מתקפל ואפיון של רובוט ביו-תגובה מה- DNA אוריגמי
Summary
DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).
Abstract
Nanorobot DNA הוא מכשיר חלול משושה ננומטריים, שנועד לפתוח בתגובה לגירויים ספציפיים ובהווה מטען מוחרם בפנים. ניתן להתאים גירויים ומטען שני בהתאם לצרכים ספציפיים. כאן אנו מתארים את פרוטוקול ייצור nanorobot DNA, עם השימוש בטכניקת אוריגמי DNA. ההליך יוזם על ידי ערבוב סיכות DNA חד-גדיל קצרים לתערובת מניות אשר לאחר מכן הוסיפה לפיגום ארוך, עגול, אחד גדיל DNA בנוכחותו של חיץ מתקפל. Cycler תרמו סטנדרטי מתוכנת להוריד את טמפרטורת תגובת ערבוב בהדרגה כדי להקל על חישול סיכות ל- פיגום, שהוא הכוח המנחה מאחורי הקיפול של nanorobot. ברגע שהתגובה מתקפל 60 שעות שלמה, סיכות עודפות מבוטלים באמצעות מסנן צנטריפוגלי, ואחריו להדמיה באמצעות אלקטרופורזה agarose-ג'ל (גיל). לבסוף, ייצור מוצלח של nanorobot מאומת על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים הילוכים (TEM),עם השימוש בuranyl-formate ככתם שלילי.
Introduction
השימושים לננוטכנולוגיה חומצות גרעין הם מדהימים. נְהִילוּת של זיווג הבסיס ווטסון-קריק, כמו גם את הקלות והבעלות נמוכה היחסית של סינתזה בקנה מידה גדולה של oligos מחוייט 2 ניב פרץ של יישומים 3 ומחקר בתחום הננו-טכנולוגיה ה- DNA. המבנית DNA ננוטכנולוגיה, המבוססת על 4,5 צומת Seeman הנייחת כאבן בניין בסיסית עושה שימוש בדנ"א כיחידה יסודי הרכבה עצמית לבניית צורות שרירותיות 6-8.
הפיתוח האחרון של טכניקת אוריגמי 9 DNA הפיגומים מאפשר לבניית ננו-ארכיטקטורות 2D / 3D המורכבות 10-12 עם דיוק תת-ננומטר והוא מסלול יעיל לבניית אובייקטים פונקציונליים חדשים עם מורכבות גוברים וגיוון מדהים. תהליך הבנייה מבוסס על ה- DNA חד גדילי פיגום ארוך, בדרך כלל נגזר מgenom נגיפידואר, אשר יכול להיות מקופל באמצעות ההכלאה של מאות oligos DNA הגדיל הבודד הקצר כינה סיכות. הרזולוציה הגבוהה המבנית מתקבלת על ידי טכניקה זו היא התוצאה הישירה של הממדים הטבעיים של סליל הדנ"א הכפול, תוך שחזור של ייצור הוא התוצאה של התאמת רצפי מצרך יחיד גדיל הקצר כדי להקל על השלמת מימן מליטה המרבית השגה. עם השימוש של חישול בטמפרטורה איטי רמפה הנמוכה ביותר באנרגיה המיועדת, thermodynamically ננו-המבנה העדיף הוא הגיע בתשואות ונאמנות גבוהות. היישום קל של כללי עיצוב צומת בקוד מחשב אפשר הפיתוח של כלים CAD, כגון 13 caDNAno, שמאוד לפשט את המשימה של תכנון מבנים גדולים, מורכבים המכילים מאות צמתים מחוברות.
בעבר תאר את העיצוב של nanorobot DNA בעזרת כלי 14,15 caDNAno. כאן אנו מציגים את הייצור והדמיה, באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM), של nanorobot, nanodevice משושה החלול 3D, עם ממדים של 35 x 35 x 50 3 ננומטר, שנועדו לעבור שינוי קונפורמציה גדול בתגובה לגירויים שנקבעו מראש ומטען ספציפי נוכחי, כגון חלבונים או oligos חומצות גרעין, מוחרם בפנים. בעוד 12 תחנות טעינה זמינות בתוך המארז החלול, המספר האמיתי של מטען קשור שונה עם גודל מטען. מולקולות מטען נעות בין מולקולות DNA קטנות לאנזימים, נוגדנים ו5-10 חלקיקי זהב ננומטר. Cargocan או להיות אחיד או הטרוגנית, כך שכל nanorobot מכיל תערובת של מולקולות שונות. חישה מושגת באמצעות שני עיצוב שערי נעילת סליל כפול לחוש חלבונים, חומצות גרעין או כימיקלים אחרים, המבוססת גם על aptasensor עקירת 16,17 או גדיל DNA 18 טכנולוגיות. ההתפתחויות אחרונות בפרוטוקולי בחירת aptamer 19-21 לאפשר העיצוב של nanorobots להגיבלמגוון הולך וגדל של מולקולות ותאים מסוגים.
העבודה קודמת הראתה nanorobot נושא נוגדנים ספציפיים, אשר על הכריכה לאנטיגן שלה יכולה להעביר גם אות פורה לחלק הפנימי של סוגי תאים מסוימים באוכלוסיית תאים מעורבת 15 מעכבת או. תכונה מרגשת של ננו-התקנים אלה היא היכולת שלהם לבצע אפילו יותר משימות מורכבות ושליטה היגיון עם ההקדמה של תת nanorobot שונה באוכלוסייה אחת. לאחרונה הפגינו תת-סוגים ספציפיים של nanorobots ביצוע כמו גם רגולטורים חיוביים או שליליים, השליטה אוכלוסיית מפעיל המכילה מולקולת מטען פעילה 22.
הפרוטוקול המובא כאן מתאר את הייצור, טיהור והדמיה של nanorobot מגודר עם רצפי חיישן aptamer המחייבים באופן סלקטיבי לPDGF כדי להקל על פתיחת nanorobot 15,22. תהליך הייצור המתואר דומה לnתהליך ייצור anorobot תחילה מתואר על ידי דאגלס et al. 15 עם שינויים שמטרתה צמצום משך תהליך כולל, תוך הגדלת שיעורי התשואה וטיהור.
Protocol
Representative Results
Discussion
תארנו את הייצור, טיהור, ויזואליזציה של nanorobot DNA. בעקבות ייצור של מארז המשושה של המכשיר, הפונקציה של nanorobot מתוכנת עם ההקדמה הפשוטה של מטען ספציפי וגדילי חישה לרובוט שבקלות למצוא את המיקום המיועד שלהם עקב השלמת מימן מליטה עם אתרי עגינה אחת הגדיל זמין 14 , 15,22.
<p class="j…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות ס דאגלס לדיונים בעלי ערך רבים ועצות, וכל החברים של המעבדה באשל לדיונים מועילים ועבודה. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מהפקולטה למדעי חיים והמכון לננוטכנולוגיה והחומרים מתקדמים באוניברסיטת בר-אילן.
Materials
| DNase/RNase free distilled water | Gibco | 10977 |
| M13mp18 ssDNA scaffold | NEB | N4040S |
| 10x TAE | Gibco | 15558-042 |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter 100K MWCO | Amicon | UFC510024 |
| Agarose | Promega | V3125 |
| TBE buffer | Promega | V4251 |
| Ethidium bromide 10mg/ml solution | Sigma Aldrich | E1510 |
| 1 kb DNA marker | NEB | N3232S |
| Loading Dye | NEB | B7021S |
| uranyl formate | polysciences | 24762 |
| carbon-coated TEM grids | Science services | EFCF400-Cu-50 |
| Thermal Cycler c1000 Touch | Bio-Rad | |
| Glow Discharge K100X | Emitech | |
| UV table Gel Doc EZ Imager | Bio-Rad | |
| NanoDrop 2000c | Thermo Scientific | |
| TEM FEI-G12 | Tecnai |
References
- Watson, J. D., Crick, F. H. Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature. 171, 964-967 (1953).
- Kosuri, S., Church, G. M. Large-Scale de novo. DNA synthesis: technologies and applications. Nature Meth. 11 (5), 499-507 (2014).
- Pinheiro, A. V., Han, D., Shih, W. M., Yan, H. Challenges and opportunities for structural DNA nanotechnology. Nature Nanotech. 6 (12), 763-772 (2011).
- Seeman, N. C. Nucleic acid junctions and lattices. J Theor Biol. 99 (2), 237-247 (1982).
- Chen, J. H., Seeman, N. C. Synthesis from DNA of a molecule with the connectivity of a cube. Nature. 350 (6319), 631-633 (1991).
- Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).
- He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).
- Yin, P., Hariadi, R. F., Sahu, S., Choi, H. M. T., Park, S. H., Labean, T. H., Reif, J. H. Programming DNA tube circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
- Rothemund, P. W. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
- Douglas, S. M., et al. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
- Zhang, F., Nangreave, J., Liu, Y., Yan, H. Structural DNA nanotechnology: state of the art and future perspective. J Am Chem Soc. 136 (32), 11198-11211 (2014).
- Douglas, S. M., et al. Prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Res. 37 (15), 5001-5006 (2009).
- Ben-Ishay, E., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Designing a bio-responsive robot from DNA origami. J Vis Exp. (77), e50268 (2013).
- Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. Science. 335 (6070), 831-834 (2012).
- Tan, W., Donovan, M. J., Jiang, J. Aptamers from cell-based selection for bioanalytical applications. Chem Rev. 113 (4), 2842-2862 (2013).
- Xiang, D., et al. Nucleic Acid Aptamer-Guided Cancer Therapeutics and Diagnostics: The Next Generation of Cancer Medicine. Theranostics. 5 (1), 23-42 (2015).
- Zhang, D. Y., Seelig, G. Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions. Nat Chem. 3 (2), 103-113 (2011).
- Tang, Z., Parekh, P., Turner, P., Moyer, R. W., Tan, W. Generating aptamers for recognition of virus-infected cells. Clin Chem. 55 (4), 813-822 (2009).
- Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O’Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nature Prot. 5 (6), 1169-1185 (2010).
- McKeague, M., DeRosa, M. C. Challenges and Opportunities for Small Molecule Aptamer Development. J Nucleic Acids. 2012, (2012).
- Amir, Y., et al. Universal computing by DNA origami robots in a living animal. Nature Nanotech. 9 (5), 353-357 (2014).
- Castro, C. E., et al. A primer to scaffolded DNA origami. Nature Meth. 8 (3), 221-229 (2011).
- Sobczak, J. P., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid folding of DNA into nanoscale shapes at constant temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
- Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (47), 12735-12740 (2014).
- Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation. Nucleic Acids Res. 41 (2), (2012).
- Bai, X. C., Martin, T. G., Scheres, S. H., Dietz, H. Cryo-EM structure of a 3D DNA-origami object. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20012-20017 (2012).
