Falten und Charakterisierung eines Bio-responsive Robot von DNA-Origami

Zusammenfassung

DNA-Origami ist eine leistungsfähige Methode zur Herstellung präziser nanoskaliger Objekte durch Programmierung der Selbstorganisation von DNA-Molekülen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Faltung eines bioresponsiven Roboters aus DNA-Origami, seine Aufreinigung und Negativfärbung für die transmissionselektronenmikroskopische Bildgebung (TEM).

Zusammenfassung

Die DNA-Nanoroboter ist eine hohle hexagonale Nanometereinrichtung, entworfen, um als Reaktion auf bestimmte Reize und Gegenwart Fracht innerhalb abgesondert zu öffnen. Beide Reize und Ladung kann nach spezifischen Bedürfnisse zugeschnitten werden. Hier beschreiben wir die DNA Nanoroboters Herstellungsprotokoll, wobei die Verwendung des DNA-Origamitechnik. Das Verfahren startet, indem man kurze einsträngige DNA von Klammern in einer Stammischung, der dann in Gegenwart eines Faltungspuffer zu einem langen, kreisförmigen, einsträngigen DNA-Gerüst aufgenommen. Ein Standard-Thermocycler so programmiert ist, allmählich gesenkt werden das Mischen der Reaktionstemperatur, um die Klammern zu Gerüstglühen, die die treibende Kraft hinter der Faltung des Nanoroboters ist erleichtern. Sobald die 60 h Faltungsreaktion vollständig ist, werden die überzähligen Klammern unter Verwendung einer Filterzentrifuge, gefolgt von Visualisierung über Agarose-Gelelektrophorese (AGE) verworfen. Schließlich wird erfolgreiche Herstellung des Nanoroboters durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) überprüft wird,mit der Verwendung von Uranyl-Formiat als negative Färbung.

Einleitung

Die Einsatzmöglichkeiten für Nukleinsäuren Nanotechnologie sind erstaunlich. Die Lenkbarkeit des Watson-Crick-Basenpaarung sowie die einfache und relativ kostengünstige großtechnische Synthese von maßgeschneiderten Oligos ² hat eine Explosion von Anwendungen ^{3 und} Forschung auf dem Gebiet der DNA-Nanotechnologie erzeugt. Strukturelle DNA Nanotechnologie, bezogen auf das immobile Seeman Kreuzung ^4,5 als grundlegender Baustein macht Verwendung von DNA als eine selbstorganisierende Elementareinheit für die Konstruktion von beliebigen Formen ^6-8.

Die jüngste Entwicklung der rüstet ^{DNA-Origami-9....}

Protokoll

1. Herstellung von Staples Pool Mixture

1. Sortieren lyophilisiert DNA Nanorobotik Heftklammern auf 96-Well-Platten, wie in Tabelle 1 aufgeführt (siehe Materialien) und zu normalisieren, um 10 nmol. Für eine detaillierte Beschreibung der Konstruktion und Architektur des DNA Nanoroboters siehe Ben-Ishay et al. ^{14 und} Douglas et al. ^15).
2. Rekonstituieren Stapel gut mit DNase / RNase-freies Reinstwasser auf eine Konzentration von 100 uM. Für Heftklammern bis 10 nmol normalisiert, auflösen mit 100 ul von ultrareinem Wasser.
3. Pool zusammen 20 ul jeder Klamm....

Ergebnisse

Repräsentative Ergebnisse sind in 2A gezeigt. Alle Spuren enthalten 1 & mgr; g Gesamt-DNA über Spektrophotometer (OD ₂₆₀₎ gemessen. Im Vergleich mit dem kreisförmigen Einzelstrang-DNA-Gerüst (Spur 2), sind Nanoroboter im Gel aufgrund ihrer höheren Molekulargewicht behindert, ist das Ergebnis von Klammern Hybridisierung an das Gerüst DNA (Spur 3 roter Pfeil). Das Gewicht Band mit niedrigem Molekular in Spur 3 stellt überschüssige Heftklammern, die nicht auf das Schafott DNA (grüner Pfeil) .......

Diskussion

Wir beschrieben die Herstellung, Reinigung und Visualisierung der DNA-Nanoroboter. Nach der Herstellung des hexagonalen Chassis der Vorrichtung wird die Funktion des Nanoroboters mit der einfachen Einführung spezifischer Ladung und Erfassen Stränge an den Roboter, die leicht zu finden ihre bestimmten Position aufgrund von Wasserstoffbrücken Komplementarität vorhanden einsträngigen Andockstellen ¹⁴ programmiert ^{, 15,22.}

Die beschriebenen Herstellungsprotokoll verwendet e.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DNase/RNase-freies destilliertes Wasser	Gibco	10977
M13mp18 ssDNA-Gerüst	NEB	N4040S
10x TAE	Gibco	15558-042
1 M MgCl2	Ambion	AM9530G
Amicon Ultra 0,5 ml Zentrifugalfilter 100K MWCO	Amicon	UFC510024
Agarose	Promega	V3125
TBE-Puffer	Promega	V4251
Ethidiumbromid 10  mg/ml Lösung	Sigma Aldrich	E1510
1 kb DNA-Marker	NEB	N3232S
Ladefarbstoff	NEB	B7021S
Uranylformiat	polysciences	24762
kohlenstoffbeschichtete TEM-Gitter	Wissenschaft Dienstleistungen	EFCF400-Cu-50
Thermal Cycler c1000 Touch	Bio-Rad
Glow Discharge K100X	Emitech
UV-Tisch Gel Doc EZ Imager	Bio-Rad
NanoDrop 2000c	Thermo Scientific
TEM FEI-G12	Tecnai