In vivo billeddannelse af Optic Nerve Fiber Integritet ved kontrast-forstærket MRI i mus

Summary

Denne video illustrerer en metode, ved hjælp af en klinisk 3 T scanner til kontrast-forstærkede MR scanning af det naive mus visuel projektion og til gentagne og langsgående in vivo studier af synsnerven degeneration er forbundet med akut synsnerven crush skade og kronisk synsnerven degeneration i knock-out mus (p50 ^KO).

Abstract

Det gnaver visuelle system omfatter retina-ganglieceller og deres axoner, der danner synsnerven at indtaste thalamiske og midthjernen centre, og postsynaptiske projektioner til den visuelle cortex. Baseret på sin særegne anatomiske struktur og praktisk tilgængelighed, er det blevet den foretrukne struktur for undersøgelser af neuronal overlevelse, axonal regeneration, og synaptisk plasticitet. Nylige fremskridt i MR-scanning har aktiveret in vivo visualisering af Retino-tectal del af denne fremskrivning ved hjælp af mangan medieret kontrast enhancement (MEMRI). Her præsenterer vi en MEMRI protokol til illustration af den visuelle projektion i mus, hvorved resolutioner (200 pm) ³ kan opnås ved hjælp af fælles 3 Tesla scannere. Vi viser, hvordan intravitreal injektion af en enkelt dosis på 15 nmol _MnCl2 fører til en mættet forbedring af det intakte fremspring inden for 24 timer. Med undtagelse af nethinden, indregnes ændringer i signal intensitet uafdent af sammenfaldende visuel stimulation eller fysiologisk aldring. Vi mener desuden anvende denne teknik til langsgående overvåge aksonal degeneration i respons på akut synsnerven skade, et paradigme, som Mn ^{2 +} transport helt anholdelser på læsion site. Omvendt aktiv Mn ^{2 +} transport er kvantitativt i forhold til levedygtighed, nummer og elektriske aktivitet i Axon fibre. For en sådan analyse, vi eksemplificere Mn ^{2 +} transport kinetik langs den visuelle vej i en transgen musemodel (NF-KB-p50 ^KO) viser spontan atrofi af sensoriske, herunder visuelle projektioner. I disse mus MEMRI indikerer, reduceret, men ikke forsinket Mn ^{2 +} transport i forhold til vildtype-mus, og dermed afslører tegn på strukturelle og / eller funktionelle svækkelser af NF-KB-mutationer.

Sammenfattende MEMRI bekvemt bro in vivo-analyser og efter slagtning histologi for characterizatipå nerve fiber integritet og aktivitet. Det er meget nyttigt for longitudinelle studier på axonal degeneration og regeneration, og undersøgelser af mutant mus for ægte eller inducerbare fænotyper.

Introduction

Baseret på sin gunstige neuro-anatomiske struktur gnaver visuelle system giver enestående muligheder for at vurdere farmakologiske forbindelser og deres evne til at mægle neuroprotection ¹ eller pro-regenererende effekter ^2,3. Desuden giver det undersøgelser af de funktionelle og neuro-anatomiske karakteristika af mus mutanter, som for nylig eksemplificeret for mus mangler den præsynaptiske stilladser protein Fagot ^4.. Desuden et bredt spektrum af supplerende værktøjer giver ekstra featuring af retinal ganglion celle (RGC) og RGC Axon-numre samt RGC aktivitet, f.eks, ved elektroretinografi og adfærdsmæssige test, samt bestemmelse af kortikale omrokeringer af optisk billeddannelse af iboende signaler. Den seneste tekniske udvikling i laser mikroskopi aktivere in situ visualisering af RGC regenerering af dyb væv fluorescens billeddannelse i hele mount eksemplarer af synsnerven (ON) og hjerne. I denne histologiCal tilgang, tetrahydrofuran baseret væv clearing i kombination med lys ark fluorescensmikroskopi tillader opløsning af enkelte fibre, genindtræde i deafferented ON og optisk tarmkanalen ^5.. Mens sådanne teknikker kan være overlegen i opløsning og bestemmelse af vækstmønstre, de ikke gør det muligt gentagne og langsgående analyser af individuelle vækst begivenheder, som er særligt ønskede at vurdere processen for langsigtede regenerering.

Kontrast-forstærket MRI har været ansat i den minimale invasive visualisering af Retino-tectal projektion i mus og rotter ^6,7. Dette kan opnås ved direkte intraokulært levering af paramagnetiske ioner (fx ^{Mn2 +)} til retinale celler. Som et calcium analog, er Mn ^{2 +} indarbejdet i RGC somata via spændingsafhængige calcium kanaler og aktivt transporteres langs axonale cytoskeleton af det intakte ON og optisk tarmkanalen. Mens det ophobes i hjernekerneraf visuel projektion, dvs laterale geniculate nucleus (LGN) og overlegen colliculus (SC), transsynaptisk formering ind i den primære visuelle cortex vises ubetydelig ^8,9, selv om det kan forekomme ^10,11. Under MR sekventering, paramagnetiske Mn ^{2 +} øger MR kontrast hovedsageligt ved at forkorte T ₁ spin-gitter afslapning tid ^12. Sådanne Mn ^{2 +} forstærket MRI (MEMRI) er blevet anvendt med succes i forskellige neuro-anatomiske og funktionelle studier af rotter, herunder vurdering af axonal regenerering og degeneration efter ON skade ^13,14, den præcise anatomiske kortlægning af Retino-tectal projektion ¹⁵ samt bestemmelse af axonale transport egenskaber efter farmakologisk behandling ^16. Nylige forbedringer i dosering, toksicitet og kinetik af neuronale Mn ^{2 +} optagelse og transport, samt forbedrede MR-protokoller har udvidet sin ansøgning til undersøgelser af transgenemus ⁹ ved hjælp af 3 Tesla scannere, der almindeligvis anvendes i klinisk praksis ^17..

Her præsenterer vi en MEMRI protokol egnet til langsgående in vivo billeddannelse af muse Retino-tectal projektion og eksemplificere dets anvendelighed ved at vurdere Mn ^{2 +} afhængig signal enhancement under naive og forskellige neurodegeneration forhold. Vores protokol lægger særlig vægt på erhvervelse MR data i et moderat 3 T magnetfelt, der generelt er mere tilgængeligt end dedikerede dyre scannere. I naive mus, vi illustrere, hvordan tarmkanalen-specifikke signal intensitet kan være væsentligt og reproducerbart blive forøget efter intravitreal (ivit) Mn ^{2 +} ansøgning. Kvantitativt, Mn ^{2 +} udbredelse langs den visuelle projektion sker uafhængigt af den normale aldringsproces (målt mellem 3 og 26 måneder gamle mus) og augmentation er refraktær over for visuel stimulation og tilpasning til mørket. I modsætning hertil, Mn 18 samt i nfkb1 knock-out mus (P50 ^KO), der lider af spontan apoptotisk RGC død og ON degeneration ^19.. Således i udvidelse til konventionel histologisk analyse, langsgående MEMRI analyse af de enkelte dyr muliggør profilering af unikke kinetik af neurodegenerative processer. Dette skulle vise sig nyttigt for undersøgelser af neurobeskyttelse og axonal regenerering er forbundet med farmakologiske eller genetiske indgreb.

Protocol

Alle animalske indgreb udføres i overensstemmelse med den europæiske konvention til Animal Care og brugen af forsøgsdyr og ARVO erklæring til brug af dyr i Ophthalmic og Vision Research. Alle forsøg er godkendt af den lokale etiske komité. Proceduren for ON skade i mus er beskrevet andetsteds ^9.

1.. Intravitreale Mangan Injection

1. Udfør Mn ^{2 +} indsprøjtning 24 timer forud for MR-scanning ved hjælp af en assistent. Bedøve dyrene ved intraperitoneal injektion af en 5% chloralhydrat opløsning (420-450 mg / kg legemsvægt i steril PBS). For yderligere aktuelt anæstesi, anvende en dråbe væske conjuncain (0,4% oxybuprocainhydrochlorid) til hornhinden før øjet punktering. At injicere 15 nmol Mn ^{2 +} pr øje udarbejde en 7,5 mM _MnCI2 løsning, fx ved at fortynde 1 L 1 M _MnCI2 stamopløsning i 132 LH _{2 <}/ Sub> O. Belastning 5 pi af den endelige løsning i en 5 pi Hamilton-sprøjte forbundet til et 34 G lille hub aftagelig kanyle (RN nål).
2. Når du starter med det højre øje, skal du placere musen venstre-sidet under et binokulært mikroskop og forsigtigt åbne og løse det højre øje mellem tommel-og pegefinger på din venstre hånd. Saml sprøjten med højre hånd og tage fat i nålen tæt på spidsen. For atraumatisk punktering af øjet pære, forsigtigt kanylen i glaslegeme ved infero-temporale omkreds ca 1 mm distalt for limbus, og derved skåne sclerale fartøjer.
3. Dernæst assistent langsomt gælder den samlede mængde af 2 pi samtidig med at kontrollere omfanget af Hamilton-sprøjte. Under denne procedure overvåge optimal nåleplacering under mikroskop og undgå punktering af linsen eller spild af væsken. Hold nålen statisk indsat yderligere 30 sek, derefter trække det langsomt for at minimere væskelækage fra injektionsstedet.
4. Under hele proceduren bør der udvises særlig forsigtighed for at undgå pres for øjet. Ligeledes undgå skrappe eller adskillige forsøg på at punktere øjet pære. Eftersom Mn ^{2 +} optagelse i rGCS og transport langs ON allerede mættet ved 15 nmol _MnCI2, dette minimerer signal variationer med lidt upræcise injektionsvolumener. For bilateral forbedring af det visuelle projektion signal, gentages proceduren for indsprøjtning for det venstre øje.
5. Anvend ofloxacin-indeholdende (3 mg / ml) øjendråber og panthenol-holdige salve én gang efter den procedure, for at forhindre øjeninfektioner og tørring af øjet. Retur musene til deres bure under normale boligforhold indtil starten af ​​MR-scanning.

2.. Animal Forberedelse til MR

1. Bedøve mus ved administration af en gasblanding 2% / 98% isofluran / oxygen. Monter musen på en mus holder i en næsten vandret, ikke snoet position. Insert det i MR-spole, som indstilles derefter inde i MR-skanner. Overvåg åndedræt og puls ved passende systemer. For tekniske detaljer, se Herrmann et al ^20.
2. Under MRI, levering anæstesi ved kontinuerlig indblæsning af en indledningsvis 1,5% / 98,5% isofluran / oxygen gasblanding via en fordamper forbundet til muse hoved indehaveren af ​​et integreret rør. Under scanningen justere deepness af anæstesi i henhold til de indspillede vitale parametre (dvs. tilstræbe en stabil respiration sats på omkring 40 vejrtrækninger per minut). Ved hjælp af en opvarmningsanordning holde kroppen overfladetemperatur stabil mellem 35 og 37 ° C, målt ved en termisk sensor placeret ved abdominalt på musen. For tekniske detaljer, se Herrmann et al ^17.
3. Efter scanningen, befri musen fra holderen og forsyne med ren ilt at fremskynde inddrivelsen fra anæstesi. Derudover holde kropstemperaturen stabil ved hjælp afet rødt lys varmekilde.

3.. MRI protokol

1. Protokollen er valideret for en 3 Tesla scanner forsynet med en dedikeret, SNR-effektive, små dyr spole (lineært polariseret Litz spole) med en effektiv synsfelt på 35 mm x 38 mm diameter. Betjen spole i sende-modtage-tilstand.
2. Med dyret i sin endelige holdning, justere tonerne og match af spolen ved hjælp af en frekvens analysator. Manuel justering af senderen referencespænding og mellemlægsskiver strømme for at optimere billedkvaliteten homogenitet og kvalitet.
3. Anskaf T ₁ vægtede 2D TSE billeder med en opløsning på 0,5 mm × 0,5 mm × 2 mm i sagittal og tværgående visning for planlægning. Brug af planlægning MR-scanninger, erhverve MEMR billeder i coronal retning måling drejet til at være parallel til dyrets hoved med fasekodning langs venstre rigtige retning. For at minimere erhvervelse tid bruge et rektangulært synsfelt justeret tilselve hovedet dimensioner. Ansæt en forkælet 3D FLASH sekvens (VIBE 3D) ved hjælp af følgende parametre: basismatrix 256, synsfelt 54 mm × 50,65 mm × 14,08 mm, ved hjælp af 93,8% rektangulært synsfelt i fase indkode retning, og 128 skiver 0,11 mm skivetykkelse med skive opløsning sat til 61%.
4. Aktiver i planen interpolation til at skabe endelige billeder med 512 × 480 × 128, hvilket giver en effektiv opløsning på 0,21 mm × 0,21 mm × 0,18 mm (0,1 mm × 0,1 mm × 0,09 mm interpoleret), ekkotid T _E = 6,51 msek repetitionstid T _R = 16 msek båndbredde = 160 Hz / px, flipvinkel = 22 °. Påfør to gennemsnit og tre gentagelser for at opnå en samlet erhvervelse (T _A) i cirka 30 minutter.

4.. MRI Dataanalyse

1. Analysere data ved hjælp af softwaren syngo fastView. For kvantitativ forbedring signal, skal du vælge definerede regioner of interesse i 2D plane MRI optagelser og bestemme signalintensiteter (SI) af den forbedrede struktur (SI _MEMRI), væv baggrund (SI _backgr), og standardafvigelsen af støj (SD _N). Hvor det er nødvendigt, bruge en mus hjerneatlas at lette neuro-anatomiske orientering for LGN og SC strukturer. Beregn kontrast-til-støj-forhold (CNR) ved hjælp af formlen:
2. CNR = (SI _MEMRI - SI _backgr) / SD _N
3. Kvantificere tre på hinanden følgende billeder til gennemsnitlig CNR beregning for hver prøve. I bilateralt injicerede dyr, analysere hver halvkugle uafhængigt.
4. For skildring af horisontale, koronale og sagittale billeder, beregne multiplanar rekonstruktioner fra den oprindelige 3D MRI datasæt. Disse behandlede billeder anbefales ikke til kvantitativ analyse. At skabe animerede 3D rekonstruktioner (maks. intensitet fremskrivninger mindsteimportpriserne) af Retino-Tectal projektion, skal du bruge en angiografi post-behandling software-modul.

5.. Mn ^{2 +} autometallografi (TIMM farvning)

1. For TIMM farvning af Mn ^{2 +} spores hjernens strukturer efter MEMRI, injicere en dosis på 15-150 nmol Mn ^{2 +} ivit 24 timer forud for billeddannelse.
2. Efter MR-scanning, perfuse dyrene med 30 ml iskold 0,325% _Na2S i PBS (pH 7,4). Dissekere retinae og fryse prøver i Frozen afsnit.
3. Skær sekventielle, Ækvatorial sektioner af 15 pm tykkelse på en cryotome.
4. Udfør TIMM farvning ²¹ i fravær af fiksativ og cryoprotection ifølge Angenstein et al ^22.

6.. Statistisk analyse

Udføre statistiske analyser ved hjælp af Student t-test for enlige sammenligninger, efterfulgt af post hoc ANOVA. Data er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse. Individuelle N numre ersærskilt for hvert forsøg. Resultater nå P ≤ 0,05 anses for statistisk signifikant (P ≤ 0,05, *, P ≤ 0,01, **, P ≤ 0,001, ***).

Representative Results

Evne denne billeddannelse teknik til præcist at vurdere den vitalitet og funktionaliteten af den visuelle projektion afhængig præcise anvendelse af en ugiftig Mn ^{2 +} dosering til glaslegeme og dets optagelse i rGCS. Denne store antagelse er testet i figur 1, hvor lag specifik ^{Mn2 +-optagelse} er påvist ved autometallografi (TIMM farvning) ^21. Retina snit blev analyseret ved 24 timer efter ivit anvendelse af enten 15 nmol eller 150 nmol ^{Mn2 +,} eller PBS som kontrol. På dette tidspunkt er de Mn ^{2 +} injicerede retinae viser maksimale forhøjelse signal i T ₁ vægtet MRI (N = 3; stiplede linjer), mens PBS-injicerede nethinden forbedres ikke i signal (N = 3; stiplet linie) (figur 1 , venstre panel). Bemærk hyperintensive forbedring signal i 150 nmol injiceret øje. I modsætning hertil nonenhanced områder i hjernen (skjult) viser lignende baggrund signalintensiteter for alle cold (grøn farve). Ivit Mn ^{2 +} ansøgning stiger samlet TIMM farvning især i RGC lag og nerve fiber lag (NFL) (figur 1, forstørrede mellemværker i midten panel), som bekræftes ved undersøgelse af individuelle RGC somata efter H & E co-mærkning (højre panel).

Til in vivo-billeddannelse af muse Retino-tectal projektion, er det vigtigt at vælge en speciel mus MEMRI protokol, hvor de operationelle parametre sammen med det udstyr, som illustreret i figur 2, er indrettet til at analysere mus i en 3 videnskabs-/teknologiområde. Anvende en sådan scanner setup, vores tidligere arbejde viste, at for CNS billedopløsning en rotte hoved spole er overlegen i forhold til en dedikeret mus hele kroppen spole ^17. At fastsætte den murine hovedet og ordentligt justere sin position inden rotte spole, bruger vi en vugge og en konisk rør med bid bar lavet af plastic, som begge er nedskaleret til at opfylde de kropsmålmus (figur 2A, B). Når billeder er erhvervet på en tværgående T ₁ vægtet matrix gennemføre 3D gradient ekko sekvenser, kan forventes generering af billeder af (200 pm) ^3. højopløselige inden 35 min erhvervelse tid. Vi anbefaler kraftigt den konstante overvågning af vitale funktioner under scanningen. Justering af anæstesi sammen med postimaging iltning og kropstemperatur kontrol markant accelererer opsving tid og garanterer overlevelsesrater på omkring 100%. Sådanne tekniske forholdsregler er afgørende for at sikre, at hele kohorten vil opretholde langsgående og gentagne MRI.

I alle forsøg, bør kun et ikke-toksisk ^{Mn2 +} dosis på 15 nmol anvendes til ivit anvendelse ^9, som er tilstrækkelig til tydeligt forbedre CNRS i nethinden, ON, og optik tarmkanalen op til den præsynaptiske intracerebral LGN og SC. CNR værdier bedst beregnes fra 200 um tykt tværgåendeskiver opnået fra originale MRI datasæt ved reslicing den oprindelige isotrope 3D volumen Figur 3A viser et eksempel på præcis CNR beslutsomhed til øget LGN, hvor tre regioner af interesse er valgt i hvert billede (1) signal-forstærket område (SI _MEMRI. ), (2) ikke-affin hjernevæv (SI _backgr), og (3) baggrundsstøj (SD _N). Den expectable rumlige signalforbedring kvantificeret langs hele en enkelt visuel projektion er vist i figur 3B. Bemærk den stærke gradvis forøgelse af forstærkning af signalet retinale sektioner langs dorsoventral plan, som topper ved synsnerven. Derudover bemærk manglen på et relevant transsynaptisk Mn ^{2 +} formering i kortikale lag under de anvendte eksperimentelle betingelser (signal dråbe i den visuelle cortex). Mindsteimportpriserne er meget illustrativt at visualisere 3D-positionering af Retino-tectal projektion i toto (Film 1). Accumulation af Mn ^{2 +} langs den visuelle projektion er bestemt af kinetikken af intracellulær optagelse i rGCS gennem spænding afhængige Ca ^{2 +} kanaler og sin hurtige axonal transport, såvel som af den relativt lav clearance fra målvævet ^13. Ifølge vores tidligere kinetiske undersøgelser kan Mn ^{2 +} afhængig signal enhancement opdages så tidligt som 6 timer efter injektion. Det yderligere toppe ved 24 timer og falder tilbage til baseline niveau inden for 120 timer efter injektion ^9. Derfor, for at opnå optimale resultater, MEMRI bør udføres 24 timer efter injektion, som udgør halvdelen af den voksende tid, der kræves for rotter ^13.

Efter at have skitseret princip for kontrast forbedring af den visuelle projektion af MEMRI, vi yderligere kommunikere de påvirkninger af to parametre - lysforhold og dyrs alder - der kan påvirke kvantitative målinger:

(1) For at teste feller stimulus-afhængig ophobning af Mn ^{2 +} i midthjernen centre blev mus holdt enten under lys-stimulerede betingelser opnået ved lommelygte eksponering af en defineret frekvens (5 Hz) og lysintensitet (3 W LED) eller i komplet mørke forud for scanningen og i løbet af 24 timer af ^{Mn2 +} eksponering. Kvantitativ analyse af CNR 24 timer efter ivit ^{Mn2 +-programmet} viser en betydelig stigning i signalintensiteten af mørk tilpasset retinae i forhold til lys-stimulerede betingelser (66.29 ± 3.07 vs 54.56 ± 3.08, P ≤ 0,05, N = 7 / 8, figur 3C). I betragtning af den gradient i signal forstærkeren mellem den perifere nethinden og synsnerven (se figur 3B), vi sikker på at altid analysere tilsvarende retinale sektioner inden for alle forsøgsgrupper. Billedanalyse langs ventrodorsal flyet afslørede, som forventet, at absolutte CNR-værdier er på vej ned i begge forhold. Vigtigere er det, reltive signal forskellen mellem mørke og lys tilpasset retinae forbliver vedvarende (data ikke vist). Men ekstraudstyr, signal i projektion områder af LGN (26,97 ± 1,78 vs 26,58 ± 1,05, P = 0,9, N = 7-2) og SC (25,09 ± 1,24 vs 26,81 ± 1,55, P = 0,4, N = 7 / 8) er umulig at skelne mellem lys og mørk condition miljøer (figur 3C). Denne analyse viser, at optagelse af Mn ^{2 +} i retinalag er følsomt over for lys, mens dens udbredelse langs Retino-tectal projektion og akkumulering i målområder ikke påvirkes af sammenfaldende visuel stimulation. Alternativt kan signalet følsomheden af ​​3 T scanner være under detektionsgrænsen for signal variation i LGN eller SC.

(2) For at undersøge konsekvenserne af dyrets alder på MEMRI relateret forøgelse af den visuelle projektion signal, analyserede vi mus mellem 3 og 26 måneder of alder. CNR værdier i LGN 3 måneder gamle mus (23,49 ± 1,36, N = 12) ikke afviger fra signalet intensitet målt i mus i alderen 7 måneder (23,90 ± 0,81, P = 0,79, N = 16) 13 måneder (23,35 ± 1,29, P = 0,94, N = 10) eller 26 måneder (25,10 ± 2,29, P = 0,53, N = 6; figur 3D). Ligeledes signal intensitet i SC er uændret mellem 3 måneder (19,01 ± 1,20) og 26 måneder (16,92 ± 2,18, P = 0,37, figur 3D). Selv om en lille stigning er tydeligt i CNR værdierne af 26 måneder gamle retinae (38,49 ± 3,25), er denne stigning ikke nå signifikans sammenlignet gennem alle grupper (P> 0,05). Disse eksperimenter viser, at forbedring signal i cerebrale målområder for den visuelle projektion er upåvirket af visuel stimulation og fysiologiske ældning.

Dernæst viser vi følsomheden af ​​MEMRI at opdage strukturelle ændringer of visuel projektion forårsaget af akut og kronisk axonopathy. For at udforske dette, blev en model af Wallerian degeneration induceret af traumatisk om skade ¹⁸ samt en dyremodel viser gammelklog, spontan degeneration af sensoriske fremskrivninger, herunder den visuelle vej ¹⁹ ansatte:

(1) Traumatisk axonopathy induceret af ON knuse skade forårsager brud på Axona fascicles. Derfor vil Retino-tectal transport af ^{Mn2 +} langs axonal cytoskeleton være helt og bæredygtigt blokeret, som visualiseret ved fuldstændigt tab af ^{Mn2 +} forstærket signal i LGN og SC analyseret én dag (ikke vist), en uge (figur 4A , stiplede linjer), og 4 uger (ikke vist) efter skaden. For klart at vise de neuroanatomiske og fortløbende MR funktioner i ON skade og at dissekere dem fra naive tilstand blev læsionen påført kun unilateralt. Dette resulterer i uændret Mn ^{2 +} transport på than styrer side i modsætning til sporstof afbrydelse på siden af ​​interventionen. Analyse af CNR værdier i deafferented områder bekræfter den fuldstændige mangel på signal enhancement (ikke vist). Dette forsøg viser endvidere, at MEMRI er yderst følsom detektering af placeringen og sværhedsgraden af en læsion site ved langsgående vurdering af signalintensiteten langs fremspringet før og efter skade (figur 4B). Mens signal intensitet langs ON før skaden konstant forbliver over baggrunden signal, er der en temporo-rumlig fald i signal intensitet til baggrundsniveauet en dag efter ON skade.

(2) Vores tidligere arbejde viste, at ^{Mn2 +} afhængig forbedring signal i LGN er reduceret i 10 måneder gammel mus mangler NF-KB-underenhed p50 målt 24 timer efter injektion ^9. Afsløring dette med en høj konsistens, vi overtog en samlet forringelse Retino-tectal Mn ^{2 +} transhavn, muligvis forårsaget af reduceret antal rGCS og relaterede ON neuropati i aldring p50 ^KO mus ^19. Alternativt kan den reducerede forstærkning af signalet være forbundet med en forsinket neuronal optagelse og formering af ^{Mn2 +} fra glaslegemet og langs patologiske projektion. Sidstnævnte mulighed kan udforskes ved at udføre gentagne MR-scanninger efter en enkelt anvendelse af 15 nmol Mn ^{2 +} og studere kinetik signal forbedring i nethinden og LGN på tidligt (8 og 24 timer) og sent (48 og 72 timer) tid point. I vildtype og P50 ^KO-mus, retinal signal enhancement topper ved 8 timer ved næsten identiske ekstraudstyr satser (43,52 ± 3,24 og 40,72 ± 2,79, P = 0,6, N = 3-6, figur 4C, til venstre). Mens signal ekstraudstyr fortsat høj i vilde typer ved 24 timer efter injektion, det falder i P50 ^KO-mus (43,38 ± 2,18 vs 32,89 ± 1,54, P ≤ 0,01, N = 5-8). Under senere faser (48 og 72 timer), signal enhancement falder i begge grupper (med konsekvent lavere CNR værdier i knock-out mus), hvilket udelukker en forsinket retinal Mn ^{2 +} optagelse og udbredelse i P50 ^KO mus. Tilsvarende resultater i LGN af P50 ^KO-mus bekræfter denne opfattelse. Selv CNR er betydeligt lavere på mellem 8 og 48 timer efter injektion (P ≤ 0,05, N = 5-9), kinetik signaldæmpning i p50 ^KO mus svarer til i vildtypemus (fig. 4C, højre). Således reducerede temporo-rumlige signal forbedring af Retino-tectal projektion er på grund af reduceret Axon tal stammer fra en begrænset RGC befolkning snarere end forringede transport kinetik. Vi foreslår MEMRI at være et værdifuldt redskab til at screene genetiske mus mutanter for projectional svækkelser i CNS.

indhold "fo: keep-together.within-side =" altid ">
Figur 1. TIMM farvning af ^{Mn2 +} optagelse i rGCS. Repræsentative varme-map billeder af _T1 vægtet MR (MRI T ₁₎ viser forstærkning af signalet af linsen og hele nethinden omkreds (stiplet linie) 24 timer efter ivit anvendelse af 15 nmol og hyper-intensive forstærkning af signalet efter anvendelse af 150 nmol ^{Mn2 +} (venstre). Varme farver repræsenterer højere signalværdier end kolde farver. Målestok: 1 mm. Mellemøsten / højre: Mn ^{2 +} optagelse af rGCS efter ivit injektion af _MnCI2 som påvist ved sølv udfældning hjælp TIMM farvning (sort farve). PBS-behandlede kontrol nethinden sektioner demonstrere temmelig svag farvning og diffus differentiering af RGC lag (RGC) (top, N = 3). Stor forstørrelse ikke tillader d. diskrimination øger af de enkelte celler (forstørrede mellemværker) Ivit _MnCI2 ansøgning differentielt øger den samlede sølvfarvning tværs retinale lag med en fremtrædende sølv nedbør især i nerve fiber lag (NFL), RGC lag og inderste nukleare lag (INL, midten og bunden , forstørrede insets, N = 3). Colabeling af TIMM med H & E farvning yderligere bekræfter sådan lag specifik Mn ^{2 +} akkumulation (højre panel). Målestokken, oversigt: 50 pm, forstørrelse: 25 um. IPL, indre plexiform lag; OPL, ydre netformige lag; ONL ydre kernelag; RPE, retinal pigment epitel.

Figur 2.. Fotografier, der viser MRI-udstyr specielt til mus MEMR billede erhvervelse på et klinisk 3T scanner. A) viser specialfremstillet mus vugge med bite bar hoved fiksering og sensoren for respiratorisk overvågning (hvid pad, blå rør). B) viser den placeres og monteres i holderen. Rørene til venstre forsyningen bedøvelsesgas. C) eksemplificerer positionering af muse hoved og holderen inde i lineært polariseret Litz spole opererer i sende-og modtage-tilstand. D) viser spolen platform foran afskærmningen røret og kliniske 3 T scanner. Kobber coatede rør giver yderligere afskærmning fra støj og blokerer MRI signal fra det varme vand baseret varmemåtte (sort indpakning omkring rør). E) visualiserer komplette opsætning af dyret spole i pore af 3 T scanner blot forud for anbringelse af dyrehoved netop på isocenter inde i scanneren.

Figur 3.. MEMRI for den naive Retino-tectal fremskrivning under forskellige lys-og alderskrav. A) Illustration af region af interesse (ROI) kortlægning i et forstærket LGN og baggrund væv på et tværgående MRI optagelse (til venstre). LGN specifikt signal enhancement illustreres af zonekort præsentation (højre). 1 og 1 ', venstre og højre LGN; 2 og 2 ', baggrund væv; 3, støj; P, posterior; R højre. Skala bar:. 100 um B) Rumlig kortlægning af signal forstærkning langs en ​​enkelt Retino-tectal projektion som bestemt ud fra oprindeligt erhvervede tværgående MR billede skiver af MEMRI. Udfyldte kvadrater, Mn ^{2 +} afhængig signal enhancement; åbne trekanter, baggrund signal. R nethinden; ON, synsnerven; OT, optisk tarmkanalen; LGN, lateral geniculate kerne; SC, overlegen colliculus; VC, visuelle cortex. Snittykkelse, 200 um. C) Lys stimulation reducerer retinal forstærkning af signalet betydeligt. Enhancement i LGN og SC er uafhængig af visuel stimulation. Udfyldte cirkler, mørke tilpasning; åbne cirkler, lys tilpasning. D) Signal ekstraudstyr er uafhængig af stigende alder mellem 3 og 26 måneder.

Figur 4.. MEMRI af Retino-tectal fremskrivning under neurodegenerative forhold. A) MEMRI bilateralt ivit injicerede mus udført en uge efter ensidig crush skade af retten ON. Multiplanar rekonstruktioner af vandrette, koronale, og laterale synspunkter skildrer fuldstændigt fravær af signal forbedring i LGN og SC for den skadede hemisfære (stiplede linjer). c, kontralaterale halvkugle; i, ipsilaterale hemisfære. Skala bar:. 1 mm B) MIP billeder og langsgående MRI-analyse af den rumlige signalforbedring langs ON før ogen dag efter skaden. R nethinden; ON, synsnerven; pil, læsion site. Skala bar:.. 0.5 mm C) Kinetik af ekstraudstyr signal under kronisk neurodegeneration af den visuelle projektion i P50 ^KO-mus Tidligt (8 timer) optagelse af Mn ^{2 +} ind i retinal celler er ikke påvirket, men er allerede reduceret i LGN af p50 ^KO-mus. Gentagne MR-billeddannelse ved 24, 48 og (kun for nethinden) på 72 timer viser vedvarende reduktion signal, men lignende kinetik for ^{Mn2 +} transport og akkumulering i nethinden og LGN af p50 ^KO-mus.

Movie 1: Animated, 3D varme-map præsentation af in situ kontrast-forstærkede Retino-tectal fremskrivning MR scanning blev udført 24 timer efter bilateral ivit indsprøjtning på 15 nmol _MnCI2.. Data præsenteres i MIP-tilstand. Snittykkelse, 200 um. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51274/51274_Haenold_Movie1.mp4" target = "_blank"> Klik her for at se denne video.

Discussion

MEMRI af det visuelle system udvider konventionelle neurobiologiske teknikker til vurdering af funktionalitet under naive og patologiske tilstande. Bortset fra at levere et unikt indblik i integriteten af en isoleret CNS fiber-tarmkanalen, kan MEMRI let suppleres med adfærdsmæssige test, fx optometri og visuelt baserede vand opgaver, til at undersøge de umiddelbare konsekvenser af en given paradigme for visuel perception. Det forbinder også elektrofysiologiske og histologiske undersøgelser med funktionel visuel karakterisering in vivo. Teknikken er yderst pålidelig og reproducerbar med mindre interindividuelle forskelle i ens grupper (se fejlsøjler i figurerne 3, 4). Interessant i en dosis på 15 nmol, ^{Mn2 +} optagelse og axonal transport er mættet processer, således at forstærkning af signalet når et plateau, som ikke kan løftes med yderligere ^{Mn2 +} forsyning ^9. Fra et praktisk synspunktopfattelse vil en sådan dosis-respons karakteristiske minimerer det mindste til en vis grad injektion tilhørende variationer i signal ekstraudstyr. Bemærkes, at de præsenterede data om dosering og kinetik for ^{Mn2 +} signalforbedring er specifikke for mus og adskiller sig fra dem i rotter, der kræver cirka 10 20x højere Mn ^{2 +} dosering og forøget latens (36 timer) for at opnå optimal kontrastforbedring ^13,23. Derudover forbedring langs den visuelle projektion forbliver konsistent mellem et dyr 3 år og 26 måneder. Dette resultat er i overensstemmelse med visuelle test udført på aldrende mus og det faktum, at C57/B6 mus opretholde en normal visuel aktivitet op til 2 år ^24. Selv om vi ikke analysere individuelle mus på langs i den aldrende undersøgelsen, tidligere resultater viser tydeligt sikkerheden af gentagne administreret Mn ^{2 +} doser på 15 nmol for visuel vedligeholdelse ^9, hvilket kan være ønsket i langsgående aldring studier.

I overensstemmelse med den opfattelse, at ^{Mn2 +} er indarbejdet i rGCS, viser vi ^{Mn2 +} optagelse i deres somata af TIMM farvning, som er baseret på sølv udfældning af frie metalioner, som anvendes af Angenstein et al. For intracerebral ^{Mn2 +} detektion efter dets systemiske anvendelse ^22. Tidligere blev intracerebral ^{Mn2 +} fordeling detekteres ved autoradiografi af ⁵⁴ Mn ^{2 +} isotop at afgrænse neuronale kredsløb af rotte CNS ^25, men ikke på det cellulære niveau. Her TIMM farvning tillader tildelingen af Mn ^{2 +} optagelse til distinkte cellepopulationer inden den udsatte nethinden, hvor vi finder fremtrædende sølv nedbør i RGC og nerve fiber lag. Det skal bemærkes, at protokollen anvendt viser forbedret påvisning ved TIMM farvning efter anvendelse af en dosis på 150 nmol sammenlignet med 15 nmol ^{Mn2 +.} Selv om ^{Mn2 +} optagelse og axonal transport er allerede mættet ved 15 nmol dermed overdragelse ingen yderligere CNR stigning langs Retino-tectal projektion ved højere doser, kan overdreven tilskud øge tilgængeligheden af fri, protein ubundet Mn ^{2 +,} og dermed gøre den tilgængelig for sølv udfældning. Fremtidige forbedringer i farvning følsomhed vil tillade korrelationen af MEMRI-baserede CNR værdier af specifikke CNS fremskrivninger med den cellulære placering af Mn ^{2 +} berigelse inden for et defineret histologisk region. En sådan kapacitet kan også være nyttigt til karakterisering og kvantificering af Mn ^{2 +} distribution i andre CNS-regioner uden den visuelle projektion. Ligeledes har Mn ^{2 +} været ansat i en kainat toksicitet model til at visualisere degeneration og regenerering af hippocampus Mossy fibre ^26.

Mn ^{2 +} er taget op af spænding calciumkanaler og intracellulært distribueres af aktiv axonal transport, som CAn blive blokeret af colchicin behandling ^25,27. Visuel stimulation eksperimenter på rotter, der fik en intraperitoneal dosis af _MnCl2 har afsløret en øget forbedring signal i det indre og i særdeleshed ydre retina ^28. Derved mørk tilpasning yderligere øger signalintensiteter i de ydre retinal lag sammenlignet med rotter eksponeret kun plads lysforhold til, hvilket viser følsomheden af retinal Mn ^{2 +} optagelse til visuel stimulation ^28. Ligeledes finder vi øget signalintensitet i nethinden i mørke tilpasset mus sammenlignet med mus, der er udsat for visuel stimulation efter ivit ^{Mn2 +} ansøgning. Dette kan være relateret til de særlige elektrofysiologiske egenskaber af nethinden og frembringelse af en kontinuerlig mørk strøm i fotoreceptorceller. Da Ca ^{2 +} tilstrømning i ydre segmenter af fotoreceptorer bidrager væsentligt til oprettelsen af den mørke strøm, kan deres generation ledsagesved øget samarbejde optag af Mn ^{2 +} ind i fotoreceptorer cellelag under mørke. I modsætning hertil lyspåvirkning reducerer mørkestrømmen og forårsager hyperpolarisering af fotoreceptorceller ^29. Derved samlede ^{Mn2 +-optagelse} kan være formindsket under lysforhold.

For pålidelig brug af MEMRI, er det vigtigt at afklare, om den mere udtalt Mn ^{2 +} optagelse i mørke-tilpassede nethinden ændrer signal enhancement langs andre dele af den visuelle projektion eller endog hele sin udvidelse. Er blevet påvist Stimulation-afhængige ændringer i MEMRI signal intensitet af cerebrale net til akustiske system efter intraperitoneal Mn ^{2 +} ansøgning ^30. I denne undersøgelse af Yu et al. Blev rotter udsat for frekvenser variable støj før MR scanninger og _T1 vægtet forbedring af ringere colliculi signal blev efterfølgende undersøgt. Akustisk stimulering blev fundet at significantly øge MEMRI signalintensiteter i en tonotopic repræsentation, og dermed eksemplificerer fMRI-lignende karakter af aktiviteten-afhængige Mn ^{2 +} akkumulation ^30. I modsætning hertil, i vor eksperimentelle nedsat ^{Mn2 +} akkumulering i LGN og SC forekommer uafhængigt af visuel stimulation. Der kan dog opstå sådanne forskelle i sensoriske hjernen kortlægning forsøg fra den nederste magnetfelt og begrænset tærskel påvisning af vores 3 T scanner i sammenligning med højt felt 7 T scanner bruges af Yu et al ^30.

Til dato er det ikke kendt, i hvilket omfang biofysiske parametre påvirker anterograd axonal transport af Mn ^{2 +,} og hvordan MEMRI kan tjene som en indikator for elektrisk aktivitet. Ikke desto mindre fremgår det, at ^{Mn2 +-transmission} rGCS opstår, i det mindste delvist uafhængigt af lys specifik stimulering og elektrisk input fra bipolære celler. Alternativt nettoeffekten af ​​elektrisk activity i Retino-tectal projektion kan være et resultat af elektrisk stimulation af mørk-responsiv 'OFF-rGCS' og lys-responsive 'ON-rGCS'. En sådan fortolkning understøttes af den konstatering, at Mn ^{2 +} transport langs Retino-tectal fremskrivning ikke forringes musestammer med dårligt udsyn såsom CBA-mus, der bærer RD1 mutation af Pde6b genet forårsager nethindedegeneration ^11. I en kinetisk undersøgelse om vildtype seende og CBA mus var sammenlignelige transport satser observeret under den indledende tilstrømning fase (ved 2,5 timer efter injektion) og for den endelige forbedring signal (ved 24 timer) i LGN og SC ^11.

Tilsammen disse observationer støtter tanken om, at MEMRI, fx af det visuelle system som eksemplificeret her, repræsenterer en værdifuld foranstaltning til strukturel integritet og metabolisk stabilitet snarere end på elektrisk aktivitet. Praktisk, den tilsyneladende stabel uafhængighed signalforbedring i cerebral LGN og SC fra lys eksponering giver mulighed for robust håndtering og opstaldning af dyr uden særlig pleje om belysning. På den anden side, for MEMRI undersøgelser, der fokuserer på nethinden signal ekstraudstyr, er det nødvendigt at holde dyrene under stramt kontrollerede lysforhold før scanningen.

Blandt de fysiologiske parametre, der påvirker Mn ^{2 +} axonale transportpriser og efterfølgende MEMRI signal ekstraudstyr, kan stabiliteten af kropstemperaturen være af særlig betydning. Dette indikeres ved undersøgelser af intranasal Mn ^{2 +} til forbedring af primære olfaktoriske mål projektion i hjernen, hvor berigelse viste sig at være betydeligt formindsket mod en midlertidig reduktion af kropstemperaturen til 30 ° C i forhold til at signalere ekstraudstyr under normal kropstemperatur ^27. Derfor bør kropstemperatur overvåges og justeres før og under MR scanner ikke kun til pBeskytter dyrenes sundhed, men også til at normalisere fysiologiske parametre Mn ^{2 +} formering.

Da patofysiologiske ændringer og metaboliske nedskrivninger påvirker axonale transport effekten af Mn ^{2 +,} forbedring signal i projektion centre, f.eks LGN og SC, kan tjene som et mål for den strukturelle integritet og funktionelle aktivitet af denne vej. Her præsenterer vi to forskellige betingelser for ON degeneration og illustrerer, at Mn ^{2 +} formering og berigelse i thalamus og midthjernen centre varierer som en funktion af axonal integritet. Akut om skade resulterer i et samlet tab signal umiddelbart efter skaden, hvilket ikke komme inden for 4 uger på grund af mangel på relevant axonal regenerering, mens langsom axonal degeneration i p50 ^KO mutant afspejles af reducerede CNR værdier i LGN. På grund af muligheden for langsgående billeddannelse, kan denne anvendelse af MEMRI være værdifulde feller overvåge postlesional vækst svarene fra ON og give mulighed for undersøgelse af proregenerative genetiske eller farmakologiske interventioner til rGCS.

Derudover præsenterer vi MEMRI som en yderst følsom metode til påvisning af gradvise svækkelser i forstærkning af signalet, der er forbundet med kroniske axonal degeneration processer. Transskriptionsfaktoren NF-KB er involveret i neuronal vedligeholdelse og mus med deletion af p50-underenheden af NF-KB display aldersafhængig neuronale celletab og axonal degenerering inden for det visuelle system ^19. Ud over histologiske og elektron analyser mikroskopiske, MEMRI af Retino-tectal fremspring er i stand til at identificere fænotypiske ændringer i disse mus. Ved erhvervelse af seriel T ₁ vægtede MR-billeder efter ivit Mn ^{2 +} ansøgning, vi adskiller en samlet reduceret fra et enkelt forsinket Mn ^{2 +} transport langs den visuelle vej i disse p50KO-mus. Derved erhvervelse gentagne data ved MEMRI efter en enkelt Mn ^{2 +} program gør det muligt at definitionen af axonale transport kinetik og neurofysiologiske forandringer i den uvurderlige pulje af tilgængelige genmodificerede mus. I øjeblikket flere ændringer af MEMRI er under efterforskning sigter mod at gøre denne teknik sikkert for diagnostiske applikationer i mennesker. En lovende tilgang af høj klinisk relevans, som udgør et alternativ til ivit injektion, er levering af Mn ^{2 +} som øjendråber. Derved topikal administration af 1 M _MnCI2 gav en signifikant forbedring signal med 20% i SC, da billederne blev erhvervet på en 4,7 T dyr scanner ^31. Metoden var i stand til at opdage omfattende ON degeneration efter retinaiskæmi ^31, og koncentrationen anvendte viste sig sikker, når gentagne anvendes i månedlige intervaller ^32. I betragtning af den relativt høje neurotoksiciteten af ^{Mn2 +} fx til diagnosticering af multipel sklerose og andre neuropatier.

Sammenfattende vores undersøgelse viser, at MEMRI er en kraftfuld eksperimenterende tilgang til at studere Retino-tectal circuitries i mus, og dermed forlænge optometric opgaver for at vurdere funktionaliteten af ​​det visuelle system.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Manganese (II) chloride solution 1 M	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M1787	MEMRI contrast reagent
Conjuncain	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 7617666	0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 3820927	3 mg/ml ofloxacin
Ointment panthenol	Jenapharm, Jena, Germany	PZN 3524531
Chloral hydrate	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	C8383	420-450 mg/kg body weight
Hamilton syringe	Hamilton Company, Reno, NV, USA	7634-01	SYR 5 µl, 75 RN, no NDL
34 G needle (34/35/pst4/tapN)	Hamilton Company, Reno, NV, USA	207434/00	removable needle RN, 34 G, length 38.1 mm, point style 4
Binocular Stemi-2000	Zeiss, Oberkochen, Germany
3 T MRI scanner Magnetom TIM Trio	Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
Rat head coil	Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
Mouse holder			custom made
Red light lamp
Frozen section medium NEG-50	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	6502	tissue embedding for cryo-sections
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4·H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106346	for sulfide perfusion
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S·9H2O)	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	208043
Gum arabic	Roth, Arlesheim, Switzerland	4159	for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2)	Roth, Arlesheim, Switzerland	3586
Citric acid (C6H8O7)	Roth, Arlesheim, Switzerland	6490
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106448
Silver nitrate (AgNO3)	Roth, Arlesheim, Switzerland	7908