et de tester l'animal suivant, jusqu'à la fin de la série (c'est à dire toutes les souris sont testées). La valeur nociceptive (grammes) pour chaque souris est prise comme la valeur moyenne de trois mesures (par exemple proximale, médiane et les pièces distales de la queue de chaque animal).
- Test nociceptif répétition (toutes les procédures décrites à l'étape 2) les jours suivants, d-3 à j-1.
. 3 Mesure de la morphine analgésie (étape C; d0)
- Définir la meilleure combinaison des animaux qui permet la sélection de deux groupes (n = 8 par groupe) de souris avec des valeurs moyennes nociceptifs stables et comparables, quel que soit la modalité nociceptif (TIT ou TPT) est considéré. Cette valeur est prise comme baseréponse nociceptive de référence pour les groupes «salines» et «Morphine» futurs.
- Mesurer le poids corporel de chaque animal.
- Préparer une solution de morphine (0,5 mg de morphine par ml) dans du sérum physiologique stérile (NaCl 0,9%) pour une administration sous-cutanée (5 mg de morphine par kg de poids corporel de l'animal).
- Mesurer le temps de latence de réponse nociceptive (pris comme point de temps 0) pour chaque souris des deux groupes «Morphine» dans le TIT (toutes les étapes sous 2.1 ci-dessus) «Saline» et. Puis mesurer la nociception dans la TPT (toutes les mesures sous 2.2 ci-dessus).
- Injecter de la morphine par voie sous cutanée (typiquement 0,25 ml d'une solution de morphine 0,5 mg / ml par 25 g de poids de souris) et une solution saline (0,25 ml par 25 g de poids de souris) à la «morphine» et «groupes salins ', respectivement.
- Mesurer les valeurs nociceptifs sur le TIT et TPT (toutes les procédures décrites ci-dessus sous les étapes 2.1 et 2.2, respectivement) sur une durée bien sûr (à 30 min intervanalgésie al) pour évaluer la morphine (5 mg / kg) induit par:
- Après 30 minutes après l'injection, mesurer la réponse nociceptive (détermination unique) pour chaque souris du groupe «Morphine» «Saline» et, à l'aide du TIT alors la TPT.
- Ensuite, mesurer les valeurs de réponse nociceptifs (de TIT et TPT) chez toutes les souris à des temps (en heures): 1-1.5-2-2.5-3 et 3,5 après l'injection.
4 Traitement morphine chronique - Morphine induite hyperalgésie. (Étape D; D1 à D6)
- Le jour: d1
- Mesurer les valeurs de la réponse nociceptive à la TIT et TPT tel que décrit ci-dessus (étapes 2.1 et 2.2). Annoter soigneusement latences de retrait et les limites de pression pour chaque animal.
- Préparer une solution de morphine frais comme indiqué dans l'étape 3.2.
- Des injections de morphine sous-cutanée (5 mg / kg de poids corporel) pour l'ensemble du groupe "Morphine" et du sérum physiologique (0,25 ml par 25 g de poids de la souris) pour le groupe «Saline». Soit ee animaux repos jusqu'au lendemain.
- Days: D2, D3, D4, D5 et D6 répéter les opérations décrites dans la section 4.1
. 5 Preuve de la tolérance analgésique (étape E; d7)
- Évaluer l'analgésie induite par la morphine selon le paradigme du temps bien sûr déjà indiqué dans la section 3.
6. Acquisition de données et analyse statistique
- Évaluation de la réponse basale nociceptifs valeurs (étape B)
- Calculer pour chaque jour (au cours de la d-4 à D-1 période) la moyenne ± SEM des valeurs (n = 8) pour les réponses nociceptives basales offerte à partir de TIT et TPT dans le groupe «Morphine» «Saline» et.
- Terrain valeurs moyennes nociceptifs basales en fonction du temps (jours) pour les deux groupes Figure 2.
- Analyse de la morphine analgésie temps-cours à Jours d0 (étape C) et d7 (étape E)
- Calculer, à chaque point de temps après la morphinel'injection, la moyenne ± SEM des valeurs (n = 8) pour les réponses nociceptives comme offerte à partir de TIT (en sec) et TPT (en g) dans chaque groupe.
- Terrain valeurs moyennes de réponse nociceptifs en fonction du temps pour la «Saline» et les groupes «Morphine» au jour 0 Figure 3 et le jour 7 Figure 5.
- Développement de morphine induite hyperalgésie (étape D)
- Calculer pour chaque jour (au cours de la période de traitement D0-D7) de la moyenne ± valeurs SEM (n = 8) pour les valeurs de réponse nociceptifs basales offerte à partir de TIT et TPT dans la «Saline-traité» et les groupes «de morphine-traité».
- Terrain valeurs moyennes de réponse nociceptifs basales en fonction du temps (jours) pour la «Saline-traité» et les groupes «de morphine-traité» Figure 4.
- La preuve de la tolérance analgésique (étapes C et E)
- Déterminer à partir de la morphine temps bien sûr experiment effectuée à d0 la figure 3, la valeur de temps (ou intervalle de temps) nécessaire à la morphine pour induire une réponse analgésique maximal.
- Prendre cette valeur (habituellement 30 min) en tant que le temps de référence pour estimer à d7 figure 5, la valeur de ligne de base de la nociception (groupe traité à la solution saline) et de la réponse analgésique réelle (groupe traité à la morphine) à la morphine aiguë.
- Valeurs prises nociceptifs au point de 30 minutes à partir d'expériences de temps de cours morphine réalisées à d0 et d7 pour les groupes salins-traitée et la morphine traité temps, sont présentés sous forme d'histogrammes Figure 6.
- Statistiques: Analyser les données en utilisant une voie ANOVA à mesures répétées. Les facteurs de variation étaient de traitement (entre les sujets) et l'heure (dans l'objet). Pour vérifier les différences séparément dans chaque groupe, analyse de variance à mesures répétées a été effectuée. Les comparaisons entre les deux groupes ont été réalisées en utilisant le test t non apparié ou le test t apparié lorsque cela est approprié.
- Le seuil de signification est fixé à p <0,05. Toutes les analyses statistiques sont effectuées en utilisant le logiciel STATVIEW.
Representative Results
Évaluation des valeurs basales nociceptifs de souris naïves (étape B)
TIT et TPT ont été appliqués séquentiellement à l'ensemble de la cohorte de souris (n = 16), fournissant des valeurs moyennes de réponses nociceptives. Meilleure combinaison des animaux a permis une définition a posteriori des deux groupes (n = 8) de souris, appelé Saline et de la morphine, qui affichent des valeurs nociceptifs similaires et stables basales Figure 2. L'équivalence des deux groupes est valable quel que soit le test nociceptif ( TIT: Figure 2A; TPT: figure 2B) qui a été choisi.
Temps bien sûr pour analgésie morphinique au jour 0 (étape C)
Morphine analgésie a été évaluée après une injection unique (sc) de morphine (5 mg / kg) chez des souris naïves en utilisant à la fois TIT figure 3A et la figure 3B TPT. Dans les deux essais, les analyses statistiques avec une façon de mesures répétées ANOVA REVEAl qu'il existe une interaction significative entre le traitement et le temps de TIT (F (7, 98) = 72, p <0,001) et TPT (F (7, 98) = 31, p <0,001). TIT et données TPT analyses utilisant ANOVA à mesures répétées indiquent qu'il n'y a pas d'effet de l'injection d'une solution saline (F (7, 49) = 0,49, p> 0,05) et F (7, 49) = 1,85, p> 0,05 respectivement pour TIT et TPT les tests), tandis que l'injection de morphine induit une forte analgésie chez la souris (F (7, 49) = 92,46, p <0,001) et F (7, 49) = 34,37, p <0,001, respectivement, pour les essais TIT et TPT). L'effet analgésique de la morphine maximale a été atteinte après 30 min dans TIT et après 60 min de TPT que par rapport aux témoins de sérum physiologique à injection (p <0,001, test t non apparié).
Administrations morphine répétées Induit hyperalgésie chez la souris (étape D)
Valeurs basales nociceptifs ont été mesurés tous les joursavant saline ou de la morphine administration (voir protocole). Comme le montre la figure 4, une fois par jour administrations de morphine sur une période de traitement de 6 jours induit une importante et abaissement progressif de la thermique (F (7, 56) = 11,6, p <0,001, ANOVA à mesures répétées; Figure 4A) et mécanique (F ( 7,56) = 15,55, p <0,001, mesures répétées ANOVA; figure 4B) valeurs basales nociceptifs. Hyperalgésie se développe rapidement comme il a commencé à être significative au jour 1 en TIT (p <0,01, test t apparié, par rapport aux témoins de solution saline injectée) et au jour 2 en TPT (p <0,05, test t apparié, par rapport à une solution saline contrôles à injection).
Temps bien sûr pour analgésie à la morphine lors de la Journée 7, après traitement chronique de morphine (étape E)
Au jour 7, les souris qui ont reçu de la morphine ou salines injections quotidiennes sur une période de 7 jours (J0 à J6) ont été examinés en TIT figure 5A et 5B TPT figure d'abord pour leurs valeurs basales nociceptives et pour leur réponse analgésique à la morphine aiguë (5 mg / kg, sc.). En accord avec le développement d'une hyperalgésie montre la figure 4, la valeur nociceptif de base (temps 0) de souris qui ont été traités de manière chronique avec de la morphine a été nettement inférieure à celle des souris témoins de solution saline injectée (p <0,001, test t non apparié). À la suite de la morphine aiguë, la réponse nociceptive du groupe de la morphine traitée chronique significativement augmentée, mais seulement légèrement supérieure à la valeur nociceptive basal des souris témoins de solution saline injectée mesurée à 30 min dans TIT et TPT (p <0,01 et p <0,05, t non apparié -test, respectivement) et à 60 min dans TIT (p <0,05; test t non apparié). De 2 heures après le traitement à la morphine jusqu'à la fin de l'expérience, les réponses nociceptives sont retournés à des valeurs inférieures à celles des souris témoins (p<0,001, test t non apparié).
Comparaison des réponses analgésique maximal de souris à la morphine avant (jour 0) et après traitement morphine chronique (Jour 7).
Les valeurs de seuil nociceptif présenté sur la figure 6 sont de TIT (A) et TPT (B) effectuées 30 minutes après l'injection de solution saline ou de la morphine, comme illustré sur les figures 3 (jour 0) et 5 (jour 7). Une forte diminution de la morphine analgésie a été observée chez la souris après un traitement chronique de morphine pendant 7 jours par rapport à leur réponse initiale de l'analgésie au jour 0 dans les deux tests nociceptifs (p <0,001 test t apparié). Ces données démontrent que la tolérance s'est développée dans la douleur des animaux hypersensibles.
Figure 1. Un pro en cinq étapesprocédure à suivre induite par la morphine-hyperalgésie et de tolérance. Le protocole est divisé en cinq étapes successives (AE) sur une durée totale de 15 jours.
. Figure 2 Définition des valeurs de base nociceptifs de réponse (étape B, D-4 à D-1). L'immersion de la queue (TIT) (A) et la queue pression (TPT) (B) les tests sont appliqués à l'ensemble de la série des animaux afin d'évaluer leurs valeurs basales nociceptifs. Par la suite, deux groupes de souris (n = 8), dénommé «Saline» et les groupes «Morphine», sont définis de sorte qu'ils présentent des valeurs moyennes nociceptifs stables et comparables, quelle que soit la modalité nociceptive qui est considéré.
Figure 3. Time-sûr pour la morphine analgésie au jour 0 (étape C) dans TIT (A) et TPT (B). La valeur de la réponse nociceptive basale de souris a été déterminée toutes les 30 min après la morphine seule (5 mg / kg, sc. ) ou injections de solution saline. Les données sont exprimées en tant que moyenne ± SEM, n = 8 souris par groupe. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, test t non apparié par rapport au groupe témoin.
. Figure 4 développement de l'hyperalgésie après administration répétée de morphine (étape D; d1 à d6). Nociceptive, la valeur basale de la souris a été déterminée par TIT (A) et TPT (B) une fois par jour avant la morphine (5 mg / kg,sc.) ou de l'administration de la solution saline. Les données sont exprimées comme des valeurs moyennes ± SEM, n = 8 souris par groupe. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 par le test t non apparié en comparaison avec le groupe témoin traité par la solution saline.
Figure 5. Time-sûr pour la morphine analgésie chez les souris traitées chronique de morphine au jour 7 (étape E) en TIT (A) et TPT (B). Souris qui ont été traités de manière chronique avec de la morphine (points noirs) ou une solution saline (triangles blancs) du jour 0 au jour 6, le jour 7 reçu une seule injection de morphine (5 mg / kg, sc.) ou une solution saline, respectivement. La réponse nociceptive des souris a été déterminée toutes les 30 min après l'injection de morphine ou d'une solution saline. Les données sont exprimées en tant que moyenne ± SEM, n = 8 souris par groupe. * P <0,05, ** P & #60; 0,01 par le test t non apparié en comparaison avec le groupe témoin traité par la solution saline. Les barres d'erreur qui ne dépassent pas la taille symboles sont cachés.
Figure 6. Comparaison des réponses analgésiques maximales de souris à la morphine (5 mg / kg, sc.) Avant (jour 0) et après traitement chronique de morphine (jour 7). Valeurs présentées ici sont celles des expériences représentées sur la figure 3 et la figure 5. valeurs nociceptifs ont été mesurés en utilisant TIT (A) et TPT (B) 30 min après l'injection de morphine ou d'une solution saline. Les données sont exprimées en tant que moyenne ± SEM, n = 8 souris par groupe. *** P <0,001 par un test t apparié.
Discussion
Étapes critiques
Choix du modèle animal pour des mesures de nociception
La variabilité de la sensibilité nociceptive et analgésique chez des souches de souris a été examiné (avis 14-16) avis en utilisant différents modèles de douleur différents dans leur étiologie (de nociceptifs, inflammatoire, neuropathique), la modalité (thermique, chimique, mécanique), la durée (aiguë, tonique, chronique) et le site d'administration (cutanée, sous-cutanée, viscérale). Par rapport à d'autres souches, C57BL/6J («J» pour Jackson Laboratory) souris est devenu un modèle animal populaire pour les études de la douleur car ils présentent une grande sensibilité nociceptive base 17,18 et une réponse analgésique modérée aux opiacés 14,19. Après le traitement chronique de morphine, ils développent également significative la tolérance analgésique 20,21, 21,22 et hyperalgésie dépendance 20,23.
nt "> Ici, les expériences ont été réalisées sur des souris C57BL/6N Tac (" N "pour l'Institut national de la santé et« Tac »pour Taconics ferme) qui appartiennent à une branche séparée de la lignée B6. Bien souris C57BL / 6 ont été longues considérés comme interchangeables, des études récentes ont souligné les différences de comportement significatives entre les souches C57BL/6J et C57BL/6N 24. En particulier, la faible sensibilité des trois sous-souches de C57BL/6N (y compris le Tac un) pour la douleur aiguë thermique peut être considéré comme un avantage pour tester ce phénotype.Les souris mâles ont été choisis comme la grande majorité des études sur la douleur, en utilisant des souris comme modèle animal, sont effectuées sur les jeunes mâles 25. Dans nos mains, ils ont fourni des données robuste et reproductible quand on l'examine du point de vue analgésie ou hyperalgésie. De temps en temps, nous avons remarqué une tendance chez les femmes C57BL/6N de fournir des réponses plus variables, à la fois dans le TIT et essais TPT. Bien que cette observation peutreflète les variations naturelles liées au statut hormonal des femmes, les mécanismes sous-jacents généraux différences entre les sexes dans la douleur et l'analgésie restent un sujet de controverse. Certains aspects de ce débat chaud seront brièvement présentées dans les prochaines «Limites de la technique" section.
habituation des animaux
Souris ont d'abord été autorisés à s'habituer à l'animalerie pendant une semaine. Comme pour tout autre étude comportementale, test a été effectué après une période de 3 jour d'acclimatation (Figure 1, étape A). Comme les tests nociceptifs sont sensibles au stress, premières mesures peuvent donner des temps de latence plus longues que les suivantes, en particulier chez les souris non-habitués 26,27. L'étape d'habituation permet également l'obtention de valeurs de réponses nociceptives plus stables au sein de la même journée et entre les jours Figures 2 et 4. Pour réduire les effets circadiens sur nociceptive et analgésiquesensibilité 28,29, tous les testings ont été menées 10h00-16h00.
Choix des essais nociceptifs
Des tests nociceptifs utilisent soit thermique, mécanique, des stimuli électriques (26,27,30 avis. Leur choix est essentiel que les différentes modalités nociceptifs peuvent être traitées par différents nocicepteurs et des fibres chimiques ou 18,31,32.
Nous avons choisi le test queue d'immersion (TIT) 33, une version modifiée de l'essai queue de film classique développé par D'amour et Smith 34, et le test de pression de queue (TPT), adapté de Randall et Selitto 35, à titre d'exemples de thermique et modalités mécaniques pour étudier l'analgésie induite par la morphine, l'hyperalgésie et de tolérance chez les souris. Les deux tests ont été largement utilisés chez les rats. Un temps coupée a été systématiquement défini pour éviter ou limiter le risque de dommages aux tissus.
Morphine-inductioned analgésie, l'hyperalgésie et de tolérance
La morphine, l'agoniste mu-opiacés prototype, a été choisi ici car il est un puissant analgésique et BSI-inducteur, à la fois chez les humains et les souris 1,2,36. Morphine puissance analgésique est connue pour varier avec des souches de souris, les voies d'administration et les modalités nociceptifs. En C57BL / 6, l'analgésie fiable est généralement obtenue après des injections sous-cutanées de morphine dans la gamme de dose 1-20 mg / kg 14,21. Par conséquent, nous avons choisi d'étudier l'analgésie aiguë après une seule administration (sc) de la morphine à 5 mg / kg, à proximité de l'ES 50 valeur (7-20 mg / kg) a évalué de nociception thermique 19,21.
Administration répétée de morphine est souvent accompagnée de la tolérance analgésique (en témoigne soit d'un déplacement vers la droite de la courbe dose-réponse ou d'une diminution de l'amplitude de la réponse analgésique ou la durée) et l'hyperalgésie (une sensibilité exacerbée à stimul douloureusei témoigne d'une diminution de la valeur basale nociceptive). Les deux phénomènes indésirables dépendent de souches de rongeurs, de la nature du composé opiacé, qui est choisi et son dosage, de la durée du traitement et sur les modalités nociceptifs 21. Par exemple, les paradigmes expérimentaux pour étudier la tolérance et de l'hyperalgésie consistent en une administration quotidienne d'une grande et constante (20 à 40 mg / kg par jour) 22 ou de l'escalade (jusqu'à 50 ou même 200 mg / kg) 20,21 doses de morphine. En conséquence, nous avons favorisé le développement de l'hyperalgésie et de tolérance chez des souris C57BL / 6 souris par l'administration de morphine par jour (5 mg / kg; sc) sur une période de 8 jours. Cette dose de morphine modérée a été préféré à ceux élevés à une meilleure utilisation de la clinique synoptique.
Mise en place de la fenêtre opérationnelle de TIT
Un piège possible dans TIT pourrait être liée au rôle de la queue dans la thermorégulation de rongeurs 26,37. Lorsque la température ambiante est un facteur clé dans nociceptive variations de réponse, elle doit être maintenue constante (ici à 21 ° C) tout au long des expériences 38. l'intensité de la chaleur est généralement mis en place pour détecter une réponse nociceptive dans 5 à 10 sec 27. En effet, plus les latences peuvent augmenter le risque pour la surveillance des mouvements d'animaux non liés à la stimulation nociceptive, tandis que les plus courtes peuvent réduire la puissance différentielle de l'essai. Nous avons effectué des mesures de TIT à une température fixe de 48 ° C. latences de retrait de la queue étaient près de 9 sec (valeur nociceptive basale) et varie de 4 sec (hyperalgésie) à 25 sec (analgésie maximale; coupé). En plus des raisons d'ordre pratique, la mesure des valeurs des réponses nociceptives, à une température déterminée peuvent impliquer a priori le même répertoire de nocicepteurs et des circuits, ce qui facilite l'interprétation des données.
Modifications possibles
Optimisation de la fenêtre opérationnelle de TIT pour l'analgésie et BSI MeasureMents
En se concentrant sur une réponse analgésique, de faibles valeurs de référence d'intensité plus élevée (de chaleur) peuvent favoriser la détection d'un retard dans la réponse. À son tour, à prendre la suite d'un stimulus douloureux ou le développement de BSI, des valeurs plus élevées de base (intensité de chaleur plus faible; ici 48 ° C) peut faciliter la détection des réponses plus rapides Figure 4.
Bien que nous avons trouvé morphine à 5 mg / kg une dose convenable pour induire une réponse analgésique solide Figure 3 et à promouvoir (lors de l'administration répétée) hyperalgésie significative la figure 4, la posologie peut être adaptée comme mentionné précédemment (étape critique: l'analgésie induite par la morphine, l'hyperalgésie et de tolérance). Par exemple, des doses plus faibles peuvent être utilisées pour réduire l'analgésie amplitude (ce qui évite les limitations de coupure), tandis que des doses plus élevées peuvent être choisis pour accélérer l'apparition d'hyperalgésie et d'augmenter son amplitude.
OveRall, l'optimisation de la «fenêtre nociceptive 'doit être adapté à l'arrière-plan génétique de la souris à l'étude et de prendre en compte la possibilité de la participation des réseaux distincts de nocicepteurs et des circuits.
Agonistes opiacés alternatifs (fentanyl, rémifentanyl)
Bien que les opiacés les plus utilisés cliniquement ciblent le récepteur mu-opioïde comme agonistes, ils diffèrent considérablement en ce qui concerne leurs propriétés pharmacologiques in vitro et in vivo. Par exemple, rémifentanyl et le fentanyl, en contraste marqué avec de la morphine, de se comporter comme des agonistes complets et de promouvoir l'internalisation des récepteurs mu-opioïdes 39. analgésiques opiacés tels que la morphine et le fentanyl ont des demi-vies de l'ordre de 40 heures, tandis que rémifentanyl a un ultra-courte demi-vie de quelques minutes 41. Chez l'homme, meilleure preuve de BSI est de patients qui ont reçu des opiacés pendant la chirurgie, y compris à action brève compounds tels que rémifentanyl 2,42. Ainsi, le fentanyl et rémifentanyl peuvent être des outils précieux aussi pour étudier le développement de l'hyperalgésie et de tolérance chez la souris, sous TIT et paradigmes TPT.
D'autres modes d'induction de BSI (chronique vs administration aiguë)
OIH est observée chez l'homme et des modèles animaux à la suite de l'administration d'opiacés, que ce soit à des doses très basses ou très élevées 1,2. Nous rapportons ici sur le développement de BSI après un traitement chronique de souris avec des doses modérées de morphine. Plusieurs jours de traitement de souris C57BL/6N étaient nécessaires pour prouver un état hyperalgique figure claire et reproductible 4 injections de morphine quotidiens pourraient être remplacés de manière adéquate avec des pastilles de morphine implantés:. Lors de leur enlèvement, les deux hyperalgésie thermique et l'allodynie mécanique ont déjà été signalés chez des souris 43. Infusion d'opiacés par une pompe micro-osmotique est une autre possibilité 44. Chez les rongeurs, l'hyperalgie de longue durée est également réalisable après administration aiguë de fentanyl en utilisant un protocole imitant l'utilisation de cet agoniste des récepteurs mu-opioïde pour la chirurgie humaine 36,45,46.
Limites de la technique
Les espèces animales et des modèles pour la douleur
Des études comparatives de nombreuses souches de souris ont fourni des preuves pour de grandes variations dans les réponses à des stimuli nociceptifs douloureux 17,31,47 et des niveaux BSI après le traitement de 4 jours morphine 22. Que mécanismes sous-jacents de traitement de la douleur et de la modulation dans des modèles animaux (souris et rats) sont pertinents pour les patients souffrant de douleur chronique reste une question fondamentale et ouvert. Ainsi, beaucoup de prudence devrait être accordée à l'interprétation des données sur les animaux et à leur validité prédictive pour l'homme 16.
Les différences de sexe dans la douleur et l'analgésie
ntent "> La plupart des études précliniques sur des modèles animaux de la douleur ont été menées sur les rongeurs mâles 16,25,48. Malgré ce biais de sélection, la vue émergente était d'examiner les hommes comme de meilleurs répondeurs au analgésiques opiacés 49,50, moins enclins à développer des opioïdes hyperalgésie 51,52 et plus tolérants à la morphine analgésie 53 que leurs homologues féminins (54) d'examen induite. Cependant, les différences de sexe en ce qui concerne la nociception et analgésiques efficacité ne reprennent pas dans ce "un one size fits all 'paradigme. effet, une foule de données indique maintenant que de nombreuses variables peuvent influencer l'ampleur et la direction des différences sexuelles comme opioïde l'efficacité des médicaments et de la sélectivité, essai nociceptif, fond génétique, l'âge, l'état de gonado-hormonal ou l'interaction sociale 48,54. Chez l'homme, la douleur clinique est plus fréquente chez les femmes, mais si ce fait reflète les différences de sexe réelles reste un sujet de débat 48,55,56. For exemple, une analyse globale de cinquante essais cliniques n'a révélé aucune différence significative dans les propriétés analgésiques entre les sexes alors que les méta-analyses effectuées sur des patients-sujets contrôlés souligné une une efficacité significativement supérieure aux opioïdes chez les femmes 57. Cette dernière observation, qui contraste nettement avec ce qui a été trouvée dans les rongeurs, soulève encore plusieurs questions quant à l'origine de telles divergences 16,48,55,57. Au total, les différences sexuelles dans l'analgésie existent et mérite se concentrent davantage sur les mécanismes sous-jacents et les implications cliniques.A propos des tests nociceptifs
Le test queue de retrait est un réflexe spinal, mais il peut être soumis à des influences supraspinales 58. TIT est relativement facile à réaliser sur des rats, mais nécessite plus de compétences chez les souris. Une difficulté potentielle est de maintenir la souris dans une posture correcte sans induire stress indésirables. Le protocole proposé peut être ajustée en fonction detaille de la cohorte. 16 animaux (8 contrôle et 8 traités) sont faciles à gérer autant que la mesure de leurs valeurs de réponse nociceptifs basales (utilisant TIT, alors TPT pour toute la série de souris) est en cours de préoccupation. Suivi des cours à temps analgésie nécessite la mise en place d'un calendrier précis et l'évaluation du nombre maximal d'animaux qui peuvent être testés (TIT d'abord, puis TPT) dans l'intervalle de temps impartie (ici 30 minutes). L'ensemble de la cohorte d'animaux peut ainsi être divisé en sous-groupes pour permettre à l'expérimentateur de respecter les limitations cinétiques.
Importance de la technique par rapport aux méthodes existantes / Autres
BSI chez le rat par rapport à la souris
Les rats ont été largement utilisés pour étudier l'analgésie opioïde, l'hyperalgésie et la tolérance, après l'administration d'opiacés aiguë ou chronique 46,59-61. En effet, pour plusieurs raisons pratiques, ils peuvent être considérés comme supérieurs ausouris comme un modèle animal pour des expériences de douleur 16,61. Cependant, jusqu'à récemment, la génération de rats génétiquement modifiés n'est pas une procédure simple. Comme souches de souris génétiquement modifiées nombreux sont déjà disponibles, notre modèle offre la possibilité d'étudier la contribution de nombreux gènes individuels dans BSI et le développement de la tolérance chez les souris.
TIT et TPT par rapport à d'autres tests nociceptifs
TIT est une variante du test de mouvement de la queue, la différence la plus évidente étant la zone de stimulation. Par contraste avec la chaleur rayonnante, l'immersion de la queue dans l'eau chaude mène à une augmentation rapide et uniforme de sa température. Comparé à d'autres formes de tests de nociception thermique (essais de plaque chaude ou Hargreaves), TIT donne des résultats assez reproductibles à la fois dans et entre les sujets.
TPT est un test très populaire pour l'étude de la nociception mécanique 26,27,35 qui implique probablementfibres nociceptives distinctes et transducteurs moléculaires alors TIT 32. Il fournit des mesures rapides et fiables 59 mais nécessite une certaine expertise de l'expérimentateur et de grandes cohortes d'animaux. Comme alternative à la analgésimètre utilisé dans la présente étude, d'autres procédures ou des appareils se fondant sur les jauges de contrainte existent (revue 27). TPT est le mieux adapté pour l'étude de l'hyperalgésie mécanique tandis que les filaments de von Frey sont généralement prises pour évaluer l'allodynie mécanique (révision 27).
Applications futurs ou s'y Après avoir maîtrisé cette technique
Le modèle OIH / de tolérance expérimentale, nous présentons ici peut être adapté de manière similaire à des souris génétiquement modifiées afin d'évaluer le rôle des gènes individuels dans la modulation de la douleur. Elle fournit également un système modèle pour étudier l'efficacité des agents thérapeutiques potentiels pour soulager la douleur chronique.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr JL. Galzi (UMR7242 CNRS; Illkirch, France) pour son soutien.
Ce travail a été soutenu par le CNRS, l'INSERM, l'Université de Strasbourg, Alsace BioValley et par des subventions de Conectus, Agence Nationale de la Recherche (ANR 08 EBIO 014,02) Conseil Régional d'Alsace (Pharmadol), Communauté Urbaine de Strasbourg (Pharmadol), ICFRC (Pharmadol), OSEO (Pharmadol), la Direction Générale des Entreprises (Pharmadol).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6N Tac mice | Taconic, Ry, Denmark | C57BL/6N Tac B6-M | Male mice (25-30 g) |
| Morphine hydrochloride | Francopia, Paris, France | CAS no. 52-26-6 | Delivered with special authorization |
| Syringes (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050000 | Polypropylene, sterile, volume: 1 ml |
| Needles (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050101 | 26 G ½ (Terumo reference : NN2613RO1) |
| Mouse restrainer | Home-made | Two metallic grids (5 x 11 cm) assembled with adhesive tape and staples | |
| Thermostated water bath GR150 | Grant Instruments, Cambridge, UK | GP 0540003 | |
| Analgesimeter | Panlab, Barcelona, Spain | LE 7306 | |
| Kaleidagraph software | Synergy software, Reading, PA, USA | Kaleidagraph 4.03 | Scientific graphing |
| STATview software | Free download, statistics |
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