Summary
骨折治癒における骨前駆細胞機能の定量測定は、高分解能シリアルイメージング技術を必要とします。ここで、プロトコルは、画像を順次かつ骨折の修復過程における内因性の骨形成幹細胞/前駆細胞の移動、増殖および分化を定量化する生体顕微鏡と骨系統トラッキングを使用するために提供される。
Abstract
骨が継続的にオーバーになり、非常に再生損傷後です。骨形成幹/前駆細胞が存在して長いと仮定されているが、そのような細胞のインビボでの実証にごく最近達成された。ここで、内因性の骨形成幹/前駆細胞（OSPCs）および骨修復におけるそれらの子孫の役割を調査するためのインビボイメージング技法が提供される。モデルや頭蓋冠骨における誘導微小破壊の生体内イメージングをトレース骨系細胞を使用して、OSPCs直接の早期修復過程における重要なイベントが発生する損傷後最初の数日間に観察することができる。損傷部位を順次OSPCsが、怪我に移転数が増加し、骨形成骨芽細胞に分化することを明らかに画像化することができる。これらのメソッドは、骨の再生および修復のための幹細胞内因性および外因性の分子制御因子の役割を調査する手段を提供します。
Introduction
骨粗しょう症性骨折のリスクが高いにつながる変性骨疾患及び年齢関連骨量減少は、公衆衛生1における大きな課題となっている。骨の維持、骨形成性骨芽細胞と骨吸収破骨細胞によって制御される。骨形成細胞の欠陥は、年齢関連骨量減少および変性骨疾患2,3の主な原因である。大規模な研究は、骨折治癒の改善に焦点を当てているが、変形性骨疾患を治すと骨粗鬆症による骨折の弱点を逆に信頼性の高い医薬品の発見は重要な課題である。したがって、骨の再生および修復における骨形成細胞およびそれらの制御機構の源を研究する骨格再生を促進し、骨量減少疾患を逆転させる新規な洞察を提供する。
骨髄中の多能性間葉細胞の存在は、異なる可能性クローン原集団の同定に基づいて提案されている骨形成にiate、脂肪形成および軟骨形成の系統は、ex vivoで4。最近では、複数の研究は、骨格/間葉系幹細胞（SSCは/ MSCは）骨芽細胞の自然源であり、骨代謝回転、改造、及び骨折修復5,6のために重要であることを報告している。加えて、我々の系譜追跡研究では、成熟骨芽細胞が突然短い半減期（〜60日）があり、継続的に正常な恒常性と骨折修復の条件6の両方で彼らの幹細胞/前駆細胞によって補充されることを明らかにした。しかし、in vivoでの幹細胞のアイデンティティとどのような細胞が傷害やサプライ骨形成細胞を破砕するために反応は不明である。したがって、生理的状況下における内因性のSSC / MSCの遊走、増殖および分化を分析することができる方法を開発することが重要である。
骨折修復複合体の配列によって調節され、多細胞および動的なプロセスであるサイトカインおよび増殖因子7。骨折の研究のための最も一般的なアプローチは、長骨骨折を有する動物モデルを使用し、骨切片および免疫蛍光技法8-10によって骨を分析することである。この修復プロセスは、マイクロCT 11、近赤外蛍光12、および化学発光イメージング13を含む複数の画像化技術によってモニターすることができる。しかし、各技術は、一定の制限があり、in vivoでの細胞レベルでのSSC / MSC機能を監視する有効な方法がなかった。最近では、共焦点/二光子生体顕微鏡が開発され、動物14を生体内にあっても単細胞の解像度でそれらの骨髄微小環境のコンテキスト内で移植された癌細胞及び造血幹細胞を検出するために使用されている。系統トレース一連のモデルでこの技術を組み合わせることで、骨形成幹/前駆細胞が遺伝的に一過交流でマークすることができることを定義することができたミクソウイルス耐性-1（Mx1の ）プロモーターとMX1〜誘起前駆細胞のtivationは、時間の経過とともに成熟骨芽細胞の大部分を維持することができますが、成体マウス6に軟骨細胞の生成に関与しません。加えて、我々はMX1〜ラベルOSPCsが骨折治癒6で新しい骨芽細胞の大半を供給していることを明らかにした。
ここで、骨系統追跡モデルと生体顕微鏡を用いて、プロトコルは、骨折修復におけるMx1の+骨形成性幹/前駆細胞のin vivo動態を定義するために設けられている。このプロトコルは、骨折部位への骨形成幹/前駆細胞の移設と早期修復過程における骨前駆拡大の定量的な測定を追跡するために、順次画像を提供しています。このアプローチは、骨修復を改善するための治療候補の評価を含む複数のコンテキストで有用であり得る。
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Protocol
1。マウスおよびプレコンディショニング
注：すべてのマウスを無菌状態に維持し、すべてのプロトコルがマサチューセッツ総合病院の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認された。すべての手術は、オートクレーブし、滅菌装置を使用して、無菌条件下で行われるべきである。MX1〜Creを15、Rosa26遺伝子-のloxPワンストップのloxP-EYFP（ローザ-YFP）、およびRosa26遺伝子-のloxPワンストップのloxP-tdTomato（ローザ·トマト） であったジャクソン研究所から購入した。 オステオカルシン-GFPマウスはヘンリークローネンベルクによって提供された。 インビボで OSPC遊走および増殖の定量分析のために、Mx1の-Creリコンビナーゼ + ローザ-YFP +（単色レポーター）マウスを使用した。 オステオカルシン+成熟骨芽細胞への分化をより詳細に追跡のために、我々は使用三遺伝子MX1〜のCre +ローザ-トマト+ OCN-GFP +マウス。
- 生体内でMx1の+細胞を標識するために、無菌のPBS溶液中でポリイノシン-ポリシチジル酸（PIPC、2.5 mg / mlの）を調製し、10日間、腹腔内に一回、一日おきMX1〜のCre +レポーターマウスの20グラム、200μLを注入。
- Mx1の常駐+造血細胞を排除するために、9.5 Gyでの単回用量をマウスに照射する。照射の24時間後、移植野生型骨髄細胞（1×10 6細胞/マウス）を静脈内16。注意：MX1〜誘導性細胞は造血細胞および造血由来の破骨細胞が含まれるため、Mx1の+造血細胞の排除はMx1の+骨形成細胞の画像品質および定量を向上させます。
- 骨髄移植後に、ドナー骨髄細胞の正常な再増殖を達成するために、4〜6週間のために動物を監視する。
2。モー準備を使う
- IACUC承認の手順を使用して、ケタミン/キシラジン（100 mg / kgを、キシラジン12 mg / kg体重）を50μlの腹腔内注射によりマウスを麻酔。注：効果の持続時間は、ケタミン/キシラジンの追加用量で延長することができる。
- マウスが完全にTOE及び/または尾のピンチに反応しないことによって麻酔をされているかどうか。マウスを麻酔した場合（オプション）、テーピングによる鼻の上イソフルランガスマスクを固定します。動物が完全に鎮静されていることを確認するためにイソフルランのレベルを調整します。
- 電気トリマーや小さなハサミを使って頭髪をクリップ。髪の断片を除去し、70％アルコール綿で露出した皮膚を殺菌。角膜の脱水を防ぐために、涙のゲルを適用します。
3。微小破壊けが
- 動物が完全に鎮静されていることを確認した後、頭皮を開くために、単一の逆L字型の切り込みを入れる。簡単に言えば、第1の横切開（1cm未満）startiを作る別の耳に1耳からngの。 〜60°を回し、離れて鼻から〜2〜3ミリメートルまでの鼻に向かって切開し続けています。注：この切開は画像化される領域の上の瘢痕組織の形成を最小限に抑えます。
- ピンセットで両側に向かって引いて、皮膚のフラップを分離する。両方前頭骨や矢状および冠状縫合の交点が明確に公開されるべきである。
- すべての残留毛が除去されるまで滅菌PBSと滅菌ガーゼや綿棒で穏やかにワイピングでフラッシュすることにより開放面を清掃してください。
- 頭蓋冠上の微小破壊を生成するには、片手でマウスの頭と別の手で30 Gの針を保持します。穏やかな圧力で30 Gの針の先端を挿入し、運動をねじることによって矢状および冠状縫合の交差点の近くに左前頭骨上のマイクロ穿刺（<1ミリメートルの深さで巻か〜0.2ミリメートル径）を確認します。注意：これは、それによってbleediを最小限に抑え、脳内に侵入するの針を避けることが重要ですNGと組織の損傷。
- 大きな針（20または25 G）に切り替えて、針（〜0.5ミリメートル径）をひねってパンク穴を広げる。
- 対側前頭骨に対して二の穿刺を生成するために、ステップ3.3から3.5を繰り返します。
- 出血が止まるまでのPBS連続ドロップすることで、負傷したスポットを一掃。
注：骨折部位での出血は、適切な撮像を妨害し、瘢痕形成を誘導する。 - 乾燥を避けるために、頭蓋骨に滅菌生理食塩水または2％のメトセルの低下を適用する。注意：画像の鮮明さを軽減するであろう、頭蓋骨の表面を乾燥させないでください。これは、領域を覆うようにゲルまたは生理食塩水の十分な量を使用することが重要である。
4。生体内イメージング
- （任意）イメージングの前に、一部のマウスは、血管を可視化するために、血管色素を注射する。非標的Qtracker 705 80メートルで希釈した（50 mMのホウ酸緩衝液中の2μM溶液）20μlの眼窩注入PBSをL。試薬の無駄を最小限に抑えるためにインスリン注射器を使用してください。信号が十分明るくない場合は、追加の金額が必要になることがあります。
- スキャナの電源をオンにします。注：ポリゴンベースのレーザスキャナは、ビデオレート（毎秒30フレーム）での同時マルチチャネル画像取得を可能にする。ビデオレートスキャンは、生きている動物のイメージングのために非常に重要である。
- 多光子レーザー（：サファイアレーザフェムト秒チタン）をオンにします。 880 nmの波長を設定し、骨の第二高調波発生イメージング（440 nm）のための電力を調整。 GFP及びtdTomato励起用、491 nmおよび561 nmの固体レーザーをオンにします。
- （tdTomatoのために第二高調波発生のための435±20 nmのバンドパスフィルタ、GFPについて528±19 nmのバンドパスフィルタ、および590±20）各信号のPMT（光電子増倍管）検出器をオンにします（オプション） Qtracker 705の信号を検出するために638 nmのヘリウム - ネオンレーザーおよび695±27.5 nmのバンドパスフィルタを有するPMTを使用する。
- PLACXYZ軸電動顕微鏡ステージ上に動物をメール。 （これは、動物の損失のリスクを軽減）、体温を維持するために電気加熱パッドで最も快適な位置にマウスを保管してください。撮像中に動きを最小限に抑え、できるだけ水平に画像化された面積を維持するために、マウスを保持するためにテープを使用しています。
- 乾燥を避けるために、頭蓋骨に暖かい2％メチルセルロースゲルまたは生理食塩水の滴を適用する。撮像面にカバーガラスを置く。頭蓋冠をスキャンするために低倍率レンズ（0.9 NAの30倍の水浸対物レンズ）を使用します。
- XYZ軸コントローラを使用して、骨からのSHG信号を検出することにより、頭蓋冠の表面を見つけ、そのような矢状縫合および冠状縫合との交点として重要なランドマークの場所を特定する。画像を取得して、XYZ座標を記録します。
- SHGと蛍光シグナルを観察することにより、損傷の場所を検索し続けています。
- 損傷部位または領域Oするときfは関心が発見された、目的の細胞からのSHG及び蛍光シグナルを含有する最良焦点面の画像を取得する。 XYZ座標と画像の次のラウンドのための彼らの正確な位置を定義するための矢状や冠状縫合の交差点までの距離を保存します。
- 骨折傷害の3D細胞および骨の構造を収集するには、Zスタックによる記録画像 - 骨内膜骨表面から〜100μmの深さを持つ（25μmの間隔）。傷害の片側の撮像が終了した後、次の損傷部位用撮像処理を繰り返す。
5。ポスト操作手順
- 画像形成後、頭蓋骨からメチルセルロースゲルを除去するために滅菌生理食塩液で撮影部位をすすぐ。滅菌綿棒を使用して、表面上のトリプル抗生物質軟膏を少量を適用します。皮膚フラップをカバーし、外科用縫合で頭皮を再度閉じます。これは低刺激性の縫合糸（吸収性ポリグラクチンSUで行うことができますTURE）と5-0サイズの縫合針。注意：良い縫合技術は、瘢痕形成を最小限に抑えることができます。
- 0.05〜0.1 mg / kgのブプレノルフィンのIP注射したすべての動物を手術後48時間ごとに12時間の治療。彼らは十分な意識を取り戻すまで、暖かい回収室で動物を保管してください。 3〜5日後に、縫合糸を再び開き、骨折治癒中の細胞変化を追跡するために、生体内イメージングの手順を繰り返します。
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Representative Results
安定化長骨骨折モデルは、骨折の研究で親しまれてきた。しかしながら、長骨骨折または大きなモデルは、複数の組織損傷を引き起こし、従って、骨細胞機能の定量的測定には限界がある。我々は、針の穿孔（ 図1A-1C）で頭蓋冠前頭骨に最小侵襲性損傷（硬膜に最小限または全く浸潤1mm未満の直径）を開発した。この骨は、骨髄と平坦で薄い骨構造を有しているので、我々は（他の組織の干渉を受けることなく、損傷した骨、骨細胞、および脈管構造の明確なイメージングを可能にする、微小骨折のin vivoライブイメージングのための頭蓋冠前頭骨の上面図を選んだ図1C）。我々は、この微小破壊は、ミネラル沈着および新たな骨形成（データは示さず）、続いて軟質カルス形成を含む大きな骨折損傷の多くの特徴を再現することを観察した。
この方法は、骨折治癒中に、特定の骨形成細胞集団を追跡することができる場合"> Mx1の+骨形成幹前駆細胞の逐次in vivoイメージングを。我々は、次の試験を行った。これまで、我々はで三遺伝子Mx1/Tomato/Ocn-GFPデュアルレポーターマウスを開発しましたRosa26遺伝子-トマトレポーターおよびオステオカルシン-GFPマウス （ 図2A）とMX1〜Creマウスを交配6。このモデルの利点は、骨形成幹細胞/前駆細胞および成熟骨芽細胞の微分ラベルが割り当てられている。PIPC投与により、Mx1の+ OSPCsを特異的に標識されているトマト式で、成熟した骨芽細胞がMX1〜誘起OSPCsから分化し、一方ではトマトと、GFPを発現する。Mx1のからしかし、既存の骨芽細胞と成熟骨芽細胞非誘導前駆細胞（ 図2B）だけでは、GFPを発現している。照射と骨髄の交換の後、我々 GENERこれらのマウスの前頭骨に2微小破壊をated。私たちは、それぞれの骨折の領域は私達の30倍を目的に単一の視野で検出されたことを確認した。微小破壊のシーケンシャル3D-生体内イメージングは、2日目と5日目に、その拡大を骨折部位におけるトマト+ OSPCsの移転は認められなかった。全くまたは検出できないGFP +骨芽細胞は、この時点であった。 12日目に、破断面に近い骨芽のサブセットは、骨芽細胞の分化（トマト+ GFP +）を開始した。続いて、新たな骨芽細胞および骨新生（青、第二高調波発生によって分析）の蓄積は、骨形成前駆細胞の移動および増殖は骨折の治癒に関与する新たな骨芽細胞を供給するための主要なメカニズムであることを示す（ 図 21日目に明らかであった2C）。骨折修復における骨形成幹/前駆細胞の動態。TEへST本手法は、骨折治癒中の骨前駆番号の一貫性の定量的な出力を提供しているかどうか、我々は、単純な系譜追跡モデルとしてMx1/YFPマウスを使用し、初期の骨折修復にMx1の+ OSPCsを追跡した。 Mx1の+骨髄細胞は、野生型骨髄に置き換えた後、我々はMx1/YFPマウス頭蓋冠に6個の独立した微小破壊（2 /マウス）を生成した。 Mx1/YFP + OSPCsが損傷後14日間追跡したとき、我々は一貫して前駆細胞の数が少ないが、3日までに、損傷部位で検出されたことを観察した。番号が連続して10日目にピーク人口に達し、14日間（ 図3A）によって維持、7日目に増加した。我々は、YFPシグナル強度（ImageJのプログラムと画像処理と解析）を測定することにより骨芽数の動態を定量化した。我々は我々のアプローチ（ 図3B）の一貫性を示唆し、類似した出力と、この実験を繰り返した。
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マウスの（CS）冠状および矢状縫合（SS）とシーケンシャル生体内イメージングの交差点の近くにマウス前頭骨に微小破壊の図1。 インビボマウス頭蓋冠傷害のイメージング。（A）の模式図。（B）外科的露出怪我の前に頭蓋冠。生体内イメージングのためのマウス頭蓋冠に（C）代表微小破壊損傷。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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傷害部位でのOSPCsの図2。 インビボ追跡。（A）三遺伝子Mx1/Tomato/Ocn-GFPマウスの模式図。（B）はこの図では、/三遺伝子Mx1/Tomatoの損傷部位に現れる可能性の蛍光細胞集団を示しているOCN-GFPマウス。赤はトマトを表現Mx1の+ OSPCsを表しています。 。Mx1の+ OSPCsの前駆細胞（C）シーケンシャル生体内イメージング-黄色、緑色のは、既存の骨芽細胞（GFP +）またはMx1の非誘導性（Mx1の ）から新しい骨芽細胞を表しているのに対し、Mx1の+ OSPCsから分化成熟骨芽細胞（トマト+ GFP +）を表している傷害部位での骨芽細胞。 Mx1/Tomato/Ocn-GFPマウス頭蓋冠上の傷害に近いトマト+骨芽およびGFP +骨芽細胞は損傷直後（0日目）の後とtで画像化した彼は、損傷後の時間を示していた。矢印は、Mx1の+ OSPCs（黄色）に由来する骨芽細胞を示す。ブルー、ボーン。点線の円は全体（シングル）骨折部位を表している。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3。骨折治癒中にMX1〜誘起OSPCs一貫性のある定量的な測定（A）Mx1/YFPマウス頭蓋冠上の3つの独立した負傷者を順次損傷直後（0日目）の後および損傷後の示された時間で撮像した。（B）の定量Mx1の+骨形成幹細胞/前駆細胞の測定。 Mx1の+ OSPCの動態損傷部位での拡張は、ImageJを用いてYFPシグナル強度により測定した。グラフは、各実験における6怪我の平均は2つの独立した実験を示しています。青、骨;緑、Mx1の+骨形成幹細胞/前駆細胞;赤、血管系（Q-ドット）。スケールバーは100μmで、（A）である。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
骨格筋幹細胞の調節は、骨再生を達成するためのよりよい方法を定義するために非常に重要であり得る。細胞レベルで定量的かつ連続的なイメージングは、技術的に困難となっている。マウスの長期骨折モデルが広く使用され、生体力学的研究17に適してきたが、その深部組織の位置、不均一な破断サイズ、軟組織の損傷、および安定化固定具の適用は、順次生体内イメージングが限られている。ここで、共焦点/二光子生体顕微鏡およびマウス頭蓋冠骨折モデルの組み合わせにより、これらの制限を克服するための方法が提供される。骨形成幹細胞/前駆細胞系譜追跡したこのアプローチは、骨折修復における骨形成幹/前駆細胞のin vivoイメージング 、リアルタイムのためのその能力を実証している。
この方法における主要な技術的課題は、経時的に一貫して高品質の画像を得ることである。高品質のIM最大撮像深度と年齢は、蛍光レポーターおよび撮像領域の組織の状態の明るさに依存する。また、組織損傷および光退色を避けるために、レーザー露光を最小化する長期連続イメージングのために重要である。ビデオレートプラットフォームを使用して高速走査は、この目的のために有用である。単一の視野全体傷害をカバーできない場合は、領域は、骨折部位の大部分を覆うようにモンタージュ画像を撮影することによりマッピングすることができる。これは、Zスタックの品質および全体の撮像セッション中に取得した情報の量との間で妥協することが重要である。例えば、多くのスライス（ 例えば 1〜2μmのステップ）高精細のZスタックをさらに分析することが容易になります。しかしながら、それらは、レーザ誘起光退色度が高いにつながる長期レーザー露光を必要とする。
骨折損傷のin vivoイメージングシーケンシャルは、皮膚や骨表面の繰り返しの外科的開口部が必要となるので頭蓋冠の表面の線維性瘢痕形成は、深部組織イメージングを中断し、高いバックグラウンド蛍光をもたらし共通の問題です。熟練した縫合技術および最小の出血は、瘢痕形成を低減することが重要である。一般的には3〜5時間反復イメージングは、画像品質の有意な損失なしに達成することができる。
反復イメージング、骨折サイズおよび修復速度の一貫性の容易かつ正確な制御の可能性を考えると、この方法は、骨折治癒、骨粗しょう症、および骨格筋などの他の組織再生のための治療標的を試験するための合理的な手段を提供することができる。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
私たちは、原稿を読み取るためで公園に感謝します。この作品は、内容はもっぱら著者の責任であり、ないDPとCPLとDTSの国立衛生研究所の助成金を受賞番号K01AR061434と白血病リンパ腫協会フェローシップ賞（5127から09）の下でNIAMSによってサポートされていました必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Bionichepharma | 67457-001-10 | Vial size: 10 ml (50 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | |
| Buprenorphine Hl | BEDFORD LAB | NDC 55390-100-10 | Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg |
| DPBS, 1X | CORNING cellgro | 21-031-CV | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol) | Kendall WEBCOL | 5110 | |
| Fine Surgical Scissor | F.S.T | 14568-09 | |
| Extra fine Forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| VICRYL*Plus Suture | Ethicon | VCP490G | |
| Qtracker 705 non-targeted quantum dot | Invitrogen | Q21061 | |
| Methocel 2% | OmmiVision | ||
| pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid) | Sigma | P0913-50MG | 100 μl (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse |
| Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers | Spectra Physics | ||
| Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser | Cobolt AB | ||
| Radius-635 HeNe laser | Coherent |
References
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